檢測hla-b*51等位基因的方法和引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測HLA-B*51等位基因的引物和 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白塞?。╝damantiades-behcet' s disease ABD)又稱貝赫切特病、口-眼-生殖 器三聯(lián)征等。是一種慢性全身性血管炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為復發(fā)性口腔潰瘍、生殖器潰 瘍、眼炎及皮膚損害，也可累及血管、神經(jīng)系統(tǒng)、消化道、關(guān)節(jié)、肺、腎、附睪等器官。其發(fā)病范 圍位于北煒30°~45°的歐亞地區(qū)，東起東亞如日本、朝鮮、中國，向西延伸至中亞如土耳 其、伊朗直到地中海沿岸，與古代絲綢之路基本吻合，又稱絲綢之路病。白塞病的好發(fā)年齡 在16~40歲，大部分患者預后良好，眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及大血管受累者預后欠佳。盡管確 切的病因仍不清楚，但認為遺傳及免疫是其主要的內(nèi)在因素，有研究表明超過60%的白塞 病病人與HLA-B51有關(guān)。
[0003] 早于1973年Ohnos就發(fā)現(xiàn)HLA-B5在ABD患者中比正常對照組出現(xiàn)的頻率明顯增 高，1978年進一步證實為HLA-B51。通過大量樣本統(tǒng)計研究證實，45%~60%的白塞病發(fā)病 與HLA-B51呈高度正相關(guān)，但不確定是HLA-B51本身還是某個與其緊密連鎖的基因造成白 塞病的易感性。為了對ABD進行候選基因的研究，評估HLA-51在ABD中的分配，一個國際研 究小組針對此進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（GWAS)，研究包括了 1215例ABD病人和1278 例對照者，結(jié)果表明：HLA-B51基因型在病例組的發(fā)生率為59. 1%，對照組僅為29. 3%。在 HLA-B區(qū)段中最顯著的SNP(單核苷酸基因多態(tài)性）位于從HLA-B端粒到編碼MHC I類鏈相 關(guān)基因 A(MICA)的著絲點區(qū)域，HLA-B51和位于從HLA-B到超過著絲粒62kb的MICA基因 區(qū)域的多態(tài)基因位點之間存在強烈的連鎖不平衡。HLA-B51比其他基因的SNP與疾病更為 相關(guān)。大量研究證實，不同人種和該病明顯相關(guān)的只有HLA-B51，但是HLA-B51不是唯一的 致病因素，因為仍有約1/3的患者無此基因。隨著對ABD發(fā)病機制研究的深入，3 了解局部 及系統(tǒng)免疫細胞的激活機制，了解不同臨床亞型的發(fā)病機制，將有助于我們研制開發(fā)更為 特異和更少毒性的免疫抑制劑。
[0004] 目前常用的HLA等位基因分型的方法有PCR-SSO, PCR-SSP，PCR-SBT等，可分為低 分辨和高分辨方法。但這些方法不能對HLA-B*51等位基因是否為陽性做出精準的判斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是檢測患者是否HLA_B*51等位基因陽性，以輔助診斷白塞病，判斷 預后，并采用更直觀有效的Sanger測序法。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供用于檢測HLA_B*51等位基因的引物，包括：擴增覆蓋檢 測HLA-B*51等位基因的正、反向引物HLA-B*51-F和HLA-B*51-R，以及測序引物M13-F和 M13-R ;所述引物堿基序列為：
[0007] HLA-B*51-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0008] HLA-B*51-R :AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA
[0009] M13-F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0010] M13-R :AACAGCTATGACCATG。
[0011] 進一步地，還包括檢測內(nèi)參基因的引物actin-F和actin-R，所述檢測內(nèi)參基因的 喊基序列為：
[0012] actin-F ：CTAACTGCGCGTGCGTTCT
[0013] actin-R ：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG
[0014] 進一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為：HLA-B*51-F:HLA-B*51-R = 1:1。
[0015] 進一步地，所述內(nèi)參基因的引物的使用濃度比為：actin-F:actin_R = 1:1。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測檢測HLA_B*51等位基因的方法，其包括 如下步驟：
[0017] (1)提取樣本 DNA ;
[0018] (2)利用擴增引物 HLA-B*51-F 與 HLA-B*51-R，actin-F 與 actin-R對（1)中的 DNA 進行擴增，當兩對引物的擴增都有結(jié)果，需對樣本進行測序檢測；
[0019] (3)利用測序引物M13-F與M13-R對⑵中HLA-B*51-F與HLA-B*51-R所得的擴 增產(chǎn)物分別進行正向和反向測序，獲得所述擴增產(chǎn)物的基因序列；
[0020] (4)將⑶中的基因序列與野生型HLA_B*51等位基因序列進行比較，確定基 因序列是否完全相符；當比較結(jié)果與HLA-B*51等位基因序列完全相符，則可確定樣本 HLA-B*51等位基因陽性；當只有actin-F與actin-R這對引物擴增有結(jié)果，HLA-B*51-F與 HLA-B*51-R的擴增無結(jié)果，則可確定樣本HLA-B*51等位基因陰性；
[0021] 其中所述引物堿基序列為：
[0022] HLA-B*51-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0023] HLA-B*51-R :AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA
[0024] actin-F ：CTAACTGCGCGTGCGTTCT
[0025] actin - R ：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG
[0026] M13-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT
[0027] M13-R :AACAGCTATGACCATG。
[0028] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測HLA_B*51等位基因的試劑盒，所述試劑盒 包括樣品DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應液、測序體系反應液、陽性對照品、 陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應液包括1對擴增引物HLA-B*51-F與 HLA-B*51-R，1對內(nèi)參引物actin-F與actin-R，測序體系包括1對測序引物M13-F與M13-R， 包括：
[0029] HLA-B*51-F : TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0030] HLA-B*5I-R:AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA
[0031] actin-F ：CTAACTGCGCGTGCGTTCT
[0032] actin - R ：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG
[0033] Ml3-F :TGTAAAACGACGGCCAGT
[0034] M13-R :AACAGCTATGACCATG。
[0035] 進一步地，所述檢測體系PCR反應液還包括2 XPCR Buffer ;dNTPs ;K0D FX DNA Polymerase0
[0036] 進一步地，所述測序體系還包括測序純化液、EDTA、無水乙醇、75%乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3. 1〇
[0037] 進一步地，所述測序純化液包括蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0038] 有益效果：利用本發(fā)明所述擴增引物和內(nèi)參引物，當兩對引物的擴增都有結(jié)果，該 患者可能是HLA-B*51，HLA-B*5801、*5701等基因型，需測序檢測，測序結(jié)果與HLA-B*51等 位基因序列完全相符，則可確定樣本HLA-B*51等位基因陽性。當只有actin-F與actin-R 這對引物擴增有結(jié)果，HLA-B*51-F與HLA-B*51-R的擴增無結(jié)果，則可直接判定樣本 HLA-B*51等位基因陰性。
[0039] 由于HLA-B基因?qū)儆诮?jīng)典HLA I類基因，目前發(fā)現(xiàn)的HLA-B等位基因已超過500 個。HLA-B等位基因的多態(tài)性主要表現(xiàn)在第2、3和4外顯子，其序列可分為高度多態(tài)性位 點和相對保守位點。檢測HLA-B*51基因型的擴增引物就設(shè)計在HLA-B*51等位基因高度 多態(tài)性位點的第2和第3號外顯子區(qū)域，以降低測序時套峰出現(xiàn)的可能性，降低了結(jié)果判 讀的難度。由于HLA-B*51只是HLA-B*5眾多亞型中的一種，比對各個亞型的基因序列可 以發(fā)現(xiàn)（比如文獻報道中比較常見的HLA-B*5201、HLA-B*5401、HLA-B*5601、HLA-B*5701、 HLA-B*5801等亞型），各亞型間的基因序列差異并不明顯，擴增引物雖然設(shè)計在有高度多 態(tài)性位點區(qū)域，擴增引物還是會非特異性擴增出HLA-B*5801，HLA-B*5701等亞型，例如比 對各亞型的第2號和第3號外顯子基因序列發(fā)現(xiàn)，擴增引物還是會非特異性擴增出其他 亞型，當患者體內(nèi)同時具備其中兩種或多種亞型時，測序時還會有套峰出現(xiàn)的可能性。因 此采用Sanger測序進行最終的分型。但是如果直接用HLA-B*51的擴增引物進行測序 (HLA-B*51-F與HLA-B*51-R)，由于測序本身的技術(shù)限制前幾十bp會讀不準，套峰的出現(xiàn) 將更加大了讀取的難度，前面的序列如果讀取不準確將會影響后面幾十bp序列的讀取結(jié) 果。本發(fā)明創(chuàng)新性的在PCR擴增的上游引物5'端和下游引物5'端分別加了一段長ISbp的 M13-F引物序列和長16bp的M13-R引物序列。這樣擴增產(chǎn)物兩端都會帶上所引入的M13-F 及M13-R引物序列，隨后用M13-F和M13-R直接用M13-F和M13-R引物進行正反向測序。由 于擴增產(chǎn)物兩端帶上了 M13-F及M13-R引物序列，測序結(jié)果的前期讀取不會受到套峰的影 響，也使HLA-B*51基因序列的測序結(jié)果讀取會更早的進入讀取準確的階段。
[0040] 本發(fā)明采用Sanger測序法檢測HLA-B*51等位基因序列，通過測序結(jié)果的分析， 以確定患者是否是HLA-B*51等位基因陽性，節(jié)省了檢測時間，結(jié)果容易判讀，很大程度的 節(jié)省了檢測成本。具有很高的特異性、準確性、靈敏度、操作簡單，并且當HLA-B*51-F與 HLA-B*51-R沒有擴增結(jié)果時，還可以有效排除樣本本身的原因。
【附圖說明】
[0041 ] 圖1樣品1的檢測結(jié)果圖。
[0042] 圖2樣品2的檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明 的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0044] 實施例1
[0045] 檢測HLA-B*51等位基因的引物，包括：擴增覆蓋檢測HLA-B*51等位基因的 正、反向引物（HLA-B*51-F和HLA-B*51-R)和擴增內(nèi)參基因的正、反向引物（actin-F和 actin-R);所述擴增引物的堿基序列分別為：
[0046] HLA-B*51-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0047] HLA-B