質(zhì)的硫酸化程度、對(duì)MVA病毒的吸附能力、和純化MVA病毒制劑 被來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)液的DNA污染的影響。硫酸化中的反應(yīng)溫度增加時(shí)（35、40或45°C )，纖維素 基質(zhì)的硫酸化程度從基于纖維素聚合物主鏈重量的5.3重量％增至13重量％，而純化的病 毒制劑中DNA分?jǐn)?shù)從7.4 %增至17 %，W及純化MVA病毒的收率從66 %增至80 %。通過(guò)硫酸化 纖維素基質(zhì)的手段純化病毒制劑可與使用具有苯基、下基或己基配體的色譜基質(zhì)的疏水相 互作用色譜的附加步驟組合。
[0027] 使用從US8，173,021B2已知的方法，盡管使用相對(duì)微細(xì)的膜(來(lái)自怖atman的RC-5 5 膜，孔徑0.4扣m)也不能獲得大于15%的硫酸化程度。選擇的孔徑也不利于結(jié)合直徑超過(guò) IOOnm的病毒，因?yàn)樵诓《疚綍r(shí)可發(fā)生流動(dòng)損失和膜的堵塞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0028] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供病毒純化，例如流感病毒純化用的膜，該膜一方面具有 對(duì)欲分離的目標(biāo)化合物的高選擇性，另一方面使得能在高流速下將例如雙鏈DNA或細(xì)胞成 分等不期望的污染物從病毒生產(chǎn)用的細(xì)胞培養(yǎng)液中有效除去。
[0029] 此目標(biāo)通過(guò)權(quán)利要求中表征的主題實(shí)現(xiàn)。
[0030] 具體地，本發(fā)明提供硫酸化纖維素水合物膜，其包含具有從膜的一個(gè)主表面向另 一個(gè)主表面延伸的孔的交聯(lián)纖維素水合物基質(zhì)，其中纖維素水合物膜在其內(nèi)外表面上具有 硫酸系配體用于吸附物質(zhì)（adso巧tive subs1:ance)的分離。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，硫酸化纖維素水合物膜為吸附膜。吸附膜是指具有從一側(cè)穿透至另 一側(cè)的孔的片狀吸附劑。吸附劑為多孔固體，其可經(jīng)稱(chēng)作配體的表面官能團(tuán)而接受與流體 的特定組分的選擇性結(jié)合。目標(biāo)物質(zhì)和/或污染物是指根據(jù)本發(fā)明的吸附物(adsorbate)， 其也可采取兩種或更多種不同物質(zhì)的形式。吸附物可為單獨(dú)分子、締合物(associate)或顆 粒，在目標(biāo)物質(zhì)的情況下優(yōu)選病毒。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明，纖維素水合物基質(zhì)的交聯(lián)在后續(xù)處理步驟的硫酸化之前進(jìn)行。驚訝 地發(fā)現(xiàn)欲硫酸化的纖維素水合物膜的預(yù)先交聯(lián)導(dǎo)致對(duì)反滲透水(RO水)的透過(guò)性增加，導(dǎo)致 硫酸系配體密度增加，導(dǎo)致結(jié)合能力增長(zhǎng)，并導(dǎo)致對(duì)欲分離的目標(biāo)化合物(特別是對(duì)流感病 毒）的結(jié)合選擇性增強(qiáng)，其中運(yùn)些有利效果不能通過(guò)使用在硫酸化之前沒(méi)有交聯(lián)的硫酸化 纖維素膜而獲得。與US8，173,021B2和US2012/0171750A1相反，通過(guò)交聯(lián)的纖維素膜而非現(xiàn) 有技術(shù)獲得的膜的硫酸化，出乎意料地可獲得顯著更高的硫酸系配體密度。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的硫酸系配體密度通過(guò)硫酸化程度確定，其中根據(jù)本發(fā)明的硫酸化纖 維素水合物膜的優(yōu)選實(shí)施方案，纖維素水合物基質(zhì)的硫酸化程度為10重量％ ^上，更優(yōu)選 15重量％ ^上，并特別優(yōu)選超過(guò)20重量％，其導(dǎo)致有利于病毒生產(chǎn)的選擇性提高。根據(jù)本發(fā) 明，硫酸化程度理解為表示硫酸化纖維素水合物基質(zhì)上的硫酸系基團(tuán)的質(zhì)量比。硫酸化程 度通過(guò)滴定而定量測(cè)定，其中可例如用氨氧化鋼水溶液確定膜上的硫酸系基團(tuán)的定量的 量。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明，硫酸化程度用下式確定：
[0035] W重量％計(jì)的硫酸化程度=(n廁!疆XM(S03)/(聊朦+(n?m強(qiáng)XM(S03))) X 100%
[0036] 其中
[0037] 賴(lài)臟=每cm2膜中Wyg計(jì)的纖維素的質(zhì)量
[0038] 和通過(guò)下式的方式確定的硫酸系基團(tuán)密度naass:
[0039] 硫酸系基團(tuán)密度:naai靈(皿ol/cm2) = c(化OH) Xt(化OH) XWrfeOH) X1000 /A
[0040] 其中
[0041 ] C (NaOH) Wmol/1計(jì)的氨氧化鋼滴定水溶液的定量濃度
[0042] WNaOH)隊(duì)ill計(jì)的在等當(dāng)點(diǎn)(pH 7)下消耗的滴定液體積
[0043] t(NaOH)滴定液的校正系數(shù)
[0044] 1000 從mo Vl向皿O Vl的轉(zhuǎn)換系數(shù)
[0045] A Wcm2計(jì)的活性濾器表面
[0046] 和其中
[0047] M(S03) Wiig/皿 〇1 計(jì)的 S03 摩爾質(zhì)量。
[0048] 與非交聯(lián)纖維素膜的硫酸化相比，硫酸系配體密度可出乎意料地增加，通過(guò)根據(jù) 本發(fā)明的纖維素膜的交聯(lián)的上至30的系數(shù)，相比于來(lái)自現(xiàn)有技術(shù)的比較例(表2中的樣品1 和3)。運(yùn)甚至用平均孔徑超過(guò)0.45WI1的纖維素膜也是可能的。
[0049] 纖維素水合物膜預(yù)先交聯(lián)的另外的出乎意料的結(jié)果是與之相連的透過(guò)性的增加， 和對(duì)于例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)等小蛋白質(zhì)或污染物的結(jié)合能力的降低，盡管硫酸系配體密度 增加，運(yùn)導(dǎo)致有利于病毒生產(chǎn)的增強(qiáng)的選擇性。
[0050] 如下文所述，根據(jù)本發(fā)明的膜的制備方法可按兩步進(jìn)行:將膜交聯(lián)和將膜硫酸化。
[0051] 交聯(lián)程度、孔徑、和作為結(jié)果的膜的透過(guò)性、和用于進(jìn)一步硫酸化反應(yīng)的徑基的可 接近性可通過(guò)交聯(lián)劑的類(lèi)型、交聯(lián)劑的濃度、任選使用的交聯(lián)催化劑的濃度、如果適當(dāng)?shù)慕?聯(lián)持續(xù)時(shí)間、惰性有機(jī)溶劑的類(lèi)型和濃度、和/或交聯(lián)溫度來(lái)控制。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的硫酸化纖維素水合物膜的優(yōu)選實(shí)施方案，交聯(lián)的程度在0.05至0.5 之間，其中選擇通過(guò)與雙官能交聯(lián)劑反應(yīng)的纖維素的葡糖酢單元的平均取代程度作為交聯(lián) 程度(DC)的量度。在此情況下，根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)程度，如W095/32793A1中記載的，定義為：
[0053] DC = 3.24X AM/Mv [0054] 其中
[0055] DC:根據(jù)本發(fā)明的膜的交聯(lián)程度
[0056] A M:通過(guò)起始膜的初始質(zhì)量的W %計(jì)的交聯(lián)，根據(jù)本發(fā)明的膜的質(zhì)量增加
[0057] Mv:交聯(lián)劑的摩爾質(zhì)量。
[0058] 從雙官能交聯(lián)劑開(kāi)始，并假設(shè)它們各自結(jié)合至兩個(gè)纖維素單體單元，則至多=個(gè) 交聯(lián)劑分子可與兩個(gè)纖維素單體單元反應(yīng)。運(yùn)具有324g/mol的組合摩爾質(zhì)量。DC的理論最 大可能值為至多3,歸因于纖維素單體單元的=個(gè)可交聯(lián)徑基。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明，硫酸化纖維素水合物膜適合用于吸附物質(zhì)的分離，特別是用于病毒 的有效純化。特別地，W下是可能的：如果選擇根據(jù)本發(fā)明的硫酸化纖維素水合物膜的截留 分子量，使得目標(biāo)物質(zhì)不阻塞膜表面，由此可維持高流速。取決于所需的目標(biāo)物質(zhì)，可設(shè)定 截留分子量，使得目標(biāo)物質(zhì)吸附在硫酸化纖維素水合物膜中，并且隨后可從其洗脫。根據(jù)本 發(fā)明的膜的平均孔徑優(yōu)選在0.5至5. Owii之間，特別優(yōu)選1.0至3. Owii之間。
[0060] 起始胺：
[0061 ] 平均孔徑為0.1至20皿，優(yōu)選0.5至15皿，更優(yōu)選1至10皿，在根據(jù)本發(fā)明的方法中 用作起始膜的纖維素水合物膜，通過(guò)從例如在L. J. Zeman等人，"Microf i Itration and ultrafiltration principles and applications"，Marcel Dekkerl996, ('Part I"， "Chapter 3. r、DE10326741A巧郵E3447625A1中記載的技術(shù)領(lǐng)域中獲知的通常制備方法來(lái) 制備。為了確定平均孔徑，進(jìn)行"毛細(xì)管流氣孔測(cè)量法山日目111日巧flow porome化y)試驗(yàn)"。 詳細(xì)信息可見(jiàn)于乂apillaiT Flow Porometer 6.0",CAPWIN Software SystemJorous Materials Inc.的操作指南。
[0062] 優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明，已任選地受到下文記載的預(yù)處理的纖維素醋膜W合適的皂化介 質(zhì)皂化，在此情況下形成纖維素水合物膜。取決于預(yù)處理介質(zhì)的類(lèi)型，在皂化步驟中纖維素 醋膜可按干燥或濕潤(rùn)使用。
[0063] 纖維素醋膜可基于單醋酸纖維素、二醋酸纖維素、=醋酸纖維素、丙酸纖維素、下 酸纖維素和乙酷下酸纖維素，或其它合適的纖維素醋或硝酸纖維素、甲基纖維素或乙基纖 維素或其混合物，其中醋酸纖維素系為優(yōu)選的，特別是二醋酸纖維素。在此情況下纖維素醋 膜在皂化步驟前可在合適的介質(zhì)中預(yù)處理，其中預(yù)處理介質(zhì)包含對(duì)纖維素醋有溶解或軟化 效果的一種或多種添加劑。合適的添加劑尤其是酸，特別是簇酸，例如醋酸，和用于纖維素 醋的水溶性軟化劑，例如甘油二乙酸醋、甘油S乙酸醋和環(huán)下諷。
[0064] 皂化介質(zhì)優(yōu)選包含堿性化合物，優(yōu)選堿金屬氨氧化物。特別優(yōu)選使用氨氧化鋼、氨 氧化鐘或氨氧化裡的水溶液。也可使用堿金屬氨氧化物和其它堿性化合物例如碳酸鋼、碳 酸鐘、碳酸飽等堿金屬碳酸鹽，碳酸氨鋼和/或S聚憐酸鋼(sodium triphosphate)、S聚憐 酸鐘、娃酸鋼和娃酸鐘等的混合物。
[0065] 所得的纖維素水合物膜可具有任意合適的厚度。膜厚度優(yōu)選在50至500WI1之間的 范圍，更優(yōu)選在100至300WI1之間的范圍。獲得的纖維素水合物膜可成形為片狀膜或圓筒。圓 筒膜是指中空纖維膜、毛細(xì)管膜或管狀膜。
[0066] 交聯(lián)；
[0067] 交聯(lián)劑分子中有至少兩個(gè)官能團(tuán)，其與纖維素膜的徑基反應(yīng)，并由此實(shí)現(xiàn)纖維素 膜的交聯(lián)。例如，纖維素膜的交聯(lián)通過(guò)可對(duì)纖維素聚合物鏈的徑基反應(yīng)的具有至少兩個(gè)官 能團(tuán)的前述交聯(lián)劑，經(jīng)兩條纖維素聚合物鏈的（分子間)連接或經(jīng)纖維素聚合鏈的重復(fù)單元 的（分子內(nèi)）連接而實(shí)現(xiàn)?？捎玫慕宦?lián)劑原理上不受任何特別限制，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可根 據(jù)后續(xù)硫酸化的反應(yīng)條件來(lái)選擇交聯(lián)劑。然而，在交聯(lián)步驟中，優(yōu)選使用雙環(huán)氧化合物 (di邱oxide compounds)或其它具有可與纖維素的徑基反應(yīng)的至少兩個(gè)反應(yīng)性官能團(tuán)的化 合物，例如二異氯酸醋、表氯醇、表漠醇、二甲基脈、二甲基乙基脈、二甲基氯硅烷、雙(2-徑 乙基諷）、二乙締基諷、亞烷基二面化物、徑亞烷基二面化物和二環(huán)氧甘油酸。特別優(yōu)選在交 聯(lián)步驟中使用雙環(huán)氧化合物。
[0068] 從二環(huán)氧甘油酸的組中，優(yōu)選1,4-下二醇二環(huán)氧甘油酸、乙二醇二環(huán)氧甘油酸、丙 =醇二環(huán)氧甘油酸和聚乙二醇二環(huán)氧甘油酸。
[0069] 特別優(yōu)選使用1,4-下二醇二環(huán)氧甘油酸或乙二醇二環(huán)氧甘油酸作為交聯(lián)劑。
[0070] 任選地，可使用不同交聯(lián)劑的混合物。
[0071] 交聯(lián)可在水性介質(zhì)中、有機(jī)溶劑中或者在水和有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行。交聯(lián)優(yōu) 選在水性介質(zhì)中進(jìn)行。
[0072] 優(yōu)選使用交聯(lián)催化劑，例如氨氧化鋼或氨氧化鐘，W加速纖維素與交聯(lián)劑的交聯(lián)。
[0073] 交聯(lián)步驟中使用的介質(zhì)的溫度可從約4°C