天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶基因SiSQS及其編碼的產(chǎn)物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶基因 SiSQS及其 編碼的產(chǎn)物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2015版《中國藥典》記載天山雪蓮來源于菊科植物天山雪蓮Saussurea involucrate的干燥地上部分，因具有補(bǔ)腎活血和強(qiáng)筋骨的功效，被用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、關(guān)節(jié)疼痛、肺寒咳嗽、腎與小腹冷痛等疾病。雪蓮主產(chǎn)于我國西北、西南等高寒地區(qū)，由 于其生長環(huán)境特殊導(dǎo)致栽培困難，野生天山雪蓮資源處于瀕危狀態(tài)，因此雪蓮細(xì)胞近年來 成為天山雪蓮的替代品。天山雪蓮化學(xué)成分具有多樣性，目前已報道的成分有多糖、黃酮、 生物堿、萜類、木質(zhì)素、留醇及揮發(fā)油等，其中留醇類成分主要為谷留醇。谷留醇是一種 植物留醇，具有明顯降低血清膽固醇的功效，其生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶為鯊烯合酶。
[0003] 藍(lán)稀合酶(Squalene Synthase，SQS)催化兩個分子的法尼基焦磷酸(FPP)生成藍(lán) 烯，它在三萜和留醇的生物合成中起著關(guān)鍵作用。由于鯊烯合酶催化的底物FPP處于異類戊 二烯代謝途徑中的分支點(diǎn)，因此鯊烯合酶的活性能夠直接影響留醇和三萜等類異戊二烯化 合物的生物合成。所以對天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶(SiSQS)基因進(jìn)行研究，能夠?yàn)橥ㄟ^基因工 程技術(shù)提高雪蓮細(xì)胞活性成分谷留醇的含量提供重要技術(shù)支持。但是本領(lǐng)域目前尚未有 關(guān)于天山雪蓮鯊烯合酶基因及其編碼的氨基酸序列的相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶的編碼基因序列及氨基酸序 列。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶基因的應(yīng)用。
[0006]為達(dá)到本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明的發(fā)明人通過對天山雪蓮的基因組進(jìn)行測序 分析和功能研究提供了一種天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶基因 SiSQS，該基因具有（1)或(2)所示 的核苷酸序列：
[0007] (l)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0008] (2)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且表達(dá) 相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0009] 其中，當(dāng)所述基因具有（1)所示的核苷酸序列時，該基因 CDNA的長度為1846bp，開 放讀碼框位于222-1478bp處。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述基因 SiSQS所編碼的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可以為RNA、多肽或蛋白 質(zhì)，優(yōu)選的，所述產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011] 應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的蛋白SiSQS的氨基酸序列，在不影 響其活性的前提下，取代、缺失或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列，該突 變序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供含有所述基因 SiSQS的重組表達(dá)載體。
[0013]本發(fā)明的一個方面還提供了含有所述基因的宿主細(xì)胞。
[0014] 其中，所述宿主細(xì)胞含有所述天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶基因 SiSQS或其重組表達(dá)載 體。本發(fā)明所提供的基因 SiSQS，連接于可以引導(dǎo)外源基因在植物表達(dá)中的表達(dá)載體制備得 到基因 S i SQS的重組表達(dá)載體。優(yōu)選的情況下，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒pGEX-4T-1。本發(fā)明的基 因 SiSQS在構(gòu)建到表達(dá)載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)性 啟動子均可，同時必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。為了便于對轉(zhuǎn)基 因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定和篩選，可以在構(gòu)建載體時對載體進(jìn)行加工，例如加入可選擇 標(biāo)記，通?？墒褂玫臉?biāo)記是對抗生素抗性酶的基因和生物安全標(biāo)記，也可以是⑶S、GFP等可 以產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因等。
[0015] 其中，所述宿主細(xì)胞為天山雪蓮細(xì)胞，具體的，所述宿主細(xì)胞的物種為菊科風(fēng)毛菊 屬植物天山雪蓮Saussurea involucrate，所述宿主細(xì)胞為有價值的活體材料，包括組培獲 得的天山雪蓮細(xì)胞及天山雪蓮植株的細(xì)胞。
[0016] 在本發(fā)明中，所述的宿主細(xì)胞可以為E.coli transetta(DE3)細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的基因 SiSQS的特異性引物對，所述引物對包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物，以及如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
[0018] 所述特異性引物對可以通過聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到基因 SiSQS的核苷酸序 列。
[0019] 本發(fā)明的一個方面涉及所述的基因 SiSQS、載體或宿主細(xì)胞在天山雪蓮及其相近 種屬植物細(xì)胞和/或組織培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0020] 具體可以應(yīng)用于生物合成留醇類或三萜類成分的制備，進(jìn)一步的，所述留醇類成 分為谷留醇。所述相近種屬包括風(fēng)毛菊屬Saussurea和雪蓮亞屬Subgen .Amphi laena (Stschegl·)Lipsch.〇
[0021] 本發(fā)明還提供了所述基因 SiSQS、載體或宿主細(xì)胞在制備三萜類和/或留醇類化合 物中的應(yīng)用;所述應(yīng)用包括在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入SiSQS基因，在宿主細(xì)胞中表達(dá)天山雪蓮細(xì)胞鯊烯 合酶，利用天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶促進(jìn)留醇類化合物的合成。
[0022]其中，所述的留醇類化合物優(yōu)選為β_谷甾醇。
[0023]本發(fā)明的發(fā)明人成功從雪蓮細(xì)胞中克隆出了一種天山雪蓮鯊烯合酶(SiSQS)的編 碼基因，該酶可以應(yīng)用于以法尼基焦磷酸(FPP)為底物制備鯊烯的通路。利用本發(fā)明所提供 的基因可以通過基因工程技術(shù)提高雪蓮細(xì)胞藥效成分谷留醇的含量。
【附圖說明】
[0024]圖1為SiSQS結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測分析(來源于NCBI數(shù)據(jù)庫）；
[0025]圖2為SiSQS系統(tǒng)進(jìn)化樹；
[0026]圖3為表達(dá)本發(fā)明SiSQS基因的重組表達(dá)載體pGEX-S i SQS的圖譜；
[0027]圖4為SiSQS蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。其中泳道1為Protein Ruler Marker 1，泳道2為含有pGEX-4T-l空載體的E.coli Trasetta(DE3)培養(yǎng)物；泳道3為含有 pGEX-Si SQS的E · co 1 i Trasetta (DE3)培養(yǎng)物。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0029]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0030] 試驗(yàn)中使用試劑如T4-DNA連接酶、Marker、大腸桿菌感受態(tài)DH5a和E.coli Trasetta(DE3)、pGEX-4T-l載體以及DNA凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公 司，Taq酶及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司公司，BamH I和Sma I等限 制性內(nèi)切酶購自紐英倫(NEB)生物技術(shù)北京有限公司，其他常用試劑購自寶生物(大連)工 程有限公司（TaKaRa)公司。引物合成和測序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。
[0031] 實(shí)施例1雪蓮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
[0032] 利用Trizol分別提取天山雪蓮細(xì)胞的總RNA，通過Illumina Hiseq2000平臺測序， 總計產(chǎn)出14372403000nt數(shù)據(jù)。組裝結(jié)果總Unigenel48718個，總長138529450nt，平均長度 9311^，陽0達(dá)到1515帥。1]1^86116功能注釋，注釋到順小1'，5￥丨88-?1(^，1^66，邙6,60庫的 Unigene分別是77514個，63458個，49750個，45573個，28939個，55950個，所有注釋上的 Unigene是83169個。預(yù)測編碼蛋白框(CDS)，比對到蛋白庫的CDS有75735個，預(yù)測出的CDS有 5305個，共81040個。通過G0注釋，Blast對比分析以及MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等分析，得到 天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶基因家族序列。
[0033]所述的天山雪蓮細(xì)胞是按照申請?zhí)枮?00510115902.0的發(fā)明專利中記載的方法 獲得，是選取天山雪蓮離體組織，經(jīng)脫分化形成的愈傷組織作為繼代種，給與一定條件進(jìn)行 大規(guī)模繼代培養(yǎng)獲得的紫紅色團(tuán)塊。
[0034] 實(shí)施例2雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶基因的克隆
[0035] SiSQS的克隆利用正向引物:P1:5'ATGGGGAGTTTAAAAGCAGTGTTGA 3'，反向引物P2: 5'TTACAACGTAAGCTTGATTTTATTT 3'，以天山雪蓮細(xì)胞鯊烯合酶SiSQS編碼基因全長序列為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下：10XBuffer 2.5yL，dNTP(2.5mmol · L-^lyL，引物P1和P2 各UiL，Taq DNA聚合酶(5U · L'O^L，模板UiL(約20ng)，其余用無菌雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條 件：94°