雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法及原生質(zhì)體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法及原生質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)被公認(rèn)為自然界中生產(chǎn)天然4下青素(3，3 ’ -二羥基-β，β ’ -類胡蘿卜素-4，4 ’ -二酮)的最好生物。蝦青素是一種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、消除自由基、增強(qiáng)動(dòng)物免疫、促進(jìn)繁殖、生長、成熟等作用，被應(yīng)用于醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖等各個(gè)領(lǐng)域。近年來，雨生紅球藻已應(yīng)用于大規(guī)模的自養(yǎng)培養(yǎng)中，但由于雨生紅球藻為自養(yǎng)型生物，導(dǎo)致其在培養(yǎng)過程中存在生長緩慢、生物量低、培養(yǎng)條件要求高等問題，嚴(yán)重制約了雨生紅球藻大規(guī)模商業(yè)化高密度培養(yǎng)。利用現(xiàn)代微生物育種技術(shù)選育性狀優(yōu)良的藻株已日益受到關(guān)注。原生質(zhì)體融合、基因工程等育種技術(shù)已成為選育優(yōu)良藻株的有效手段。因此，建立高效的雨生紅球藻原生質(zhì)體的制備技術(shù)及其重要。
[0003]雨生紅球藻的生活周期主要分為進(jìn)行營養(yǎng)生長的綠色游動(dòng)細(xì)胞時(shí)期和積累紅色蝦青素的不動(dòng)細(xì)胞時(shí)期。當(dāng)環(huán)境適宜(如低光照、營養(yǎng)鹽充足等)時(shí)，細(xì)胞為綠色細(xì)胞并且大量繁殖。當(dāng)細(xì)胞處于脅迫條件(如高光照、營養(yǎng)鹽缺乏、高C/N等)時(shí)，細(xì)胞壁增厚、體積增大、細(xì)胞增殖減慢，且因積累大量蝦青素而呈紅色。雨生紅球藻生長十分緩慢，Harker等曾在30L的氣升式(air-lift)光反應(yīng)器中用光和自養(yǎng)方法(不添加有機(jī)碳源)培養(yǎng)雨生紅球藻，三周的時(shí)間內(nèi)，生物量僅達(dá)到15個(gè)/ml。
[0004]藻類的細(xì)胞操作可以追溯到50年代末期，F(xiàn)ushs(1958)利用絲狀藍(lán)藻一一顫藻(Oscillatoria amoena)制備得到原生質(zhì)體。到70年代中后期，其他種類藻原生質(zhì)體的制備也相繼獲得成功:Kobayashi用機(jī)械法擠壓出羽藻(Bryopsis hypnoides)的原生質(zhì)體；1986年，Cheney分離得到江籬(Gracilaria verrucosa)的原生質(zhì)體，并培養(yǎng)成株；1989年，周一紅和王素娟用生物技術(shù)手段分離獲得鶴聘菜(Caloglossalep rieurii)原生質(zhì)體并培養(yǎng)成株。1990年，Saga和Sakai分離到海帶(Laminaria Japonica)、巨藻(Macrocystis)和馬尾藻(Sargassum horueri)的原生質(zhì)體，并把巨藻和馬尾藻的原生質(zhì)體培養(yǎng)成株。1993年，GalI等分離到了長紫菜(porphyra crispata)的原生質(zhì)體，并觀察了其中間及最終再生形態(tài)。1996年，查向東等利用褐藻膠酶和纖維素酶獲得裙帶菜配子體原生質(zhì)體，并經(jīng)4-5周再生成為同普通配子體大小和形狀相同的新的配子體。
[0005]早期酶法制備原生質(zhì)體過程中的酶主要來源于生物體內(nèi)，如微生物來源的海藻解壁酶、動(dòng)物來源的海藻解壁酶。目前，廣泛用于原生質(zhì)體制備的酶主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、崩潰酶、離析酶等。范寰等(一種白腐真菌的原生質(zhì)體制備方法，中國專利200910228483X)采用蝸牛酶酶解分離一種酵母菌的原生質(zhì)體，β-巰基乙醇預(yù)處理?xiàng)l件下，原生質(zhì)體形成率可達(dá)90%-96 %。
[0006]根據(jù)不同藻類細(xì)胞壁成分的不同，各種多糖水解酶如纖維素酶、蝸牛酶、果膠酶、離析酶等被廣泛應(yīng)用于微藻原生質(zhì)體的制備中。魏東等(葡萄藻原生質(zhì)體的制備及葡萄藻原生質(zhì)體制備率檢測方法，中國專利201410312883Χ)提出采用纖維素酶、果膠酶及離析酶的復(fù)合酶溶液來制備葡萄藻原生質(zhì)體的方法，但并未提及制備效率。
[0007]對(duì)于雨生紅球藻而言，其細(xì)胞壁是由糖蛋白分子以及少量的纖維素和幾丁質(zhì)組成，所以Tjahjono于1993年提出以蛋白酶K來制備原生質(zhì)體。隨后在2004年王明茲等(雨生紅球藻原生質(zhì)體制備與再生技術(shù)，中國專利2004100075358)用酸性緩沖液、EDTA和二硫蘇糖醇配制而成的預(yù)處理劑處理雨生紅球藻細(xì)胞，然后以纖維素酶、蝸牛酶、果膠酶和酸性緩沖液組成的復(fù)合高滲酶溶液來分離得到原生質(zhì)體，制備率可達(dá)80%。但是，在雨生紅球藻生活史中存在多種細(xì)胞類型，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及組成均存在較大差異。上述專利中原生質(zhì)體制備方法并未針對(duì)雨生紅球藻生活史中特定細(xì)胞，且需要進(jìn)行破壁預(yù)處理，方法繁瑣，耗時(shí)較長，所需酶種類較多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以快速獲得富集化的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種利用雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞制備原生質(zhì)體的方法，用以制備雨生紅球藻原生質(zhì)體。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0011]本發(fā)明技術(shù)方案的提出，是基于發(fā)明人認(rèn)為在雨生紅球藻的生活史中存在游動(dòng)細(xì)胞和不動(dòng)細(xì)胞兩種細(xì)胞，這兩種細(xì)胞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上存在很大差異，游動(dòng)細(xì)胞的原生質(zhì)不含有纖維素層，僅被一層透明的凝膠狀細(xì)胞層所包被，而不動(dòng)細(xì)胞則存在厚而致密的纖維素化細(xì)胞壁層，因而通過游動(dòng)細(xì)胞制備原生質(zhì)體應(yīng)要明顯優(yōu)于不動(dòng)細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明的第一方面，提供一種雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括將雨生紅球藻在含有乙酸鈉、酵母提取物和其他無機(jī)營養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
[0013]上述培養(yǎng)基中，乙酸鈉濃度為0.5-3g/L，酵母提取物濃度為0.5-3g/L;其中，乙酸鈉不僅為紅球藻提供異養(yǎng)的有機(jī)碳源，而且還明顯導(dǎo)致藻細(xì)胞光自養(yǎng)的光合綜合性能指數(shù)發(fā)生改變;酵母提取物為普通市售酵母提取物，含有氨基酸、核苷酸、肽、B族維生素、微量元素、各種形式的氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì)，可明顯促進(jìn)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞的快速增殖。
[0014]上述培養(yǎng)基中，所述其他無機(jī)營養(yǎng)包含:硝酸鈉1000mg/L，七水硫酸鎂75mg/L，二水氯化媽3611^凡，磷酸二氫鉀40mg/L，碳酸鈉20mg/L，梓檬酸6mg/L，梓檬酸鐵錢3mg/L，乙二胺四乙酸鈉lmg/L，七水硫酸鋅0.22mg/L，五水硫酸銅0.08mg/L，四水氯化猛1.8lmg/L，二水鉬酸鈉0.39mg/L，六水硝酸鈷0.05mg/L，硼酸2.86mg/L。
[0015]上述培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)的條件為:培養(yǎng)溫度為20-25°C、光照強(qiáng)度為30-60ymol m—2S.1,培養(yǎng)時(shí)間為3-6天。
[0016]采用上述的培養(yǎng)方法，獲得的雨生紅球藻的游動(dòng)細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的85%以上，細(xì)胞密度可達(dá)15個(gè)/ml以上。
[0017]本發(fā)明的第二方面，提供一種利用游動(dòng)細(xì)胞制備原生質(zhì)體的方法，包括:將雨生紅球藻的游動(dòng)細(xì)胞以一定初始密度重懸于含有膠原蛋白酶的緩沖液中進(jìn)行酶解的步驟和制備雨生紅球藻原生質(zhì)體懸液的步驟。
[0018]上述方法中，所述膠原蛋白酶選自膠原蛋白酶I，II，III或IV類型。
[0019]上述方法中，所述膠原蛋白酶的濃度為0.2-0.6%(m/v)。
[0020]上述方法中，所述酶解的條件為:在35±1°C和10rpm轉(zhuǎn)速下酶解15-60分鐘。
[0021]上述方法中，制備雨生紅球藻原生質(zhì)體懸液的步驟具體為:離心收集酶解后的細(xì)胞，利用緩沖液進(jìn)行洗滌，然后重懸在緩沖液中，獲得雨生紅球藻原生質(zhì)體懸液。
[0022]上述方法中，緩沖液中主要成分為:0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCKpH 7.8)。
[0023]上述方法中，游動(dòng)細(xì)胞的初始密度為0.5-3X 15個(gè)/ml。
[0024]本發(fā)明的有益效果:
[0025](I)本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基成分及其培養(yǎng)條件，可用于快速富集培養(yǎng)獲得雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，獲得的雨生紅球藻的游動(dòng)細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的85%以上，細(xì)胞密度可達(dá)15個(gè)/ml以上，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻的大量繁殖。
[0026](2)本發(fā)明還提供了一種利用雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞制備原生質(zhì)體的方法，通過含有膠原蛋白酶成分的酶解液，可以高效處理獲得雨生紅球藻原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的得率最尚可達(dá)88 %以上。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面通過具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0028]實(shí)施例1
[0029]將雨生紅球藻(SCCAP K-0084)不動(dòng)細(xì)胞接種于含0.5g/L乙酸鈉和3g/L酵母提取物的8611培養(yǎng)基中(8611培養(yǎng)基中含有硝酸鈉100011^/1，七水硫酸鎂7511^/1，二水氯化鈣3