一種去除構樹葉片蛋白質中RuBisco蛋白的方法
【技術領域】
[000?]本發(fā)明屬于蛋白質分離檢測領域，涉及一種去除構樹葉片蛋白質中RuBisco蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]構樹是一種多功能綜合性樹種，整個植株都具有開發(fā)潛力。其葉片含有豐富的粗蛋白、粗脂肪和粗纖維等營養(yǎng)成分，可以部分替代豆柏、麥麩等常規(guī)飼料，用于豬、牛、羊等家畜養(yǎng)殖。在我國飼料行業(yè)的配方技術結構仍以玉米-豆柏型為主。豆柏、玉米等大宗原料對外依存度越來越高，受國際市場影響愈來愈大。因此，如何突破現(xiàn)有的配方技術，開發(fā)新的原料和替代品，成為增強企業(yè)綜合實力，提高競爭力的重要挑戰(zhàn)。構樹葉片正是解決這一問題的關鍵。2015年構樹扶貧以列為國務院十大精準扶貧項目之一。
[0003]雙向凝膠電泳技術作為研究植物蛋白質組的重要手段，為生物技術手段進行品種改良提供重要理論依據(jù)。在雙向凝膠電泳技術(2-DE)中，RuBisco這種超高豐度的蛋白會嚴重限制低豐度蛋白的檢測。主要有三方面的影響:一方面蛋白上樣量有限，低豐度蛋白因為含量太少在后續(xù)的染色過程中不能顯現(xiàn)；另一方面是RuBisco的位置效應，RuBisco蛋白會掩蓋周圍的低豐度蛋白；第三是在雙向上整體干擾其它蛋白的正常電泳分離，其周圍蛋白點的泳道變化最為明顯。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種去除植物葉片蛋白質中RuBisco蛋白的方法。
[0005]本發(fā)明所提供的去除植物葉片蛋白質中RuBisc0蛋白的方法，是利用濃度為300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液去除植物葉片蛋白質中RuBisco蛋白。
[0006]進一步，所述去除植物葉片蛋白質中RuBisco蛋白的方法，可包括如下步驟:
[0007](I)將植物葉片放入GMI勻漿液中研磨后得到第一勻漿，將GMII勻漿液加入到所述第一勻漿中研磨后得到第二勻漿；
[0008]所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質及濃度為:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF ；
[0009]所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液，溶質及濃度為:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和3-5% (體積百分含量)Nonidet P-40；
[0010]其中，pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液為本領域常規(guī)表示方法，指400-600mM Tris溶液用HCl調pH至7-9的緩沖液。
[0011](2)將所述第二勻漿于4°C8000-12000g離心5min-15min，取上清，記為第一上清液；
[0012](3)向所述第一上清液中加入等體積的濃度為300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶劑為去離子水)，冰上靜置20min-40min，于4°C8000-12000g離心5min_15min，取上清，記為第二上清液；
[0013](4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4體積的濃度為400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶劑為去離子水)，冰上靜置30min-50min，于4°C8000-12000g離心5min-15min，棄上清，得蛋白粗沉淀；
[0014](5)向所述蛋白粗沉淀中加入4°C預冷的溶液A，于4°C8000-12000g離心5min-15min，棄上清，得沉淀，完成一次洗滌;重復所述洗滌的步驟至少一次，最后一次所得沉淀即為去除了RuBisco蛋白的植物葉片蛋白；
[0015]所述溶液A的溶劑為丙酮，溶質及濃度為10g/L二硫蘇糖醇(DTT)。
[0016]在所述方法的步驟(I)中，所述植物葉片、所述GMI勻漿液與所述GMII勻漿液的使用配比可為0.58:500-70(^1^500-70(^1^步驟(1)中所述植物葉片與步驟(3)中所述PEG4000溶液的使用配比可為0.5g: 1000-2000yL。步驟(I)中所述植物葉片與步驟(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比可為0.5g: 400-600yL。步驟(5)中，進行所述洗滌時，所述蛋白粗沉淀與所述溶液A的體積配比可為I:(3-5)。
[0017]進一步，在所述方法的步驟(I)中，所述植物葉片、所述GMI勾楽液與所述GMn勾楽液的使用配比具體為0.5 g: 6 O O μ L: 6 O O μ L。步驟(I)中所述植物葉片與步驟(3)中所述PEG4000溶液的使用配比具體為0.5g: 1500yL。步驟(I)中所述植物葉片與步驟(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比具體為0.5g:500yL。步驟(5)中，進行所述洗滌時，所述蛋白粗沉淀與所述溶液A的體積配比具體為1:4。
[0018]在本發(fā)明中，所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為8的500mMTris-HCl緩沖液，溶質及濃度具體為:20mM MgCl2和ImM PMSF。所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為8的500mM Tris-HCl緩沖液，溶質及濃度具體為:20mM MgCl2、lmM PMSF和4% (體積百分含量)Nonidet P-40。
[0019]在所述方法的步驟(2)-步驟(5)中，所述離心均具體為4°C1000g離心lOmin。
[0020]在所述方法的步驟(3)中，所述冰上靜置的時間具體為30min。步驟(4)中，所述冰上靜置的時間具體為40min。
[0021]在本發(fā)明的一個實施例中，步驟(5)中，共進行所述洗滌2次。
[0022]本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于去除植物葉片蛋白質中RuBisc0蛋白的成套
τ?: 口廣PR ο
[0023]本發(fā)明所提供的用于去除植物葉片蛋白質中RuBisc0蛋白的成套產(chǎn)品，含有如下:
[0024](al)GMI 勻漿液；
[0025]所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質及濃度為:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF；
[0026]在本發(fā)明中，所述GMI勻漿液的溶劑為pH值為8的500mMTris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質及濃度具體為:20mM MgCl2和ImM PMSF。
[0027](a2)GMII 勻漿液；
[0028]所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為7-9的400-600mM Tris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質及濃度為:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和3-5% (體積百分含量)NonidetP-40；
[0029]在本發(fā)明中，所述GMII勻漿液的溶劑為pH值為8的500mMTris-HCl緩沖液(用去離子水配制)，溶質及濃度具體為:20mM MgCl2UmM PMSF和4% (體積百分含量)Nonidet P-40 ο
[0030](a3)濃度為300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶劑可為水)；
[0031](a4)濃度為400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶劑可為水)；
[0032](&5)溶液八；
[0033]所述溶液A的溶劑為丙酮，溶質及濃度為10g/L二硫蘇糖醇(DTT)。
[0034]所述方法或所述成套產(chǎn)品在分離植物葉片蛋白質中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0035]在所述應用中，具體是采用蛋白質雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳進行植物葉片蛋白質的分離的。所述采用蛋白質雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳進行植物葉片蛋白質的分離的方法可包括如下步驟:
[0036](a)將步驟(5)所得沉淀(即采用上述去除植物葉片蛋白質中RuBisc0蛋白的方法獲得的去除了RuBisco蛋白的植物葉片蛋白)進行第一向等電聚焦電泳；
[0037](b)待步驟(a)的第一向等電聚焦電泳結束后取出膠條，進行膠條平衡；
[0038](c)將經(jīng)步驟(b)平衡后的膠條進行第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；
[0039](d)待步驟(C)的第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后取出凝膠，進行考馬斯亮藍染色，對染色結果進行掃描及圖像分析，完成植物葉片蛋白質的分離。
[0040]在所述方法的步驟(a)中，進行所述第一向等電聚焦電泳的方法可包括如下步驟:將步驟(5)所得沉淀(即采用上述去除植物葉片蛋白質中RuBisc0蛋白的方法獲得的去除了RuBisco蛋白的植物葉片蛋白)經(jīng)裂解液(溶劑為去離子水，溶質及濃度如下:7M尿素、2M硫脲、40g/L CHAPS和體積百分比2%的Pharmalyte pH3_10)溶解，12000g離心后，取上清液按照如下條件進行等電聚焦電泳:電壓200V電泳30分鐘，電壓400V電泳15小時，電壓800V電泳I小時。
[0041]在所述方法的步驟(b)中，進行所述膠條平衡的方法具體可包括如下步驟:將所述膠條移入SDS上樣緩沖液(溶劑為pH6.8的62.5mM Tris-HCl緩沖液，溶質及濃度如下:體積百分比10%甘油、25g/L SDS、10g/L二硫蘇糖醇和0.1g/L溴酚藍)中平衡30分鐘。
[0042]在所述