膜囊泡回收設(shè)備、膜囊泡回收方法及膜囊泡分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及與在生物學(xué)、生化學(xué)、生物工學(xué)、醫(yī)學(xué)及醫(yī)療領(lǐng)域中的膜囊泡體的分離及其分析有關(guān)的器具及方法。
[0002]本申請(qǐng)基于2013年10月25日于日本提出的特愿2013-222751號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容援引于此。
【背景技術(shù)】
[0003]—直以來(lái)，在細(xì)胞、細(xì)胞小器官等生物體來(lái)源的膜囊泡、人工的膜囊泡等被脂質(zhì)雙分子層覆蓋的結(jié)構(gòu)體中，對(duì)該結(jié)構(gòu)體的內(nèi)容物或者保持在脂質(zhì)雙分子層上的物質(zhì)等進(jìn)行了分析。
[0004]近年來(lái)，作為細(xì)胞間信息傳遞的方法，利用作為具有脂質(zhì)雙分子層的囊泡的外泌體的方法倍受關(guān)注。
[0005]外泌體是已知內(nèi)部包含蛋白質(zhì)、mRNA、微小RNA(miRNA)、DNA等、通過(guò)在細(xì)胞間移動(dòng)而能夠?qū)⑿畔鬟f至移動(dòng)目的地細(xì)胞的膜囊泡。例如，在接受有含有癌細(xì)胞來(lái)源的小RNA的外泌體的細(xì)胞中，已知免疫功能會(huì)活化或者會(huì)獲得轉(zhuǎn)移能力。
[0006]外泌體中除了包含釋放出了外泌體的細(xì)胞所保持的遺傳信息等信號(hào)因子之外，還包含能夠控制接受有該外泌體的其他細(xì)胞的功能的因子。因此，認(rèn)為外泌體能夠作為用于診斷疾病的新型生物標(biāo)記物源來(lái)進(jìn)行有效利用。
[0007]例如，專利文獻(xiàn)1、3中公開(kāi)了對(duì)外泌體內(nèi)的miRNA進(jìn)行分析來(lái)對(duì)癌或不良的妊娠結(jié)局進(jìn)行診斷。
[0008]專利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了為了決定利用siRNA(small interfering RNA，小干涉RNA)或miRNA藥物的治療效率而對(duì)各RNA進(jìn)行測(cè)定。
[0009]專利文獻(xiàn)4中公開(kāi)了對(duì)成為出現(xiàn)心血管系病癥的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)的蛋白質(zhì)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。
[0010]專利文獻(xiàn)5中公開(kāi)了對(duì)免疫反應(yīng)性的自身抗體水平進(jìn)行測(cè)定來(lái)對(duì)癌或不孕癥等與自身抗體產(chǎn)生有關(guān)的疾病進(jìn)行診斷。
[0011]專利文獻(xiàn)6中公開(kāi)了通過(guò)測(cè)定尿中外泌體的水通道蛋白I來(lái)檢測(cè)囊泡體應(yīng)激反應(yīng)和與該反應(yīng)有關(guān)的腎疾病。
[0012]外泌體可以通過(guò)從能夠含有外泌體的試樣中利用超離心分離或密度梯度超離心分離等利用密度差的分離來(lái)進(jìn)行分離、制備。另外，利用專利文獻(xiàn)7或?qū)＠墨I(xiàn)8所記載的方法也可進(jìn)行外泌體的分離。另外，市售有對(duì)外泌體進(jìn)行分離精制的試劑盒(例如Sy s t emB1sciences公司的ExoQuick、Life、或Techno1gies公司的Total Exosome Isolat1n等)O
[0013]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014]專利文獻(xiàn)
[0015]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2013-102768號(hào)公報(bào)
[0016]專利文獻(xiàn)2:日本特表2011-524164號(hào)公報(bào)
[0017]專利文獻(xiàn)3:日本特表2010-534480號(hào)公報(bào)
[0018]專利文獻(xiàn)4:日本特表2013-516619號(hào)公報(bào)
[0019]專利文獻(xiàn)5:日本特表2010-517048號(hào)公報(bào)
[0020]專利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2013-7698號(hào)公報(bào)[0021 ]專利文獻(xiàn)7:日本特表2003-531864號(hào)公報(bào)
[0022]專利文獻(xiàn)8:日本特表2002-535665號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0024]例如當(dāng)利用離心分離對(duì)外泌體進(jìn)行分離時(shí)，不能避免外泌體以外的夾雜物混入到所分離出的外泌體中，分析精度及重現(xiàn)性的提高有限。
[0025]另外，超離心分離或密度梯度超離心分離等用于分離外泌體的操作順序復(fù)雜且分離精制需要很長(zhǎng)時(shí)間。
[0026]另外，簡(jiǎn)便分離外泌體的現(xiàn)有的分離試劑盒的外泌體精制不足、分析的可靠性差。
[0027]然而，還已知利用外泌體的脂質(zhì)雙分子層中存在的跨膜四蛋白對(duì)外泌體選擇性地進(jìn)行分離精制?？缒に牡鞍桌缡窃谌梭w中已知有33種成員的四次跨膜型膜蛋白質(zhì)家族。特別是CD9、CD63、CD81作為外泌體標(biāo)記物被人們所知曉。但是，使用抗跨膜四蛋白單克隆抗體對(duì)外泌體進(jìn)行分離精制時(shí)，根據(jù)成為分離對(duì)象的抗原的種類不同，有時(shí)在最終分離精制的外泌體中產(chǎn)生偏差。
[0028]另外，為了對(duì)外泌體進(jìn)行分析，有時(shí)要破壞外泌體的膜結(jié)構(gòu)，但此時(shí)外泌體的內(nèi)容物在外泌體的破壞過(guò)程中會(huì)被稀釋。當(dāng)想要對(duì)因破壞稀釋狀態(tài)的外泌體所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行濃縮時(shí)，在濃縮過(guò)程中會(huì)有發(fā)生變性或損失的成分，因此濃縮困難。另外，當(dāng)以外泌體的蛋白質(zhì)作為解析對(duì)象時(shí)，由于無(wú)法在體外對(duì)與核酸不同的解析對(duì)象的蛋白質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，因此期待盡量不稀釋地進(jìn)行外泌體的分析。
[0029]本發(fā)明鑒于上述事實(shí)而作出，其目的在于提供能夠在膜囊泡不被破壞、膜囊泡的構(gòu)成要素難以被稀釋的情況下選擇性地回收膜囊泡的膜囊泡回收設(shè)備及膜囊泡回收方法以及簡(jiǎn)便且精度及重現(xiàn)性優(yōu)異的膜囊泡分析方法。
[0030]用于解決技術(shù)問(wèn)題的方法
[0031]本發(fā)明第一方式的膜囊泡回收設(shè)備具備液性的填充物和具有將所述填充物的外周的至少一部分覆蓋的脂質(zhì)雙分子層的融合膜，通過(guò)膜囊泡與所述融合膜發(fā)生融合，將所述膜囊泡的內(nèi)容物混合在所述填充物中。
[0032]上述第一方式的膜囊泡回收設(shè)備可以進(jìn)一步具備具有形成有能夠保持所述填充物的多個(gè)保持部的表面的反應(yīng)基體，所述填充物在多個(gè)所述保持部的各個(gè)中被所述融合膜覆蓋。
[0033]上述第一方式中，所述保持部可以是形成于所述反應(yīng)基體中的凹部，所述融合膜按照在所述凹部中與形成所述表面與所述凹部的邊界的開(kāi)口端接觸、并將所述凹部堵塞的方式設(shè)置在所述反應(yīng)基體上，所述填充物填充在所述凹部?jī)?nèi)。
[0034]上述第一方式中，所述融合膜可以按照與所述凹部的內(nèi)壁面中沿著所述開(kāi)口端的部分結(jié)合、并將所述多個(gè)凹部各個(gè)分別堵塞的方式在所述反應(yīng)基體上設(shè)置多個(gè)。
[0035]上述第一方式中，所述反應(yīng)基體可以至少所述內(nèi)壁面是疏水性的，所述融合膜的疏水部與所述內(nèi)壁面結(jié)合。
[0036]上述第一方式中，所述融合膜可以形成為沿著所述表面的面狀，且形成為將所述多個(gè)凹部堵塞的一個(gè)連續(xù)的膜狀。
[0037]上述第一方式中，所述融合膜可以含有促進(jìn)作為生物體來(lái)源或人工的囊泡并被脂質(zhì)雙分子層覆蓋的膜囊泡與所述融合膜的膜融合的膜電荷調(diào)整物質(zhì)。
[0038]上述第一方式中，所述膜電荷調(diào)整物質(zhì)可以含有膜破壞性肽、膜融合性聚合物、pH敏感性聚合物及病毒來(lái)源的膜融合蛋白質(zhì)中的至少I個(gè)。
[0039]上述第一方式中，所述填充物可以含有溶劑和所述溶劑中含有的生化學(xué)分析用反應(yīng)試劑。
[0040]上述第一方式中，所述生化學(xué)分析用反應(yīng)試劑可以含有pH指示劑。
[0041 ]上述第一方式中，所述填充物可以是凝膠或溶膠。
[0042]上述第一方式的膜囊泡回收設(shè)備可以進(jìn)一步具備具有形成有多個(gè)親水部和包圍所述親水部的疏水部的表面的反應(yīng)基體，所述填充物設(shè)置在所述親水部中，所述融合膜在所述親水部與所述疏水部的邊界處與所述疏水部結(jié)合并將所述填充物包裹。
[0043]本發(fā)明第二方式的膜囊泡回收方法是將作為生物體來(lái)源或人工的囊泡并被脂質(zhì)雙分子層覆蓋的膜囊泡回收至上述第一方式的膜囊泡回收設(shè)備中的膜囊泡回收方法，其中，使含有所述膜囊泡的試樣與所述融合膜接觸，使所述融合膜與所述膜囊泡膜發(fā)生融合。
[0044]上述第二方式中，可以將使所述試樣為酸性的pH調(diào)節(jié)劑添加在所述試樣中之后使酸性的所述試樣與所述融合膜接觸。
[0045]本發(fā)明第三方式的膜囊泡分析方法是對(duì)作為生物體來(lái)源或人工的囊泡并被脂質(zhì)雙分子層覆蓋的膜囊泡的內(nèi)容物、膜蛋白質(zhì)或膜脂質(zhì)進(jìn)行分析的膜囊泡分析方法，其中，使所述膜囊泡與上述第一方式的膜囊泡回收設(shè)備的所述融合膜發(fā)生融合，在所述融合膜中保持所述膜囊泡上的所述膜蛋白質(zhì)或所述膜脂質(zhì)。
[0046]本發(fā)明第四方式的膜囊泡分析方法是對(duì)作為生物體來(lái)源或人工的囊泡并被脂質(zhì)雙分子層覆蓋的膜囊泡的內(nèi)容物、膜蛋白質(zhì)或膜脂質(zhì)進(jìn)行分析的膜囊泡分析方法，其中，使所述膜囊泡與上述第一方式的膜囊泡回收設(shè)備的所述融合膜發(fā)生融合，在所述填充物內(nèi)使所述膜囊泡的內(nèi)容物、膜蛋白質(zhì)或膜脂質(zhì)與所述生化學(xué)分析用反應(yīng)試劑發(fā)生反應(yīng)。
[0047]在使用了上述第一方式的膜囊泡回收設(shè)備的膜囊泡分析方法或上述第四方式的膜囊泡分析方法中，所述生化學(xué)分析用反應(yīng)試劑可以含有核酸分析試劑、侵入反應(yīng)試劑、蛋白質(zhì)分析試劑、脂質(zhì)分析試劑、免疫分析試劑及均質(zhì)抗原抗體反應(yīng)用試劑中的至少I個(gè)。
[0048]發(fā)明效果
[0049]根據(jù)本發(fā)明的上述各方式，可以提供能夠在膜囊泡的構(gòu)成要素難以被稀釋的情況下選擇性地回收膜囊泡的膜囊泡回收設(shè)備及膜囊泡回收方法、以及簡(jiǎn)便且精度及重現(xiàn)性優(yōu)異的膜囊泡分析方法。
【附圖說(shuō)明】
[0050]圖1是表示本發(fā)明第I實(shí)施方式的膜囊泡回收設(shè)備的立體圖。
[0051]圖2是圖1中符號(hào)X所示部分的放大圖。
[°°52]圖3A是圖2的A-A線處的示意截面圖。
[0053]圖3B是表示本發(fā)明第I實(shí)施方式的膜囊泡回收設(shè)備的另一構(gòu)成例的截面圖。
[0054]圖4是用于說(shuō)明本發(fā)明第I實(shí)施方式的膜囊泡回收設(shè)備的制造工序的圖。
[0055]圖5是用于說(shuō)明本發(fā)明第I實(shí)施方式的膜囊泡回收設(shè)備的制造工序的圖。
[0056]圖6是用于說(shuō)明本發(fā)明第I實(shí)施方式的膜囊泡回收設(shè)備的制造工序的圖。
[0057]圖7是用于說(shuō)明本發(fā)明第I實(shí)施方式的膜囊泡回收設(shè)備的制造工序的圖。<