一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發(fā)酵木薯生產(chǎn)乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發(fā)酵木薯生產(chǎn)乙醇的方法，提供一種以木薯為原料，利用固定化糖化酶及酵母生產(chǎn)乙醇的方法。通過(guò)使用本發(fā)明公開(kāi)的特殊的固定化劑，取得了縮短發(fā)酵時(shí)間、提高了發(fā)酵效率。
【背景技術(shù)】
[0002]在現(xiàn)有技術(shù)中固定化細(xì)胞發(fā)酵具有能使發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞濃度提高，細(xì)胞可連續(xù)使用，最終使發(fā)酵液酒精濃度得以提高。在游離發(fā)酵過(guò)程中，菌種細(xì)胞隨著酵液流出，造成菌種細(xì)胞濃度迅速降低，發(fā)酵速度變慢。
[0003]目前研究比較廣泛的是采用聚乙烯醇(PVA)為載體共固定化酵母菌細(xì)胞和糖化酶，在酵母菌與糖化酶共固定化木薯酒精連續(xù)發(fā)酵工藝研究中，以木薯糖化醪液為發(fā)酵底物，在共固定化生物反應(yīng)器中，控制發(fā)酵溫度30°C，在糖化醪流加速率為9mL/h，停留時(shí)間
3.1h和稀釋速率為0.155h-l條件下進(jìn)行酒精連續(xù)發(fā)酵，成熟發(fā)酵醪液殘余總糖和殘余還原糖含量均較低，游離細(xì)胞數(shù)較常規(guī)發(fā)酵低I個(gè)數(shù)量級(jí)以上，總糖利用率高達(dá)96.91%。
[0004]共固定化酵母菌細(xì)胞和糖化酶可用于木薯酒精連續(xù)發(fā)酵工藝，但聚乙烯醇存在有危險(xiǎn)性，當(dāng)吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收聚乙烯醇后對(duì)身體有害，對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用，而且聚乙烯醇可燃，具有刺激性，其粉體與空氣可形成爆炸性混合物，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，遇火星會(huì)發(fā)生爆炸，加熱分解產(chǎn)生易燃?xì)怏w。
[0005]綜上所述說(shuō)明聚乙烯醇不適合在木薯酒精連續(xù)發(fā)酵工藝中大規(guī)模應(yīng)用。
[0006]中國(guó)專(zhuān)利CN103484504A，于2014年I月I日公開(kāi)了一種以木薯為原料發(fā)酵制備乙醇的方法，其中酵母菌的固定化采用海藻酸鈉溶液。該方法包括木薯液化、糖化、固定化酵母發(fā)酵、蒸餾提取乙醇的步驟，所述木薯液化是將木薯粉碎后加水?dāng)噭?，按?U/g?10U/g木薯的比例添加淀粉酶，在96°C?98°C下液化20min?30min,得到液化衆(zhòng)液；
[0007]所述糖化是將木薯液化得到的漿液真空降溫至58°C?62°C，采用注射方式加入硫酸調(diào)節(jié)pH = 4.5?5.0,再按照150U/g?200U/g木薯的比例往木薯液化漿液中加入糖化酶保溫糖化40min?50min,得到糖化醪；
[0008]所述固定化酵母發(fā)酵是向糖化醪中接種經(jīng)固定化的酵母菌，其用量以酵母菌計(jì)，為木薯重量的0.5%。?1%。，在38°C?40°C下發(fā)酵9h?llh，收集流出液。
[0009]所述的以木薯為原料發(fā)酵制備乙醇的方法，其中酵母菌的規(guī)定化方法為:將活化酵母與2?%的海藻酸鈉溶液混勻后用注射器逐滴滴加到2?%的氯化鈣溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，形成海藻酸鈣凝膠顆粒；再將海藻酸鈣凝膠顆粒水洗后移入到2w%的氯化鈣溶液中，在4°C下平衡12小時(shí)，用蒸餾水洗滌3次后，移入到1?%的硫酸鋁溶液中，在4°C下交換12小時(shí)，得到海藻酸鋁凝膠顆粒。
[0010]該專(zhuān)利所選擇的高分子載體為海藻酸鋁，具有價(jià)格便宜，制備簡(jiǎn)單，安全無(wú)毒、擴(kuò)散系數(shù)大，機(jī)械強(qiáng)度好，固定化條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有很強(qiáng)的耐鹽能力，尤其是耐磷酸鹽的能力，選用海藻酸鋁合凝膠固定化酵母菌能明顯延長(zhǎng)固定化酵母的使用壽命，降低生產(chǎn)成本。
[0011]中國(guó)專(zhuān)利CN103571880A，于2014年2月12日公開(kāi)了一種利用甜菜生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其中酵母細(xì)胞的固定化采用海藻鈉和聚乙烯醇，該方法包含有:
[0012]A、制備玉米漿液:1L水中加入30g玉米粉，加熱為(90±2) °C，加入α -淀粉酶液化35min,冷卻降溫至(55 ± 2) °C,加入糖化酶糖化50min ；
[0013]B、制備固定化酵母細(xì)胞活化增殖培養(yǎng)基:葡萄糖2O g，玉米漿液3OmI，硫酸銨0.5g，磷酸二氫鉀0.02g，硫酸亞鐵0.003g，加水至1000ml，常規(guī)高壓滅菌后冷卻備用；
[0014]C、酵母菌細(xì)胞的固定化:將適量活性干酵母置于30°C無(wú)菌水中化開(kāi)后，按比例與含有0.6%海藻酸鈉的6%聚乙烯醇水溶液混勻，再用注射器逐滴滴入含I %氯化鈣的5%硼酸液中，制得直徑為3_左右的固定化凝膠顆粒，固化50min，濾出固定化凝膠顆粒，用生理鹽水洗滌3次，浸入無(wú)菌水中備用；
[0015]D、固定化酵母細(xì)胞的增殖:將固定化酵母細(xì)胞凝膠顆粒用無(wú)菌水浸洗5次，加入同體積的固定化酵母活化增殖培養(yǎng)基，于30°C、120r/min通氣振蕩培養(yǎng)，13h后酵母細(xì)胞開(kāi)始增殖。
[0016]當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間至24小時(shí)時(shí)，游離酵母數(shù)為3.8X 17個(gè)/ml以上，即完成增殖過(guò)程；
[0017]E、固定化生物催化劑酒精連續(xù)發(fā)酵:
[0018]將備好的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基用蠕動(dòng)泵恒速輸入固定化生物反應(yīng)器中，控制發(fā)酵溫度30°C，在糖化醪流加速率為15ml/h?16ml/h、停留時(shí)間為3h?4h和稀釋速率為0.15h 1?0.16h 1條件下進(jìn)行酒精連續(xù)發(fā)酵；
[0019]F、確定聚乙烯醇(PVA)凝膠顆粒的穩(wěn)定性。
[0020]該專(zhuān)利的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)將酵母固定化，使得酵母在發(fā)酵甜菜生產(chǎn)燃料酒精時(shí)可以重復(fù)利用，且提高了發(fā)酵效率和酵母的穩(wěn)定性。
[0021]美國(guó)專(zhuān)利US5766907A，于1998年6月16日公開(kāi)了一種固定化微生物細(xì)胞的方法，其采用海藻酸鈉和聚氧乙烯山梨糖醇。
[0022]以上三個(gè)專(zhuān)利的存在的不足之處是發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),發(fā)酵效率相對(duì)較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]本發(fā)明的就是方案是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的原料聚乙烯醇對(duì)身體有害，對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用，而且聚乙烯醇可燃，具有刺激性，其粉體與空氣可形成爆炸性混合物，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，遇火星會(huì)發(fā)生爆炸，加熱分解產(chǎn)生易燃?xì)怏w、發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，發(fā)酵效率相對(duì)較低的不足之處，而提出了一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發(fā)酵木薯生產(chǎn)乙醇的方法，該方法選取海藻酸鈉和聚氧化乙烯為載體，代替聚乙烯醇在共固定化酵母菌細(xì)胞和糖化酶上的應(yīng)用。本發(fā)明適用于制備固定化細(xì)胞或固定化酶，采用該法制備的固定化細(xì)胞或酶可用于化工、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，進(jìn)行發(fā)酵、細(xì)胞與酶的增值、核酸提純和DNA分離坐寸ο
[0024]本發(fā)明可應(yīng)用到淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工業(yè)化上，固定化細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)有許多突出優(yōu)點(diǎn):由于大大增加了細(xì)胞濃度，增強(qiáng)了菌體對(duì)外部條件溫度和酸堿度抵抗能力；縮短了發(fā)酵周期，提高反應(yīng)器單位體積生物轉(zhuǎn)化速率；而且由于細(xì)胞被固定，減少了細(xì)胞流失，細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用，并為產(chǎn)物分離等發(fā)酵連續(xù)化和規(guī)?；峁┝朔奖恪?br>[0025]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0026]一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發(fā)酵木薯生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括如下步驟:
[0027](I)發(fā)酵液化醪液的制備:以木薯粉、水和α -淀粉酶為原料，液化溫度為80°C?90 0C，充分?jǐn)嚢璨⒈?0min?160min，控制DE值在16%?22%，然后添加硫酸銨0.25g/L ?0.35g/L、硫酸鎂 0.045g/L ?0.055g/L、磷酸二氫鉀 0.145g/L ?0.155g/L，制得發(fā)酵液化醪液；
[0028](2)糖化酶與酵母固定細(xì)胞的制備:將質(zhì)量濃度為2%?3%海藻酸鈉和0.1%?
0.5%聚氧化乙烯混合制備成凝膠，然后將15U/g?25U/g的液體糖化酶與4g/L?5g/L超級(jí)釀酒高活性干酵母添加制備好的凝膠液中混合，混合均勻后用注射器逐滴滴加到2%?5%的氯化I丐溶液中，形成粒徑3mm?5mm的小球,在3°C?5°C下平衡反應(yīng)靜置過(guò)夜后備用；
[0029](3)將步驟(2)中制備的糖化酶與酵母固定細(xì)胞添加到液化醪液中，pH控制在
4.0?5.0,發(fā)酵溫度在35°C?40°C，固定細(xì)胞的填充率在45%?55%之間，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)150rpm/min，發(fā)酵時(shí)間40h，發(fā)酵終止時(shí)，發(fā)酵濃醪液乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到13%?15%。
[0030]所述木薯粉與水的質(zhì)量比為1:3。
[0031]所述的α -淀粉酶添加量為5U/g?15U/g。