Hla g修飾的細(xì)胞及方法
【專利說明】HLA G修飾的細(xì)胞及方法
[0001] 相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年7月31日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/677,739的優(yōu)先權(quán) 益，其W引用方式全文納入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 細(xì)胞移植形式的再生醫(yī)學(xué)是可用于治療疑難醫(yī)學(xué)病況例如糖尿病、屯、臟病和神經(jīng) 退行性疾病的最有希望的治療方法之一。但是，臨床中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞移植的主要障礙是供體細(xì) 胞的免疫排斥，特別當(dāng)其來自外源宿主時(shí)。雖然通過給予免疫抑制藥物可部分地解決免疫 排斥，然而其也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此，需要開發(fā)改進(jìn)的技術(shù)用于細(xì)胞移植治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了基于細(xì)胞的組合物和基于在將要被移植到需要供體細(xì)胞的受試者 中的供體細(xì)胞中長(zhǎng)期強(qiáng)制表達(dá)至少一種外源HLA-G蛋白進(jìn)行細(xì)胞移植治療的方法。本發(fā)明 提供的數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)本發(fā)明所述方式修飾可表達(dá)外源HLA-G的細(xì)胞(無論多能性的或分化型 的）具有減低的免疫原性和/或增加的免疫抑制。通過HLA-G遺傳修飾產(chǎn)生的減低的免疫原 性和/或增加的免疫抑制能力是穩(wěn)定的并且可持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間，包括貫穿分化過程。運(yùn)意味著本 發(fā)明的HLA-G修飾的細(xì)胞可作為通用的供體細(xì)胞或組織（即，減少或排除供體細(xì)胞和受體之 間I類和II類經(jīng)典人白細(xì)胞抗原化LA)分子配型的需要)用于多種損傷、疾病或病癥。
[0005] 相應(yīng)地，本發(fā)明一方面是遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞化LA-G修飾的細(xì)胞），其與不含 所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比在異體移植受體(an allogeneic recipient)中具有減 低的免疫原性和/或能夠提供增加的免疫抑制，其中（i)所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包 含：（a)外源核酸(例如表達(dá)載體），其包含編碼與人HLA-G具有至少85%氨基酸序列同一度 的HLA-G蛋白并且含有可減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體循環(huán)途徑中HLA-G存留的一種或多種氨基酸 突變的核酸序列，和/或（b)不含microRNA結(jié)合位點(diǎn)的3'UTR(非翻譯區(qū)）序列例如SEQ ID NO:3或不含SEQ ID NO:4的序列;并且Qi)編碼的HLA-G蛋白是由遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)至少7周(例如至少20周或至少50周）。
[0006] 另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其與不含所述遺傳 修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比具有減低的免疫原性和/或改進(jìn)的免疫抑制，其中（i)所述遺傳修 飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有外源核酸，其包括：（a)核酸序列(例如SEQ ID NO: 2)，其編碼與同義 野生型人HLA-G(例如SEQ ID NO: 1)具有至少95%氨基酸序列同一度的HLA-G蛋白，并且含 有可減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體循環(huán)途徑中HLA-G存留的一種或多種氨基酸突變;和化)3'非翻 譯區(qū)化TR)(例如SEQ ID N0:3)，其與同義野生型人HLA-G基因的3'非翻譯區(qū)序列具有至少 85%的同一度，并且不含SEQ ID NO:4;并且Qi)編碼的HLA-G蛋白是由遺傳修飾的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞表達(dá)至少7周。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的細(xì)胞具有減低的免疫原性和/或改進(jìn)的免疫抑制， 如果其顯示出：（1)與不含所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，遺傳修飾的細(xì)胞的NK-92細(xì) 胞毒性減低，（2)與不含所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，遺傳修飾細(xì)胞的體外的外周血 單核細(xì)胞增殖減低，和/或(3)在人源化NSG小鼠中，與不含所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相 比，遺傳修飾的細(xì)胞增加腫瘤形成的大小和重量。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與異體移植受體相比在一種或多種 HLA抗原中不具有匹配（即，相同的等位基因），其中所述HLA抗原選自HLA-A、HLA-B、HLA-C、 HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在某些實(shí)施方案中，遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與異體移植受體相 比在一種或多種HLA抗原中只有1、2、3、4或5種匹配，其中所述HLA抗原選自化A-A、HLA-B、 HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與異體移植 受體的 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR不匹配。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的細(xì)胞包括不含可減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體循環(huán)途徑 中HLA-G存留的一種或多種氨基酸突變的HLA-G轉(zhuǎn)基因（即HLA-G野生型同義序列，例如SEQ ID N0:1)，但是具有包括不含microRNA結(jié)合位點(diǎn)的3'UTR(非翻譯區(qū)）序列例如SEQ ID N0:3 或不含SEQ ID NO:4的序列的HLA-G轉(zhuǎn)基因。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，可減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體循環(huán)途徑中HLA-G存留的一種或多 種氨基酸突變包括雙賴氨酸化K)基序突變。在一些實(shí)施方案中，所述KK基序突變包括K334A 突變、K335A突變或其二者。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，在遺傳修飾的細(xì)胞中表達(dá)的外源核酸包括不含SEQ ID N0:4 的3'UTR序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述外源核酸的3'UTR序列不包括SEQ ID N0:4,所述 核酸序列含有SEQ ID NO:3。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，表達(dá)的HLA-G存在于遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面上。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì) 胞、猴細(xì)胞或豬細(xì)胞。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是干細(xì)胞、祖細(xì)胞或者由干細(xì) 胞或祖細(xì)胞直接分化產(chǎn)生的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是導(dǎo) 入外源HLA-G轉(zhuǎn)基因之前已經(jīng)分化(天然地或體外）的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述遺傳修 飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是干細(xì)胞(例如多能干細(xì)胞）。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述遺傳修飾的哺 乳動(dòng)物細(xì)胞是干細(xì)胞時(shí)，所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞或者全能干細(xì)胞。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述遺 傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。又一個(gè)實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞不屬于免疫系統(tǒng)細(xì)胞類型。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是通 過干細(xì)胞或祖細(xì)胞體外分化獲得的細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞或祖細(xì)胞是經(jīng)過遺傳修飾然后體 外分化的。
[0015] 在另外的實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的細(xì)胞是完全分化的細(xì)胞、表皮祖細(xì)胞、膜腺 祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、多能干細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì) 胞、屯、肌細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或膜腺巧且細(xì)胞。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，當(dāng)遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的外源核酸是表達(dá)載體時(shí)，所 述表達(dá)載體是轉(zhuǎn)座子載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述外源核酸是表達(dá) 載體時(shí)，所述表達(dá)載體是打祀載體，并且所述遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是通過同源重組所 述打祀載體獲得的。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體還可包括編碼報(bào)告蛋白例如綠色巧 光蛋白（GFP)的核酸序列。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述外源核酸還包括運(yùn)樣的核酸序列：（i)與人HLA-G基因的 3'非翻譯區(qū)序列具有至少85%同一度的核酸序列；和（ii)在其3'非翻譯區(qū)含有至少1個(gè)突 變，所述突變可抑制同源mi croRNA與含有突變結(jié)合位點(diǎn)的mRNA中的突變位點(diǎn)的結(jié)合。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，提供了含有所述遺傳修飾細(xì)胞的人工組織。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包括（i)編碼與人化A-G具有至少85%同 一度的氨基酸序列的第一核酸序列；和（ii)與人化A-G基因的3'非翻譯區(qū)序列具有至少 85%同一度并且可操作地連接到所述第一核酸序列的第二核酸序列，其中所述氨基酸序列 包含可減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體循環(huán)途徑中HLA-G存留的突變并且所述第二核酸序列的3'非 翻譯區(qū)包含可抑制同源microRNA與含有突變結(jié)合位點(diǎn)的mRNA結(jié)合的至少1個(gè)突變。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述分離核酸3'非翻譯區(qū)序列不含SEQ ID N0:4。在一個(gè)實(shí)施 方案中，當(dāng)所述3'非翻譯區(qū)序列不含SEQ ID N0:4時(shí)，所述3'非翻譯區(qū)序列包含SEQ ID NO: 3。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，提供了包含分離的核酸和可操作地連接到所述第一核酸序列 的啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子在干細(xì)胞中不是沉默的。在一些實(shí)施方案 中，所述啟動(dòng)子包含中國倉鼠 EF-la(C肥F-Ia)啟動(dòng)子或人EF-化啟動(dòng)子的核酸序列。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述CHEF-Ia啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:7。另外的實(shí)施方案中，用于驅(qū)動(dòng)HLA-G轉(zhuǎn) 基因表達(dá)的啟動(dòng)子是組織或細(xì)胞類型選擇性啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物表 達(dá)載體含有編碼報(bào)告蛋白的第=核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是 轉(zhuǎn)座子載體。在一些實(shí)施方案中，提供了含有哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，提供了分離的核酸，其包括：（i)編碼與人HLA-G具有至少95% 同一度的氨基酸序列的第一核酸序列，其中所述氨基酸序列包含可減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體 循環(huán)途徑中HLA-G存留的突變;和（ii)與人HLA-G基因的3'非翻譯區(qū)序列具有至少95%同一 度并且可操作地連接到所述第一核酸序列的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列的3'非 翻譯區(qū)包含可抑制同源microRNA與含有突變結(jié)合位點(diǎn)的mRNA結(jié)合的至少1個(gè)突變。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述第一核酸序列編碼SEQ ID N0:2的氨基酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 第二核酸序列不含SEQ ID N0:4。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二核酸序列包含SEQ ID N0:3。 另一個(gè)實(shí)施方案中，提供的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有所述第一和第二核酸序列，并且還含有 可操作地連接到所述第一核酸序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子在干細(xì)胞或由干細(xì)胞分化產(chǎn) 生的細(xì)胞中不是沉默的。所述啟動(dòng)子可含有中國倉鼠 EF-化啟動(dòng)子的核酸序列。另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體還含有編碼報(bào)告蛋白的核酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是轉(zhuǎn)座子載體。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有圖1所示 的所有元件。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其包括：（a)中國倉鼠 EF-Ia啟動(dòng) 子，（b)可操作地連接到所述啟動(dòng)子并且編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO: 2的人HLA-G的核 酸序列，和(C)含有SEQ ID N0:3的3'UTR序列。在一些實(shí)施方案中，提供了遺傳修飾的哺乳 動(dòng)物細(xì)胞，其包含運(yùn)樣的表達(dá)載體。
[0024] 在多個(gè)實(shí)施方案中，將HLA-G修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人HLA-G修飾的細(xì)胞)施用 至遭受多種病況中的任意病況的受試者，所述病況包括但不限于屯、血管疾病、眼病(例如黃 斑變性）、耳病(例如耳聾）、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、阿爾茨海默氏病、帕金森病、多發(fā)性硬 化、骨質(zhì)疏松癥、肝病、腎病、自身免疫疾病、關(guān)節(jié)炎、牙銀疾病、牙齒病況或增生性病癥(例 如腫瘤）。其他實(shí)例中，受試者正遭受或處于遭受急性健康病況例如中風(fēng)、脊髓損傷、燒傷或 創(chuàng)傷的高風(fēng)險(xiǎn)。其他實(shí)例中，受試者正遭受組織損失例如脂肪萎縮Qipatrophy)或者年齡 相關(guān)的膠原損失。其他實(shí)例中，受試者遭受非愈合性潰瘍或者需要試劑W輔助缺陷例如尿 道下裂和尿道上裂的閉合。其他實(shí)例中，受試者需要持久或暫時(shí)的皮膚移植用于傷口愈合 或皮膚替代。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了細(xì)胞或組織修復(fù)或再生的通用方法用于有需要 的受試者，所述方法包括將含eHLA-G修飾的細(xì)胞群的細(xì)胞或組織組合物注射或移植到受試 者，其中與eHLA-G修飾的細(xì)胞群相比所述受試者具有至少1種不匹配的經(jīng)典I類化A或II類 化A分子，并且其中所述eHLA-G修飾的細(xì)胞群與不含所述eHLA-G修飾的相同類型細(xì)胞相比 顯示出減低的免疫原性和/或改進(jìn)的免疫抑制。所述減低的免疫原性和/或改進(jìn)的免疫抑制 可W確定，例如通過在NK-92細(xì)胞毒性測(cè)定、人源化NSG腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定和/或PBMC增殖測(cè)定中 比較eHLA-G修飾細(xì)胞與不含所述eHLA-G修飾的相同類型對(duì)照細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述遺傳修飾的細(xì)胞群包括e化A-G遺傳修飾的人真皮成纖維細(xì)胞群。另一個(gè)實(shí)施方案中，遺 傳修飾的細(xì)胞群包括eHLA-G遺傳修飾的人表皮祖細(xì)胞群。另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的 細(xì)胞群包括eHLA-G遺傳修飾的人間質(zhì)干細(xì)胞群。另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的細(xì)胞群包 括eHLA-G遺傳修飾的人胚胎干細(xì)胞群。另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的細(xì)胞群包括由eHLA-G遺傳修飾的人胚胎干細(xì)胞體外分化產(chǎn)生的細(xì)胞群。另外的實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的細(xì) 胞群未被受試者的免疫系統(tǒng)排斥至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、36、48或52周。
[0026] 另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可再生皮膚的方法用于需要其的受試者，所述 方法包括將細(xì)LA-G修飾的皮膚成纖維細(xì)胞群和/或eHLA-G修飾的胚胎表皮祖細(xì)胞群注射至 受試者皮膚損傷的位點(diǎn)，其中與eHLA-G修飾的皮膚成纖維細(xì)胞群和/或eHLA-G修飾的胚胎 表皮祖細(xì)胞群相比所述受試者具有至少1種不匹配的經(jīng)典I類HLA或II類HLA分子。
[0027] 另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了細(xì)胞治療方法，其包括向需要其的受試者施用本發(fā)明 的含外源人的-微球蛋白（的m)分子和細(xì)LA-G轉(zhuǎn)基因的遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群。
【附圖說明】
[00%]圖1示出了增強(qiáng)的HLA-G (eHLA-G)轉(zhuǎn)基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的非限制性實(shí)施方案的 示意圖，其含有：憐酸甘油酸醋激酶(PGK)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的選擇標(biāo)記（新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶）； "INS"側(cè)翼絕緣子（insulator)元件；中國倉鼠 EF-Ia啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)eHLA-G表達(dá);PGK啟動(dòng)子， 驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá);和5 '末端重復(fù)(TR)轉(zhuǎn)座子元件。細(xì)LA-G轉(zhuǎn)基因包含可增強(qiáng)HLA-G蛋白表達(dá)尤 其是細(xì)胞表面表達(dá)的突變組合和/或非編碼元件(例如啟動(dòng)子或修飾的3'UTR)。對(duì)于本發(fā)明 的實(shí)驗(yàn)，所述eHLA-G轉(zhuǎn)基因上述元件，并且更具體地包括具有HLA-G的ER滯留基序化334A/ K335A)突變和2化LA-G的3'UTR microRNA結(jié)合位點(diǎn)突變的如沈Q ID NO:2所示的人HLA-G編 碼序列，其中所述修飾的3'UTR具有如SEQ ID N0:3所示的序列。具體描述見實(shí)施例3。
[0029]圖2示出了用于驅(qū)動(dòng)共轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體基因組整合的轉(zhuǎn)座酶表達(dá)輔助載體 的非限制性實(shí)施方案的示意圖。
[0030] 圖3示出了用可驅(qū)動(dòng)eHLA-G和EGFP表達(dá)的轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后多個(gè)時(shí)間 電的人ES細(xì)胞克隆的巧光顯微圖像。
[0031] 圖4(上圖）示出了描述使用含EGFP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的hES細(xì)胞起始數(shù)與轉(zhuǎn)染10天 后在細(xì)胞群中檢測(cè)的部分EGFP+細(xì)胞之間關(guān)系的柱狀圖。X軸的數(shù)值是每5 X IO5個(gè)細(xì)胞中的 GFP+克隆數(shù)。y軸數(shù)值是細(xì)胞數(shù)。（下圖）示出了描述多種轉(zhuǎn)座子載體(使用不同啟動(dòng)子)和所 述細(xì)胞群中檢測(cè)的部分EGFP+細(xì)胞之間關(guān)系的柱狀圖。X軸的數(shù)值是每5X IO5個(gè)細(xì)胞中的GFP +克隆數(shù)。下圖中，自左至右為：對(duì)照（con)、GFP-puro(轉(zhuǎn)染載體大小為7.3kb)、姐LA-G (MSCV)-GFP-puro (轉(zhuǎn)染載體大小為8.化b)和eHLA-G化F-1 a)-GFP-puro (轉(zhuǎn)染載體大小為 9.2化）。另外還進(jìn)行了6化4-6化。-1〇)-6。?-9111'〇轉(zhuǎn)讓效率實(shí)驗(yàn)(未示出），其顯示在轉(zhuǎn)染后 10天且嚷嶺霉素選擇10天后W溶液V和程序B16獲得最高的效率(每5 X IO5個(gè)細(xì)胞中~500 個(gè)GFP+克?。?。
[0032] 圖5示出了顯示HLA-G修飾的人ES細(xì)胞中HLA-G表達(dá)和DAPI染色（上圖）、0ct 3/4和