μL，PCR產(chǎn) 物4yl，CEL 頂每0.5yl，ddH2〇 4·5μ1 混勻，45°C下酶切30min，0.25M EDTA(PH8.0)終止酶切 反應(yīng)。
[0031 ] (4)毛細(xì)管電泳檢測(cè)突變體
[0032] 利用毛細(xì)管電泳儀FA96(美國AATI公司）和配套試劑盒(DNF-910,35-1500bp)進(jìn) 行，運(yùn)行條件為充入Marker injection 5sec，電壓7.5kv;充入樣品30sec,電壓10kv,電壓 預(yù)電泳9kv，運(yùn)行電泳9kv，運(yùn)行時(shí)間80min，對(duì)675個(gè)四倍池混合DNA樣品上樣，篩選到21個(gè)突 變體，圖2是第二個(gè)混合池(共95個(gè)樣品）篩選結(jié)果，該混合池含有5個(gè)突變。對(duì)所有21個(gè)突變 體對(duì)應(yīng)的84個(gè)單個(gè)DNA再進(jìn)行分別上樣，得到突變體的M2代單株。
[0033] (5)突變體分析
[0034] 通過 PRO VEAN Protein (http: //pro vean · jcvi · org/seq_submit .php)在線軟件對(duì) 突變位點(diǎn)的功能損失預(yù)測(cè)，PROVEAN得分小于-2.5被認(rèn)為會(huì)影響基因功能，是有害的，大于-2.5被認(rèn)為是中性的或者突變可忍耐。編號(hào)為4216的突變體在核苷酸從5'端第116位由G突 變成A，Proven值為-6 · 671 (表1)。
[0035] 表1 CYP82E4突變體篩選與分析
[0036]
[0037] (6)CYP82E4純合突變體CYP82E4-1的降煙堿含量分析
[0038]突變體4216命名為CYP82E4-1，自交，收獲并種植M3代，提取M3代DNA，檢測(cè)突變位 點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)在M3代中表現(xiàn)穩(wěn)定，并獲得5個(gè)純合突變體(表2)。純合突變體分別自交， 對(duì)CYP82E4-1的5個(gè)純合突變材料和野生型中煙100、K326、NC82在溫室生長(zhǎng)，現(xiàn)蕾期打頂，打 頂后45天取樣，常規(guī)烤干，用氣象色譜儀HP-6890測(cè)定降煙堿以及其他生物堿的含量(結(jié)果 如表3所示），分析表明三個(gè)烤煙品種第三葉位的降煙堿含量占干重的0.9%以上，第九葉位 占干重的0.7%以上，而突變體CYP82E4-1第三葉位的平均降煙堿含量為0.042%，第九葉位 的降煙堿平均含量為0.037%，與對(duì)照（中煙100)相比，降煙堿含量降低了50%左右。
[0039] 表2 4216突變體M3代遺傳分析
[0040]
[0041] 表3 CYP82E4-1和其他烤煙的主要生物堿含量
[0042]
[0043] 主要生物堿百分比是指生物堿重量占干重的比例；
[0044] 降煙堿轉(zhuǎn)化百分比為降煙堿/(降煙堿+煙堿）X 100。
[0045] 中煙100為創(chuàng)制CYP82E4-1突變體的野生型對(duì)照。
[0046] CYP82E4-1的主要生物堿含量測(cè)定為5個(gè)純合突變株系的混合取樣，每個(gè)株系取3 株，其他烤煙品種的生物堿含量為6個(gè)單株的平均值。
[0047]通過本發(fā)明，可以通過非轉(zhuǎn)基因的方法降低烤煙中降煙堿含量，由于CYP82E4突變 位點(diǎn)表現(xiàn)穩(wěn)定，可在烤煙育種上通過雜交的方法實(shí)現(xiàn)低降煙堿的有效轉(zhuǎn)移，而且，降低降煙 喊可使NNN含量同等降低（Lewis RS，Jack AM,Morris JW,Robert VJM，Gavilano L， Siminszky B,Bush LP,Hayes AJ,Dewey RE.RNAi-induced suppression of nicotine demethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves.Plant Biotech J.2008,6:346-354)〇
[0048]上述雖然結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù) 范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員 不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。 SEQUENCE LISTIXG <110>中國農(nóng)科院煙草研究所 <120>突變的烤煙CYP82E4基因及其應(yīng)用 <130> <160> 6 <1.70, Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 1554 <212> DMA <213〉烤煙（Nicotians tabacum) <400> 1 atgctttctc ccatagaagc cettgtagga ctagtaacct Icacatttct 〇??c11c11c 60 ct-atggacaa aaaaatct.ca- aaaac：ct：tc；a aaaccctt.ac ca.cegaaaat ccceggagga 120
[0049] t-ggGC.ggtaa tcggG.cat.ct tttccact.tG' aatgacgacg gcgacgaccg. tccattagct 180 cgaaaactcg gagac，ttagc. t.gaeaaatac ggccccgttt tcacttttcg gctaggcctt 240 c:ccct；tgtct tagtt.gtaag· Gagttacgaa g'Gtgtaaaag ac,t:；gtt：tctG ta'caaatgac 300 gccatttttt ccaatcgtcc; agcttttctt tacggcgatt. &rctiggcta caataatgcc 3：6〇 atgrtatttt tggrrnatta rggnrrttac tggcgB.aa.aa atcg^aaatt agttattrag 420 gaag.ttctG't. G.Ggc'tagtGig: tGt€g：a;iaaa ttcaiaacacg tgagat:ttgG； aagaattcaa 480 gcgagcatta agaatftata tactcgaatt gatggaaatt cgagtacgat aaatt taac t 540 gattggttag aagaattgaa Ttttggtctg atcgtgaaga· tgatcgctgg .aaaaaattat 60() :ga'￡it.ccggta. aaggagatga :ac:aag；t.g-gag. :agatttaaga aagcgttlaa ggattttat'g' 660 attttatcaa tg.gagtttg.t gttatgggat gCatttccaa 1 tccattatt taaatigggtg' 720 gattttcaag ggcatgttaa ggctatgaaa aggactttta aapatataga 780· cai?aflt 1 agaggaaca tattaataaa agagaaaaaa taa tg.cagaaggg； 8 ;4：〇· aatgaacaag att tcattga tglggtgctt tcaaanatga gtaatgaala tettggtgaa 900 ggttaclctc gtgataclgt cattaaagca acggtgtlta glltggtctt ggatgc.agca 960 gacacagttg c tct tcacat aaatlgggga atggcalLat tgataaaoaa tcaaaagg'GC 1020 ttgacgaaag cacaagaaga gatagaceca aaagttggta a^gacagatg ggtagtiagag 1080 agtgatatta aggatttggt ataaeteeaa. gotattgtta aagaagtgtt· a&gattatat 1.?'4〇· ccaccaggac crttgttagt accacacgaa aatgtagaag attgtgttgt iag1 p'gt tat 12UO cacattccta aagggacaag attattcgca aacgtcatga aactgcaacg tgatcctaaa 1260 ctctg.gtctg' atGCtgatac ttlcgatcca ；^agag'attca ttgctactga tatt^acttt· 1320 甚tc.agt apt社taag.ta. tate.q.cgttt g.gttQ.tgg奪選...gacgatcitg tc0:aggg 1380 acttatgcat tgcaagtg^a acacttaaca atggcacatt tgatccaagg tttcaattac 1440 agaactccaa atgacga^cc cttggatatg aaggaaggtg caggcataac tatacgtaag 1500
[0050] gtaaatcxtg. tggaactgat aatagcgc'ct cgcctggcac ct.gagc.rtta t.taa 1554 <210> 2 <211> 1554 <212> DNA 烤煙（NiVotian;-」Tahamun) <4Q0> 2 atgctttctc. ccatagaagc cattgtagga ctagtaacct tcacatttct cttcttcttc 60 ctatg^acaa aaaaatctca &aaaccxtca aaacccttac caccgaaaat ccccgaagga 丄20 tggccggtaa tcggccatct tttccacttc aatgacgacg gcgacgaccg tccattagct 180 cgaaaactcg ga;ga：cttag.e· tgaGaantac· g'gCGcegttt t；：cactttt：c：| gctaiggcctt 240 cccct