經(jīng)工程改造以利用非常規(guī)的磷或硫源的微生物的制作方法
【專利說明】經(jīng)工程改造以利用非常規(guī)的磷或硫源的微生物
[0001]相關(guān)申請(qǐng) 本申請(qǐng)要求于2013年8月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/870,469的優(yōu)先權(quán)， 其通過引用結(jié)合到本文中。
[0002] 背景 在發(fā)酵工業(yè)中，通常配制細(xì)胞培養(yǎng)基以提供宿主細(xì)胞系生長(zhǎng)所必需的全部營(yíng)養(yǎng)素，且 特別強(qiáng)調(diào)滿足細(xì)胞系對(duì)碳、氮、磷、硫和其它主要營(yíng)養(yǎng)素的需求。一些細(xì)胞系需要另外的成 分，包括氨基酸、微量礦物質(zhì)和金屬，和復(fù)雜的生長(zhǎng)因子。這些營(yíng)養(yǎng)素的存在為選擇的生物 體(不幸的是，也為任何潛在的污染生物體)提供合適的生長(zhǎng)環(huán)境。在這種環(huán)境下，生產(chǎn)生物 體需要直接與細(xì)胞培養(yǎng)中的任何污染生物體競(jìng)爭(zhēng)。
[0003] 即使在強(qiáng)壯的宿主中，培養(yǎng)物的機(jī)會(huì)性感染和產(chǎn)品制備需求造成的代謝負(fù)擔(dān)的組 合是單一培養(yǎng)操作中的主要關(guān)注。工業(yè)穩(wěn)健性(robustness)通常被認(rèn)為是一種對(duì)宿主菌株 有特異性的多基因特性，因此難以在發(fā)育過程的后期可預(yù)見地經(jīng)工程改造到生物體內(nèi)。加 入選擇性生長(zhǎng)抑制劑，例如細(xì)菌抗生素，是一種用來創(chuàng)立對(duì)生長(zhǎng)抑制劑抵抗的宿主生物體 的較穩(wěn)健的發(fā)酵環(huán)境的方法。然而，抗生素的添加往往是不可取的或不可行的，且頻繁地導(dǎo) 致自發(fā)抗性污染。
[0004] 因此，存在對(duì)合理工程改造特性的需求，所述工程改造特性當(dāng)經(jīng)工程改造進(jìn)入宿 主生物體內(nèi)時(shí)，倉il立一種穩(wěn)健的單一培養(yǎng)發(fā)酵環(huán)境。
[0005] 發(fā)明簡(jiǎn)述 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基因工程改造的生物體，其中基因工程改造的生物體 已由包含本文公開的任一序列的核酸分子轉(zhuǎn)化。
[0006] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基因工程改造的生物體，其中基因工程改造的生 物體已被核酸分子轉(zhuǎn)化;所述核酸分子包含非天然基因；和所述非天然基因編碼選自以下 的非天然酶:NAD:亞磷酸氧化還原酶(亞磷酸脫氫酶）、甘油-3-磷酸脫氫酶（sn-甘油3-磷 酸：NAD( + )氧化還原酶，EC 1.1.1.8)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、有機(jī)磷酸降解酶、磷酸二酯 酶、磷脂酶、脫硫酶、二苯并噻吩-5,5-二氧化物單加氧酶、2-羥基聯(lián)苯-2-亞磺酸亞磺酰基 水解酶、二苯并噻吩單加氧酶和NADH-FMN氧化還原酶。
[0007] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括以下步驟 使任一種前述基因工程改造的生物體與底物接觸， 其中 底物包含含磷部分和非-含磷部分； 含磷部分包含約10%重量-約100%重量的量的式I-III的任一項(xiàng)的含磷化合物； 式I化合物是
其中，對(duì)于每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地， R 是-Η、烷基、-OH、-OR2、-SH 或-SR2; R1是-H或烷基； Y是〇或S; Y1是〇或S;和 R2是烷基； 式II化合物是 II
其中，對(duì)于每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地， R1是-H或烷基;和 Y1是〇或S; 式III化合物是
III 其中，對(duì)于每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地， R3是-H、-OH、-OR4、-SH、-SR4、鹵代、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基；和 R4是烷基或芳基； 與所述基因工程改造的生物體相同的物種的天然生物體不能代謝所述含磷化合物 (即，用作磷源）；和 所述基因工程改造的生物體將所述底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。
[0008]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括以下步驟 使任一種前述基因工程改造的生物體與底物接觸， 其中 底物包含含硫部分和非-含硫部分； 含硫部分包含約10%重量-約100%重量的量的式IV-XI的任一項(xiàng)的含硫化合物； 式IV化合物是
IV 其中，對(duì)于每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地， R5是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、鹵代、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、-S0 2H、-NHR7 或-NH-C(=0)-R7; R6是-Η、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、鹵代、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、-S0 2H、-NHR7 或-NH-C(=0)-R7jP R7是環(huán)烷基、烷基或芳基，或任何兩個(gè)R7結(jié)合在一起，形成5-或6-元環(huán)； 式V、式VI或式VII的化合物是
V VI VII 其中，對(duì)于每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地， R8是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、鹵代、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、-S〇2H、-NHR 7 或-NH-C(=0)-R7; R7是環(huán)烷基、烷基或芳基，或任何兩個(gè)R7結(jié)合在一起，形成5-或6-元環(huán)； 式VIII、式IX或式X的化合物是
VIII IX X 其中，對(duì)于每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地， R9是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、鹵代、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、-S〇2H、-NH2、-NHR 7 或-NH-C (=0) -R7; R7是環(huán)烷基、烷基或芳基，或任何兩個(gè)R7結(jié)合在一起，形成5-或6-元環(huán)； R1()是羥基烷基、R9或-(CH2) XR9;和 X是1、2、3或4; 式XI化合物是
XI 其中，對(duì)于每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地， R9是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、鹵代、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、-S0 2H、-順2、-NHR7 或-NH-C (=0) -R7;和 R7是環(huán)烷基、烷基或芳基，或任何兩個(gè)R7結(jié)合在一起，形成5-或6-元環(huán)； 與所述基因工程改造的生物體相同的物種的天然生物體不能代謝所述含硫化合物 (即，用作硫源）；和 所述基因工程改造的生物體將所述底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。
[0009] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由任一種前述方法制備的產(chǎn)物。
[0010] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包含可操作地連接于啟動(dòng)子的基因的重組載 體，其中所述基因編碼酶;和所述酶是NAD:亞磷酸氧化還原酶(亞磷酸脫氫酶）、甘油-3-磷 酸脫氫酶(sn-甘油3-磷酸：NAD( + )氧化還原酶，EC 1.1.1.8)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、有 機(jī)磷酸降解酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、脫硫酶、二苯并噻吩-5,5-二氧化物單加氧酶、2-羥基 聯(lián)苯-2-亞磺酸亞磺?；饷?、二苯并噻吩單加氧酶或NADH-FMN氧化還原酶。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述 圖1描述本發(fā)明的各個(gè)DNA序列。
[0012]圖2用表格列出本發(fā)明的各種生物體和示范性潛在應(yīng)用。
[0013]圖3用表格列出本發(fā)明的各種生物體和示范性潛在應(yīng)用。
[0014]圖4用表格列出可用作本發(fā)明的原料的各個(gè)有機(jī)磷化合物，以及各化合物的化學(xué) 式。
[0015] 圖5用表格列出可用作本發(fā)明的原料的各個(gè)有機(jī)硫化合物，以及各化合物的化學(xué) 式。
[0016] 圖6描述可用作本發(fā)明的原料的各個(gè)有機(jī)磷化合物的名稱和結(jié)構(gòu)。
[0017] 圖7描述可用作本發(fā)明的原料的各個(gè)有機(jī)硫化合物的名稱和結(jié)構(gòu)。
[0018]圖8描述載體pNC273的質(zhì)粒圖譜，其被用來構(gòu)建菌株NS392。
[0019] 圖9用表格列出pNC273的序列。
[0020] 圖10描述兩種生物體(改良的解脂耶氏酵母(Y. lipolytica) NS392 (實(shí)心圓）和 野生型釀酒酵母(S. cerevisiae) NS22 (空心圓））在3種不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng):作 為唯一的磷源的亞磷酸鉀（左），作為唯一的磷源的磷酸鉀（中），和作為對(duì)照條件的磷酸鉀 加潮霉素 (hygromyic)。
[0021] 圖11描述NS22,野生型釀酒酵母(S. cerevisiae)在用磷酸鹽或亞磷酸鹽作為磷 源的限定培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。制備接種物的不同的10-倍連續(xù)稀釋液以觀察可能出現(xiàn)的滯后 期。
[0022] 圖12描述使用(a)磷酸鹽(Pi)和(b)亞磷酸鹽(Pt)的NS435的生長(zhǎng)。
[0023]圖13描述NS435在亞磷酸鹽培養(yǎng)基中的連續(xù)轉(zhuǎn)移后的分離株的生長(zhǎng)。
[0024] 圖14描述pNC360的質(zhì)粒圖譜。
[0025] 圖15用表格列出pNC360的序列。
[0026]圖16描述使用不同濃度的次磷酸鹽的NS435的生長(zhǎng)。
[0027]圖17描述在含有磷酸鹽(Pi，左）或亞磷酸鹽(Pt，右)作為磷源的限定培養(yǎng)基瓊脂 板上的NS252 + ptxD轉(zhuǎn)化株菌斑。還描述了未轉(zhuǎn)化的NS252菌斑。
[0028] 圖18描述pNC351的質(zhì)粒圖譜。
[0029] 圖19用表格列出pNC351的序列。
[0030] 發(fā)明詳述 概觀 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基因工程改造的宿主生物體，其中基因工程改造的宿 主生物體具有從復(fù)合底物中獲得生長(zhǎng)-限制營(yíng)養(yǎng)素的非天然能力；和所述復(fù)合底物不能被 天然宿主生物體代謝或用作營(yíng)養(yǎng)素。在某些實(shí)施方案中，所述非天然能力將提供具有顯著 競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的生物體，并為在發(fā)酵過程中的污染物的成功提供一個(gè)主要屏障。
[0031] 在某些實(shí)施方案中，生物體一般僅含有少量的磷和硫(如，分別為細(xì)胞質(zhì)量的約3% 和約1%)。所以，為了生長(zhǎng)，與例如氮比較，生物體需要更少的這些生長(zhǎng)限制的營(yíng)養(yǎng)素。
[0032] 在某些實(shí)施方案中，基因工程改造的宿主生物體是細(xì)菌、酵母、真菌、藻類、哺乳動(dòng) 物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，基因工程改造的宿主生物體是細(xì)菌或酵母。
[0033] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用上述基因工程改造的宿主生物體的方法，其 包括使基因工程改造的宿主生物體與改良的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明 涉及使用上述基因工程改造的宿主生物體的方法，其包括使基因工程改造的宿主生物體與 改良的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸，其中基因工程改造的宿主生物體將細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。在某 些實(shí)施方案中，使用這種途徑提供一種獨(dú)特而有針對(duì)性的方式，以促進(jìn)所需基因工程改造 的宿主生物體的生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，上述方法最大限度地減少污染生物體的生長(zhǎng)，提 供有價(jià)值的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，并允許控制生產(chǎn)一系列有價(jià)值的產(chǎn)物。
[0034] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法減少或消除在大規(guī)模酵母培養(yǎng)中使用預(yù)防性抗生 素的必要性。由于新出現(xiàn)的環(huán)境考慮和社會(huì)壓力，避免不必要的抗生素是一個(gè)重要的好處。 此外，在某些實(shí)施方案中，所述技術(shù)可應(yīng)用于可不加入抗生素的細(xì)菌系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案 中，可應(yīng)用所述技術(shù)以最大限度地減少天然抵抗許多通常使用的抗生素的野生酵母污染物 的生長(zhǎng)。
[0035]在某些實(shí)施方案中，基因工程改造的宿主生物體是酵母;和產(chǎn)物是乙醇、異丁醇、 乳酸、琥珀酸、赤藻糖醇、類異戊二烯、脂質(zhì)和酶產(chǎn)物、批量商品化學(xué)品或高價(jià)值特殊化學(xué) 品。
[0036]在某些實(shí)施方案中，基因工程改造的宿主生物體是細(xì)菌；和產(chǎn)物是丁醇、乙醇、異 丙醇、1，3-丙二醇(PD0)、1，4-丁二醇(BD0)、琥珀酸、衣康酸、酶產(chǎn)物、多元醇、蛋白產(chǎn)物、批 量商品化學(xué)品或高價(jià)值特殊化學(xué)品。
[0037] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的技術(shù)可應(yīng)用于生產(chǎn)一種或多種商品、精細(xì)化學(xué)品或 藥品。
[0038] 定義 如本^用的，術(shù)語"生物質(zhì)"是指一種主要含有碳水化合物的物質(zhì)。生物質(zhì)也可指一 種含有多糖的物質(zhì)。它也可指含有纖維素、半纖維素或木質(zhì)纖維素的物質(zhì)。生物質(zhì)通常得 自，例如，木材、植物、來自農(nóng)業(yè)或林業(yè)的殘余物、市政和工業(yè)廢物的有機(jī)組成部分、來自造 紙的原生淤漿、廢紙、廢木料(如，鋸肩）；農(nóng)業(yè)殘余物例如玉米皮、玉米芯、稻殼、稻草、甘蔗 渣;得自玉米、小麥、燕麥和大麥的淀粉;來自硬木頭或樹皮的植物廢料;纖維板工業(yè)廢水、 甘蔗肩、甘蔗渣、廢蜜、后發(fā)酵液、糠醛餾渣、水性橡木提取物、稻殼、燕麥殘留物、木糖廢液、 杉木鋸肩、石腦油、玉米芯糠醛渣、棉花球、大米、稻草、大豆皮，豆油渣、玉米皮、棉花桿、棉 籽殼、淀粉、土豆、甘薯、乳糖、廢木材制漿殘留物、葵花籽殼、己糖、戊糖、來自甘蔗和甜菜的 蔗糖、玉米糖漿、大麻，和以上的組合。
[0039] 〃干重〃和〃干細(xì)胞重量〃意指在相對(duì)沒有水的情況下測(cè)定的重量。例如，提及包含 以干重計(jì)的特定百分比的特定成分的含油細(xì)胞時(shí)，意指百分比基于基本上所有的水已被除 去后的細(xì)胞重量計(jì)算。
[0040] 〃外源基因〃是指已引入細(xì)胞（如，通過轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染）的編碼RNA和/或蛋白的表達(dá)的 核酸，并且也稱為〃轉(zhuǎn)基因〃。包含外源基因的細(xì)胞可稱為重組細(xì)胞，另外的外源基因可引入 其中。相對(duì)于要轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，外源基因可來自不同的物種（因此為異源的），或來自相同物種 (因此為同源的）。因此、外源基因可包括相對(duì)于基因的內(nèi)源性拷貝，占據(jù)細(xì)胞的基因組中不 同的位置或在不同的控制下的同源基因。外源基因可以一個(gè)以上的拷貝存在于細(xì)胞中。外 源基因可作為基因組(核或質(zhì)體)的插入物或作為游離基因分子維持在細(xì)胞中。
[0041] 〃表達(dá)載體〃或〃表達(dá)構(gòu)建體〃或〃質(zhì)粒〃或〃重組DNA構(gòu)建體〃是用于將核酸引入宿主 細(xì)胞的媒介。核酸可以是經(jīng)由人干預(yù)(包括通過重組手段或直接化學(xué)合成），用一系列允許 轉(zhuǎn)錄和/或翻譯特定核酸的指定核酸元件生成的核酸。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片 段的部分，或其它合適的媒介。典型地，表達(dá)載體包括可操作地連接于啟動(dòng)子的待轉(zhuǎn)錄的核 酸。
[0042] "誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"是響應(yīng)于特定的刺激，介導(dǎo)可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng) 子。
[0043] "可操作地連接"是兩個(gè)核酸序列之間的功能連接，例如控制序列（典型地，啟動(dòng) 子)和連接的序列（典型地，編碼蛋白的序列，也稱為編碼序列）。如果啟動(dòng)子可介導(dǎo)外源基 因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子與所述基因可操作地連接。
[0044] 〃溶胞產(chǎn)物"是一種包含溶解的細(xì)胞內(nèi)容物的溶液。
[0045] 〃溶解〃是指胞漿膜和任選生物有機(jī)體的細(xì)胞壁的破裂，其足以釋放至少一些細(xì)胞 內(nèi)容物，通常通過損害其完整性的機(jī)械、病毒或滲透機(jī)制進(jìn)行。
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