例5:對腫瘤細胞的凋亡作用
[0038]培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期；細胞消化計數(shù)，調(diào)整細胞密度為3*105個cell/ml，6孔板中每孔鋪2ml細胞懸液;次日，加入梯度濃度藥物處理細胞，并以不加藥物的孔板作為對照；24h后，消化細胞，按照Kit說明書標(biāo)記細胞;上機檢測并分析數(shù)據(jù)。檢測數(shù)據(jù)用GraphPad5軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(MEAN土SE)。統(tǒng)計方法為student t-test,p<0.05認為有顯著性差異:0.05〉“*” >0.01，0.01>“**”>0.001,0.01〉“***” >0.001。圖 3為不同濃度下的氧化砷和亞砷酸鉀對腫瘤細胞的凋亡作用結(jié)果。
[0039]實施例6:細胞迀移實驗
[0040]HepG2/Luc細胞細胞正常培養(yǎng);次日，細胞消化后PBS洗兩次，用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)液重懸；調(diào)整細胞密度為4 X 15個/ml;取細胞懸液200ul加入24孔板配套小室中(Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿，PIEP12R48)，下室加入500ul含10%FBS的培養(yǎng)液(或是含藥物的培養(yǎng)液)，避免氣泡，于37°C培養(yǎng)過夜。棉簽擦去小室底部多聚碳酸脂膜上未穿膜的細胞，0.1%結(jié)晶紫染色(碧云天，C0121，結(jié)晶紫染色液)。33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫洗滌收集，測0D570。最后進行數(shù)據(jù)處理，檢測數(shù)據(jù)用GraphPad5軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(MEAN土 SE)。統(tǒng)計方法為student t-test，p〈0.05認為有顯著性差異:0.05> “*，，>0.01，0.01〉“**” >0.001,0.01〉“***”>0.001。繪制圖表。
[0041 ] 實施例7:細胞侵襲實驗Transwell小室。底部均勻包被50ul matrigel(BDMatrigel?Basement Membrane Matrix，cat 354234，lOmg/ml，matrigel4°C過夜溶化，加入預(yù)冷無血清培養(yǎng)基配成lmg/ml)，超凈臺風(fēng)干過夜。次日，每孔加入2%BSA 50ul，37°C烘2h,PBS沖洗兩遍。HepG2/Luc細胞消化后I3BS洗兩次，用含0.1 %BSA的無血清培養(yǎng)液重懸；調(diào)整細胞密度為4X 105個/ml。取細胞懸液200ul加入24孔板配套小室中(Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿，PIEP12R48)，下室加入500ul含10%FBS的培養(yǎng)液(或是含藥物的培養(yǎng)液)，避免氣泡，于37 0C培養(yǎng)24hο棉簽擦去小室底部多聚碳酸脂膜上未穿膜的細胞，0.1 %結(jié)晶紫染色(碧云天，C0121，結(jié)晶紫染色液)。33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫洗滌收集，測0D570。最后進行數(shù)據(jù)處理，檢測數(shù)據(jù)用GraphPad5軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(MEAN± SE)。統(tǒng)計方法為 studentt-test，ρ〈0.05 認為有顯著性差異:0.05> “*，，>0.01，0.01> “**，，>0.001,0.01〉“***” >0.001。繪制圖表。
[0042]圖4為不同濃度下藥物對腫瘤細胞的迀移和侵襲的影響。
[0043]實施例8:大鼠藥代動力學(xué)研究
[0044]正常SD大鼠按分組尾靜脈注射不同藥物(4毫克砷每公斤體重)，在第15，30，60，120，240，480 ,and 1,440min分別眼眶取血0.5毫升，收集全血分析血漿中的砷采用ICP分析。圖5為藥物在大鼠血漿的藥代動力學(xué)結(jié)果。
[0045]實施例9:皮下肝癌小鼠模型治療研究
[0046]細胞培養(yǎng)至實驗所需濃度后，按分組進行皮下接種。接種后7天開始按分組進行給藥(4毫克砷每公斤體重)，每隔一天注射一次尾靜脈，連續(xù)注射兩周。給藥前腫瘤測量及小鼠稱重。給藥結(jié)束后小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)兩周，每隔兩天記錄腫瘤與體重，所有小鼠安樂死，實體無害化處理。繪制死亡曲線(survival VSday)。腫瘤實驗數(shù)據(jù)包括:腫瘤微觀分析，腫瘤生長曲線、小鼠體重曲線。圖6為腫瘤中的砷含量，圖7為腫瘤生長曲線和小鼠體重曲線
[0047]實施例7:毒性分析:血液檢測與器官切片研究。
[0048]細胞培養(yǎng)至實驗所需濃度后，按分組進行皮下接種。接種后7天開始按分組進行給藥，每隔一天注射一次尾靜脈(4毫克砷每公斤體重)，，連續(xù)注射兩周。給藥結(jié)束后小鼠依次用異氟烷麻醉后摘眼球取血，收集于EDTA抗凝管(?200μ1)和普通管中(?500μ1)?？鼓M行血細胞檢測，普通管中血在室溫靜置30min后分離血清，獲得血清進行生化分析，檢測肝功能(Total protein、Album in、Total Bil1、ALT、ALP);腎功能CRE、BUN;血脂cho lestero I。小鼠解剖取肝、腎、腦、肺進行HE染色。
[0049]圖8為HE染色切片結(jié)果，圖9，10，11為血液生化功能分析結(jié)果。結(jié)果表明在該劑量下三氧化二砷與我們的砷藥物都沒有明顯毒性。
【主權(quán)項】
1.一種稀土亞砷酸抗癌制劑，其特征在于，以水合堿式鹽存在，其化學(xué)式為Lnx(As02)y(0Η)ζ(Η20)η，其中: Ln代表稀土元素，X大于O; As代表砷，化合價為正三價，Y大于O;z，n > O。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稀土亞砷酸抗癌制劑，其特征在于，Ln是指La系元素、Sc、Y元素中的至少一種。3.權(quán)利要求1所述稀土亞砷酸抗癌制劑的制備方法，其特征在于:稀土可溶性鹽與可溶性亞砷酸在水溶液中攪拌共熱，并在此階段加入聚合物，所述聚合物是聚乙二醇、葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮，各組分質(zhì)量比為，稀土可溶性鹽:可溶性亞砷酸:聚合物=20:13:100，反應(yīng)產(chǎn)物離心水洗，冷凍干燥后重新分散于水中，或者直接繼續(xù)保存于水中。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述稀土亞砷酸抗癌制劑的制備方法，其特征在于:所述稀土可溶性鹽是指稀土氯化物、稀土硝酸鹽或稀土醋酸鹽。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述稀土亞砷酸抗癌制劑的制備方法，其特征在于:所述可溶性亞砷酸是亞砷酸鈉或亞砷酸鉀。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述稀土亞砷酸抗癌制劑的制備方法，其特征在于:稀土可溶性鹽與可溶性亞砷酸供熱反應(yīng)溫度為80-240 °C。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種稀土亞砷酸抗癌制劑，其化學(xué)式為Lnx(AsO2)y(OH)z(H2O)n,其中：Ln代表稀土元素，包括La系所有元素以及Sc,Y元素。砷的價態(tài)為+3價，固體形態(tài)可以以水合堿式鹽存在?？梢詾榻Y(jié)晶態(tài)或者無定型態(tài)。該類藥物可均勻、穩(wěn)定分散于水溶液中，表面可以包覆聚合物，如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮以提高生物相容性。該藥物可以制成水劑或者粉劑。對體外腫瘤細胞有明顯的抑制生長遷移侵襲和誘導(dǎo)凋亡的效果，而且對皮下腫瘤模型和原位腫瘤也顯示了明顯的治療效果。
【IPC分類】A61P35/00, A61K33/36, C01G28/02
【公開號】CN105596365
【申請?zhí)枴緾N201610024876
【發(fā)明人】唐群, 陳飛妍
【申請人】南昌大學(xué)
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月15日