國m2p-labs Gmbs)、48孔梅花型 (MTP-48-Flowerplate，LOT 1401-hc_Temp37)板進行高通量酸壓力發(fā)酵測試。
[0236] 發(fā)酵培養(yǎng)基如下：葡萄糖40g/L，硫酸銨10g/L，磷酸0. 6mL/L，氯化鉀0. 8g/L，甜菜 堿0. 4g/L，硫酸鎂1. 2g/L，硫酸錳0. 03g/L，硫酸亞鐵0. 03g/L，玉米漿有機氮0. 4g/L，5 % 消泡劑0. 5mL/L，蘇氨酸0. 2g/L。培養(yǎng)基用氨水調(diào)節(jié)pH至7. 0,其中葡萄糖、硫酸鎂單獨進 行滅菌后添加入培養(yǎng)基中。發(fā)酵測試中發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0,發(fā)酵約6小時后pH降至 6. 0,之后通過補加氨水控制pH維持在6. 0,在BioLector中發(fā)酵共48小時。使用生物傳感 分析儀SBA-40E (山東省科學(xué)院生物研究所）分析發(fā)酵液中賴氨酸· HC1含量。
[0237] 結(jié)果：
[0238] 對于ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒、ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達 盒，發(fā)酵48小時后結(jié)果（以親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的賴氨酸· HC1產(chǎn)量為100 % )如表6所 不。
[0239] 表 6 含 ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒、ybaS-gadB-gadC-evgA
[0240] 四基因抗酸表達盒的產(chǎn)賴氨酸菌株酸壓力發(fā)酵測試
[0241]
[0242] (1)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基和pH 6.0的酸壓力發(fā)酵條件下，含evgA抗酸表達盒 pSevgA-rrnBT的產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)E6的48小時賴氨酸· HC1產(chǎn)量為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的 55. 0 %，低于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)。
[0243] (2)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基和pH 6. 0的酸壓力發(fā)酵條件下，對于含ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒ybaS-rrnBT-gadB-gadC470_rrnBT的產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)YBC1，48小時 賴氨酸· HC1產(chǎn)量為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的66. 3 %，低于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān) ;對于含 ybaS-gadB-gadC-evgA 四基因抗酸表達盒 ybaS-r;rnBT-gadB-gadC47〇-;miBT-pSevgA-;mi BT的產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)YBC1E6,48小時賴氨酸· HC1產(chǎn)量為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的116%，高 于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)。
[0244] (3)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基和pH 6. 0的酸壓力發(fā)酵條件下，對于含ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒ybaS-rrnBT-gadB(H465A/dHT)-gadC470_rrnBT的產(chǎn)賴氨酸菌 株P(guān)YBC2/PYBC3,48小時賴氨酸· HC1產(chǎn)量分別為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的68. 7 %和 87. 4 %，低于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān) ;對于含ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒 ybaS-rrnBT-gadB (H465A/dHT) -gadC470-rrnBT-pSevgA-rrnBT 的產(chǎn)賴氨酸菌株 PYBC2E6/ PYBC3E6,48小時賴氨酸，HC1產(chǎn)量分別為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的72. 4%和70. 0%，低于親 本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)。
[0245] (4)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基和pH 6. 0的酸壓力發(fā)酵條件下，對于含ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒 ybaS-rrnBT-gadB (H465A&E89Q/dHT&E89Q) -gadC470-rrnBT 的產(chǎn)賴 氨酸菌株P(guān)YBC4/PYBC5,48小時賴氨酸· HC1產(chǎn)量分別為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的165% 和215 %，高于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān) ;對于含ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒 ybaS-rrnBT-gadB (H465A&E89Q/dHT&E89Q) -gadC47〇-rrnBT-pSevgA_rrnBT 的產(chǎn)賴氨酸菌 株P(guān)YBC4E6/PYBC5E6,48小時賴氨酸·HC1產(chǎn)量分別為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的43.8%和 68. 7 %，低于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)。
[0246] 對于evgA抗酸表達盒，發(fā)酵48小時后結(jié)果（以親本產(chǎn)賴氨酸菌株的賴氨酸·Η(：1 產(chǎn)量為100% )如表7所示。
[0247] 表7含evgA抗酸表達盒的產(chǎn)賴氨酸菌株酸壓力發(fā)酵測試
[0248]
[0249] (1)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基和pH 6.0的酸壓力發(fā)酵條件下，含evgA抗酸表達盒 pNatevgA-rrnBT的產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)En，48小時賴氨酸· HC1產(chǎn)量為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)的 58. 5 %，低于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)。
[0250] (2)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基和pH 6.0的酸壓力發(fā)酵條件下，含evgA抗酸表達盒 pJJevgA/pIIevgA-rrnBT的產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)E8/PE9,48小時賴氨酸，HC1產(chǎn)量分別為親本產(chǎn) 賴氨酸菌株P(guān)的312%和171%，高于親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān)。
[0251] (3)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基和pH 6.0的酸壓力發(fā)酵條件下，含evgA抗酸表達盒 pQevgA/pZevgA/pVevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pOOevgA-rrnBT 的產(chǎn)賴氨酸菌株 PE1/PE2/PE3/PE4PE5/PE6/PE7/PE10,48小時賴氨酸· HC1產(chǎn)量分別為親本產(chǎn)賴氨酸菌株P(guān) 的88.1%、89.6%、93.3%、77.7%、79.3%、45.1%、68.9%和53.4%，低于親本產(chǎn)賴氨酸 菌株P(guān)。
[0252] 結(jié)論：盡管實施例構(gòu)建的所有抗酸表達盒在轉(zhuǎn)化大腸桿菌后均能提高大腸桿菌的 抗酸性，然而，令人驚奇的是，不同的啟動子、抗酸基因和終止子的不同組合對大腸桿菌發(fā) 酵有顯著不同的影響。對于賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)，表達盒PYBC1E6、PYBC4、PYBC5、PE8、PE9獲 得了意想不到的優(yōu)良效果。
[0253] 參考文獻
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【主權(quán)項】
1. 一種表達盒，其由一或多個啟動子、一或多個抗酸基因和一或多個終止子組成，所述 抗酸基因選自evgA基因、ybaS基因、gadB基因和gadC基因。2. 權(quán)利要求1的表達盒，其在被導(dǎo)入至宿主細胞后能夠提高宿主細胞的抗酸性。3. 權(quán)利要求1的表達盒，其中所述evgA基因編碼SEQ ID NO :68所示的氨基酸序列。4. 權(quán)利要求1的表達盒，其中所述ybaS基因編碼SEQ ID NO :71所示的氨基酸序列。5. 權(quán)利要求1的表達盒，其中所述gadB基因編碼SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76 或 SEQ ID NO :77 所示的氨基酸序列。6. 權(quán)利要求1的表達盒，其中所述gadC基因編碼SEQ ID NO :78所示的氨基酸序列。7. 權(quán)利要求1的表達盒，其中所述啟動子選自SEQ ID NO :1-10所示的啟動子、evgA基 因啟動子、ybaS基因啟動子和gadB基因啟動子。8. 權(quán)利要求7的表達盒，其中所述evgA基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO :67所 示，所述ybaS基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO :70所示，所述gadB基因啟動子的核 苷酸序列如SEQ ID NO :72所示。9. 權(quán)利要求1的表達盒，其中所述終止子為rrnBT終止子。10. 權(quán)利要求9的表達盒，其中rrnBT終止子的核苷酸序列示于SEQ ID NO :69。11. 權(quán)利要求1的表達盒，其從5'到3'由選自SEQ ID NO :1-10和evgA基因啟動子 的啟動子，evgA基因，以及rrnBT終止子組成。12. 權(quán)利要求11的表達盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO :26-36任一所示。13. 權(quán)利要求1的表達盒，其由兩部分組成，第一部分從5'到3'包含ybaS基因啟動 子、ybaS基因和rrnBT終止子，第二部分從5'到3'包含gadB基因啟動子、gadB基因 、gadC 基因和rrnBT終止子。14. 權(quán)利要求13的表達盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO :55-59任一所示。15. 權(quán)利要求1的表達盒，其由三部分組成，第一部分從5'到3'包含ybaS基因啟動 子、ybaS基因和rrnBT終止子，第二部分從5'到3'包含gadB基因啟動子、gadB基因 、gadC 基因和rrnBT終止子，第三部分從5'到3'包含選自SEQ ID NO :1-10和evgA基因啟動子 的啟動子、evgA基因和rrnBT終止子。16. 權(quán)利要求15的表達盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO :62-66任一所示。17. 表達構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1-16任一項的表達盒。18. 重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求1-16任一項的表達盒或權(quán)利要求17的表達構(gòu)建 體。19. 權(quán)利要求18的重組宿主細胞，其是原核生物細胞，優(yōu)選細菌細胞，更優(yōu)選大腸桿菌 細胞。20. 權(quán)利要求18或19的重組宿主細胞，與相應(yīng)的不含所述表達盒或表達構(gòu)建體的細胞 相比，其抗酸性能被提高。21. 權(quán)利要求20的重組宿主細胞，所述抗酸性能包括在酸沖擊下的存活率和在酸壓力 條件下的生長率。22. 通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機酸的方法，所述方法包括： (a)將權(quán)利要求1-16任一項的表達盒或權(quán)利要求17的表達構(gòu)建體導(dǎo)入產(chǎn)有機酸微生 物； (b)對所述微生物進行發(fā)酵；和 (C)收獲所產(chǎn)生的有機酸。23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述有機酸包括氨基酸（賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、谷氨 酸）、丁二酸、檸檬酸和乳酸。24. 權(quán)利要求22或23的方法，其中所述微生物為原核微生物，優(yōu)選細菌，更優(yōu)選大腸桿 菌。25. 高通量篩選用于微生物發(fā)酵的抗脅迫表達盒的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 將待篩選的表達盒導(dǎo)入到所述微生物； (b) 在脅迫沖擊下高通量評估所述微生物的存活率； (c) 用高通量生長測試儀如BioscreenC評估所述微生物在脅迫壓力環(huán)境下的生長率； (d) 用高通量微型發(fā)酵儀器如Biolector評估所述微生物在脅迫壓力環(huán)境下的發(fā)酵性 能；和 (e) 將能夠提高所述微生物的所述存活率和/或所述生長率和/或所述發(fā)酵性能的表 達盒鑒定為可以用于微生物發(fā)酵的抗脅迫表達盒。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程與合成生物學(xué)領(lǐng)域，公開了抗酸表達盒及其篩選方法。具體地說，本發(fā)明涉及大腸桿菌的抗酸表達盒和工業(yè)微生物抗酸表達盒高通量篩選的逐級評估方法，可用于提高工業(yè)微生物在工業(yè)條件下的抗酸和發(fā)酵生產(chǎn)性能。
【IPC分類】C12R1/19, C12N1/20, C12N15/11, C12P7/44, C12P13/22, C12P7/48, C12P7/56, C12P13/14, C12N15/63, C12P13/08
【公開號】CN105647912
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】林章凜, 李日宗, 張艷, 郝小明, 林海龍, 陳博, 羅志波, 蘇會波, 安泰, 鄭鑫, 何太波, 盧宗梅, 吳曉艷
【申請人】清華大學(xué), 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司, 中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司, 中糧集團有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年12月1日