含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測(cè)的專用高精度高效液相色譜方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于氨基酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水 解氨基酸同時(shí)檢測(cè)的高效液相色譜方法。
【背景技術(shù)】
[0002] γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系 統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)，是腦組織中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。它能夠結(jié)合抗焦慮的腦受體并 使之激活，然后與另外一些物質(zhì)協(xié)同作用，阻止與焦慮相關(guān)的信息抵達(dá)腦中樞，能夠降低神 經(jīng)元活性，舒緩人們的不安、壓力、疲倦、憂慮等狀況。
[0003] 2009年衛(wèi)生部批準(zhǔn)GABA為新資源食品，以L-谷氨酸為原料經(jīng)希氏乳桿菌發(fā)酵制 成，可應(yīng)用于飲料及糖果、膨化食品等中。乳品作為人們普遍食用的消費(fèi)品之一，GABA與牛 奶的結(jié)合，能夠使人們很好地在補(bǔ)充日常營(yíng)養(yǎng)所需的同時(shí)緩解壓力、減少不安。
[0004] 針對(duì)γ -氨基丁酸，現(xiàn)行輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4587-2013《γ -氨基丁酸》的規(guī)范性 附錄中提供了 γ-氨基丁酸含量檢測(cè)方法;張暉等(2003)采用0ΡΑ柱前自動(dòng)衍生測(cè)定了米胚 芽中的γ-氨基丁酸;涂云飛等(2012)采用柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定茶葉中的γ-氨基 丁酸;胡雪蓮等(2015)采用高效液相色譜法測(cè)定了黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸。 針對(duì)氨基酸檢測(cè)，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》，用于測(cè)定食 品中16種氨基酸，但是采用全自動(dòng)氨基酸分析儀。
[0005] 這些方法或是對(duì)米胚芽、茶葉、黑莓果汁和啤酒中的γ-氨基丁酸進(jìn)行檢測(cè)，或是 對(duì)食品中16種氨基酸的檢測(cè)，對(duì)含乳飲料中γ -氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測(cè) 的快速準(zhǔn)確的分析檢測(cè)方法還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，開(kāi)展含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水 解氨基酸同時(shí)檢測(cè)方法的研究工作，對(duì)提高產(chǎn)品品質(zhì)、加強(qiáng)監(jiān)督具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨 基酸同時(shí)檢測(cè)的專用高精度高效液相色譜方法，具有極高的靈敏度和優(yōu)越的穩(wěn)定性。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0008] 含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測(cè)的專用高精度高效液相 色譜方法，設(shè)定樣品水解、衍生處理、上柱檢測(cè)三個(gè)操作步驟，然后針對(duì)含乳飲料的特性設(shè) 定上述三操作步驟所使用的處理試劑及試劑用量及處理參數(shù)，使得上述三操作步驟的工藝 參數(shù)相互嚴(yán)密配合，實(shí)現(xiàn)對(duì)含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸的一步式高精 度檢測(cè)。
[0009] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該檢測(cè)方法包括如下步驟： Α、制備含乳飲料水解樣品：取含乳飲料置于水解管中，加入鹽酸和苯酚后隨即冷凍處 理，然后充入惰性氣體并擰緊水解管螺蓋，再將水解管放入恒溫干燥箱進(jìn)行充分水解，然后 將水解液取出過(guò)濾，取濾液干燥蒸干，再次用鹽酸溶解并精濾到高效液相色譜的進(jìn)樣瓶中； B、 水解樣品的自動(dòng)柱前衍生處理:在室溫條件下，吸收步驟A所得樣品并與和硼酸緩沖 液、鄰苯二甲醛混勻，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯混勻，準(zhǔn)備上樣； C、 高效液相色譜檢測(cè)γ -氨基丁酸和16種氨基酸的含量:高效液相色譜的分離條件為， 色譜柱:通用的C18液相色譜柱;柱溫:40°C;流動(dòng)相Α:純水中加入結(jié)晶乙酸鈉混勻，調(diào)pH調(diào) 后加入四氫呋喃;流動(dòng)相B:純水中加入結(jié)晶乙酸鈉混勻，調(diào)pH后加入乙腈和甲醇混勻;梯度 洗脫條件設(shè)定如下： 檢測(cè)條仵設(shè)定如卜：檢測(cè)器米用二極管
陣列或紫外檢測(cè)器；〇_25min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng) 338nm; 25-32min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)262nm; 32-35 · 5min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)338nm。
[0010]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該檢測(cè)方法包括如下步驟，下述步驟中涉及的 重量份均以克為單位計(jì)算，涉及的體積份均以毫升為單位計(jì)算： A、制備含乳飲料水解樣品：取含乳飲料1重量份置于水解管中，加入濃鹽酸1-3體積份 或加入6mol/L鹽酸10-15體積份，再加入新蒸餾的苯酚3-4滴，將水解管放入冷凍劑中，冷凍 3min-5imn，充入高純氮?dú)獠⒃诔涞獨(dú)鉅顟B(tài)下擰緊螺蓋，將水解管放入109-111°C的恒溫干 燥箱中，水解20-30小時(shí)后取出冷卻，打開(kāi)水解管，將水解液全部過(guò)濾轉(zhuǎn)移到容量瓶中，取濾 液1-2體積份用真空干燥器在40°C_50°C干燥，蒸干，用0.5-2體積份0. lmol/L的鹽酸溶解， 然后采用0.2μπι-0.8μπι的濾膜過(guò)濾到高效液相色譜進(jìn)樣瓶中； Β、水解樣品的自動(dòng)柱前衍生處理:在室溫條件下，吸收步驟Α所得樣品0.5-2體積份，吸 取硼酸緩沖液3-7體積份，吸取鄰苯二甲醛0.5-2體積份，混勻，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯 0.5-2體積份，混勻，準(zhǔn)備上樣； C、高效液相色譜檢測(cè)γ -氨基丁酸和16種氨基酸的含量:高效液相色譜的分離條件為， 色譜柱:通用的C18液相色譜柱;柱溫:40°C ;流動(dòng)相A: 1000體積份純水中加入4-8重量份結(jié) 晶乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入3-5體積份四氫呋喃;流動(dòng)相B: 400體積份純水中 加入6-12重量份結(jié)晶乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入600-1000體積份乙腈和600- 1 八八八 /士 //、m 3P古、、/曰 Λ-r 士?? Firt Λ?
檢測(cè)條件設(shè)定如下：檢測(cè)器采用二極管陣列或紫外檢測(cè)器;〇_25min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng) 338nm; 25-32min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)262nm; 32-35 · 5min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)338nm。
[0011] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該檢測(cè)方法包括如下步驟，下述步驟中涉及的 重量份均以克為單位計(jì)算，涉及的體積份均以毫升為單位計(jì)算： A、制備含乳飲料水解樣品：取含乳飲料1重量份置于水解管中，加入濃鹽酸2體積份或 加入6mo 1/L鹽酸12體積份，再加入新蒸餾的苯酚3滴，將水解管放入冷凍劑中，冷凍4imn，充 入高純氮?dú)獠⒃诔涞獨(dú)鉅顟B(tài)下擰緊螺蓋，將水解管放入ll〇°C的恒溫干燥箱中，水解24小時(shí) 后取出冷卻，打開(kāi)水解管，將水解液全部過(guò)濾轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，取濾液1.5體積份用真 空干燥器在45°C干燥，蒸干，用1體積份0. lmol/L的鹽酸溶解，然后采用0.45μπι的濾膜過(guò)濾 到高效液相色譜進(jìn)樣瓶中； Β、水解樣品的自動(dòng)柱前衍生處理:在室溫條件下，吸收步驟Α所得樣品1體積份，吸取硼 酸緩沖液5體積份，吸取鄰苯二甲醛1體積份，混勻，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯1體積份，混 勻，準(zhǔn)備上樣； C、高效液相色譜檢測(cè)γ -氨基丁酸和16種氨基酸的含量:高效液相色譜的分離條件為， 色譜柱:通用的C18液相色譜柱;柱溫:40°C ;流動(dòng)相A: 1000體積份純水中加入6重量份結(jié)晶 乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入4體積份四氫呋喃;流動(dòng)相B: 400體積份純水中加入 9重量份結(jié)晶乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入800體積份乙腈和800體積份甲醇，混 勺.詳磨袢臘客牴沿宙加下.
恆測(cè)求1十議疋50J Γ :恆測(cè)益術(shù)州>飯官件刈現(xiàn)系外恆測(cè)益；u-zomin，議疋恆測(cè)奴1X 338nm; 25-32min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)262nm; 32-35 · 5min，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)338nm。
[0012] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中所述的C18液相色譜柱選用X Bridge C18色譜柱、Hypersil ODS C18色譜柱。
[0013] 本發(fā)明檢測(cè)得到的γ -氨基丁酸和16種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸衍生物色譜圖，出峰順序依次 為：（l)Asp，天門冬氨酸；（2)G