一類磷光銥配合物的合成及其用于血吸蟲成蟲的熒光標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于寄生蟲病防治的生物光學標記領域，更具體地，本發(fā)明涉及一類磷光 銥配合物的合成及其用于血吸蟲成蟲熒光標記，本發(fā)明提供了一種新穎的血吸蟲成蟲熒光 標記方法，該類磷光銥配合物具有血吸蟲成蟲熒光標記的有益效果。
【背景技術】
[0002] 血吸蟲病是一種古老的寄生蟲病，對人類的生產生活有巨大的危害，是僅次于瘧 疾的第二大熱帶寄生蟲病。血吸蟲病流行于74個國家和地區(qū)，估計目前有6.52億人口受威 脅，有1.93億感染者，有癥狀病例約1.2億，其中2000萬為嚴重病例，我國是血吸蟲病的主要 流行區(qū)。血吸蟲病是一種典型的經水源傳播的人獸共患寄生蟲病，血吸蟲尾蝴是感染人畜 的唯一階段，當血吸蟲尾蝴進入人體之后，發(fā)育為童蟲階段，通過20到60天的時間再進入成 蟲階段，在整個過程中會引起急慢性血吸蟲病及相關并發(fā)癥，對人體造成極大的傷害，從皮 膚過敏皮炎，營養(yǎng)不良、厭食、黃疸，甚至肝硬化，晚期嚴重者可以致人死亡。科研工作者通 過不斷地研究，研制出了一系列對吸蟲成蟲有良好的殺滅效果的抗血吸蟲藥物，其中吡喹 酮作為最主要代表，且因具有安全，不良反應少，服用方法簡便易行，療效好，人體內降解快 等特點而在國內乃至世界受到廣泛的應用。但是由于對吡喹酮類藥物的廣泛長期大量使 用，血吸蟲已經對其產生耐藥性；同時該類藥物殺成蟲的確切作用機理尚不明確，所以需要 對該類藥物進行持續(xù)深入的研究。按照傳統(tǒng)的研究方法(主要為對死亡蟲體的檢測)來探索 這些藥物的可能作用機理，不能直接反映藥物在活體上的作用方式和位點，中間環(huán)節(jié)會影 響結果的準確性和可信度，所以需要尋求一些新的研究方法來彌補目前存在的不足。目前， 熒光成像是一項靈敏的、非侵入式、費用低廉的可視化檢測途徑，其分辨率可達百納米，可 實現(xiàn)從細胞到動物的活體成像，熒光成像手段具有監(jiān)測靈敏、成像迅速、可同時觀測多分子 事件等優(yōu)點，因此在防治血吸蟲藥物機理研究方面具有廣泛的應用前景。
[0003] 血吸蟲成蟲體壁由體被、基膜及體被下層構成，即體被細胞組成的合胞體與肌層 交錯在一起，并通過胞質小管與體被相連，使體被下層被表層無核無細胞分隔的體被所覆 蓋，因此血吸蟲成蟲并不具備角質層。血吸蟲成蟲寄生于血管中，體表與宿主血液直接接 觸，為了逃避宿主的免疫性攻擊，體被覆蓋了一種與宿主紅細胞ab抗原相同的特異性糖類， 所以成蟲體表呈現(xiàn)較強的親水性。目前，使用傳統(tǒng)的有機小分子熒光染料作為熒光探針對 生物體進行研究，存在以下的缺點:短波長發(fā)射有生物自發(fā)熒光干擾、光穩(wěn)定性不夠導致不 能長時間觀察等。同時，大部分有機小分子熒光染料親水性差，其對血吸蟲成蟲的染色效果 不理想，因此開發(fā)出對血吸蟲成蟲具有良好熒光標記效果的熒光染料是一項挑戰(zhàn)。
[0004] 磷光銥配合物相比其他熒光材料，具有更大程度的MLCT特征，具有發(fā)光效率高、光 穩(wěn)定性好、發(fā)光顏色可調等優(yōu)點。本發(fā)明結合磷光銥配合物優(yōu)異發(fā)光性能，發(fā)明人借助銥配 合物作為磷光探針用于血吸蟲成蟲熒光標記的應用，選擇合適的有機配體以及對有機配體 進行親水性修飾，可以成功地解決血吸蟲成蟲熒光成像過程中熒光標記效果差和抗光漂白 性能差的問題。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供了一類磷光銥配合物，通過對這類配合物進行化學修飾上親水性基 團，使其具有對日本血吸蟲成蟲進行磷光標記的性能，并且提高了該類磷光銥配合物發(fā)光 量子效率，可作為日本血吸蟲成蟲磷光標記試劑。
[0006] 本發(fā)明的銥配合物的結構是通過以兩個含氮芳香化合物為雙齒配體、輔以一個含 雙氮芳香化合物的配體配位合成，更具體的結構如下：
[0007]
[0008] 其中 n = 0，l，2,3,4
[0009] 本發(fā)明化合物可按照如下合成路線制備：
[0010] 丄1 上X I ^
y 、 I μ 1 ^ ^
[0011] 制備本發(fā)明化合物的原料和所用試劑均為已知化合物，可以在市場上獲得，或可 用本領域已知的方法制備。合成路線中第二步可按本領域已知的方法制備(參見Nonoyama， K·Bui1·Chem·Soc·Jpn·1974，47，467-468·)
[0012] 配φ
^PEG-Ts在乙腈堿性溶液中加熱回流即可得到含親水基的雙齒配體
其中PEG-Ts結構式如下：
[0013]
[0014]
[0015]
[0016] 將三氯化銥水合物與含親水基的雙齒配體
生2_乙氧基乙醇和水的混合溶液 中加熱反應12至48小時，可合成得到相應銥二氯橋配合物;然后，得到的銥二氯橋配合物在 有機溶劑、水或者混合溶劑中與相應的輔助配#
泛應4至12小時，合成終產物。
[0017] 上述任意一種磷光銥配合物作為血吸蟲成蟲熒光標記探針，熒光標記方法包括如 下步驟：
[0018] (1)血吸蟲尾蝴獲得：新鮮的尾蝴從感染毛蝴的陽性的釘螺得到，取陽性螺于 100mL錐形瓶中，加入清水至瓶口，在白熾燈下光照2小時左右逸出尾蝴。
[0019] ⑵小鼠感染:將六周齡雌性小鼠四肢固定于自制架子上，腹部去毛，取溫水濕潤 小鼠腹部皮膚，并將含有50條左右尾蝴的蓋玻片貼于小鼠去毛的腹部皮膚上，保持20分鐘 使尾蝴穿透小鼠皮膚進行感染。
[0020] (3)血吸蟲成蟲獲得:將感染后的小鼠飼養(yǎng)6周后，使用頸部脫臼處死，嚴格按照無 菌操作要求，依次剖開腹部皮膚、腹膜，采取灌注法于肝門-腸系膜靜脈中收集成蟲。將收集 到的成蟲在生理鹽水中漂洗3次后分配到培養(yǎng)皿中，加入RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute)細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時后，鏡檢篩選活性良好的蟲體用于焚光成像。
[0021] (4)血吸蟲成蟲熒光成像:磷光配合物用二甲基亞砜(DMS0)溶解準確配制成lmmol 的母液，然后再用ros緩沖液稀釋成5μΜ的稀釋液。移取200yL的稀釋液加入到培養(yǎng)皿中，用 鑷子挑取成蟲加入到磷光配合物稀釋液中，于室溫孵育5分鐘至6小時后，將成蟲轉移到熒 光成像器皿，在405nm激發(fā)下共聚焦焚光顯微鏡觀察尾蝴的磷光標記情況，米集520_620nm 的磷光信號進行熒光成像。
[0022] 發(fā)明人通過設計與合成，將磷光銥配合物用于血吸蟲成蟲熒光標記的研究，可以 成功地解決成蟲熒光成像過程中熒光標記效果差和抗光漂白性能差的不足。
【附圖說明】
[0023] 圖1配合物Ir-Ι的吸收光譜和磷光發(fā)射光譜。
[0024]圖2配合物Ir-2的吸收光譜和磷光發(fā)射光譜。
[0025] 圖3配合物Ir-2標記日本血吸蟲成蟲的激光共聚焦熒光成像圖。
[0026] 圖4配合物Ir-2標記日本血吸蟲成蟲頭器的激光共聚焦熒光成像圖。
【具體實施方式】
[0027]下文給出了本發(fā)明化合物的具體實施例，它們用實例詳細說明本發(fā)明，但對本發(fā) 明不構成任何限制。本實施例中所用的原料均為已知化合物，可以由商業(yè)途徑獲得，或可按 相關文獻設計方法合成。
[0028]在下述實施例中，所涉及的理化參數由下述儀器測定的"H NMR譜在Bruker Mercuryplus上采用400MHz測定，用TMS為內標；質譜數據MALDI-T0F-MS在AB SCIEX 5800型 質譜儀上獲得;紫外可見吸收光譜在Shimadzu UV-2700紫外-可見吸收光譜儀上完成;磷光 發(fā)射光譜由PerkinElmer LS-55熒光光譜儀上測定;尾蝴磷光成像在OLYMPUS FV1000型激 光共聚焦熒光顯微鏡上進行采集，激光器提供波長為405nm的激發(fā)光源，根據銥配合物的磷 光發(fā)射性質收集520nm-620nm范圍內的發(fā)射磷光信號。
[0029] 實施例1
[0030] [Ir(H0_pq)2(phen)][PF6] (Ir_l)的合成
[0031]
[0032] (1 )H〇-pq的合成:將lmmol的4-酸基苯硼酸，lmmol的2-氯喹啉，7 %當量的四（3-苯 基膦)鈀(〇)和lmmo 1的碳酸鉀加入到三頸燒瓶中，然后加入30mL THF和H20的混合溶劑。在 氮氣的保護下，反應體系在70°C反應24h。冷卻至室溫，反應液用二氯甲烷萃取，水相用二氯 甲烷萃取3次(1 OmL X 3 )，合并有機層，用無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到。
[0033] ( 2)H0_pq銥二氯橋配合物的合成：參考文獻（Nonoyama， K · Bui 1 · Chem · Soc · Jpn · 1974，47，467-468 ·)合成。0 · 5mmol 的三氯化銥水合物和lmmol 的配 體H〇-pq溶于25mL的2-乙氧基乙醇和水的混合液中（v/v = 3:1)，110°C反應24h，室溫冷卻。 抽濾收集固體，分別用蒸餾水和無水乙醇洗滌數次，得ΗΟ-pq銥二氯橋配合物。
[0034] (3) [ Ir (H0-pq)2 (bpy) ] [PF6] (Ir-Ι)的合成：將0 · 2mmo 1 的ΗΟ-pq銥二氯橋配合物， 0.4mmol的1，10-鄰菲羅啉加入圓底燒瓶中，然后加入30mL二氯甲烷和甲醇(v/v = 2:1)。在 氮氣的保護下，反應體系在50°C反應10h。再加入10倍當量的KPF6,繼續(xù)反應4h。室溫冷卻， 減壓抽濾收集濾液，柱層析分離得到產物。配合物Ir-Ι的吸收光譜和熒光光譜如圖1所示。 核磁表征數據：4 NMR(400MHz，d6-DMS0) δ9 · 49 (s，2H)，8 · 71 (dd，J = 8 · 2，1 · 2Hz，2H)，8