引物可以在菌量較少的情況下檢測(cè)到病原菌的存在，實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)待測(cè)樣品濃 度達(dá)IOpg時(shí)即可檢出，表明上述方法具有較高的靈敏性。并且，二者檢測(cè)靈敏度相同，均為 10 5 μ g/ μ L，即序列1和序列2組成的引物對(duì)葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)基因 組DNA的檢測(cè)靈敏度與序列3和序列4組成的引物對(duì)小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum) 基因組DNA的檢測(cè)靈敏度相同，均為10 5 μ g/ μ L。這組引物可以在一個(gè)雙重PCR反應(yīng)中也 可以在此濃度（IO5 μ g/μ L)下分別檢測(cè)到葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小 新殼梭孢（Neofusicoccum parvum)的存在，這表明該組引物可以快速、準(zhǔn)確、靈敏的確定 葡萄苗木以及田間葡萄病樣中的葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭孢 (Neofusicoccum parvum)，為苗木帶菌檢測(cè)和針對(duì)性防治這2種病原菌引起的葡萄潰瘍病 提供依據(jù)。
[0018] 同時(shí)，由于本發(fā)明可以減少對(duì)葡萄潰瘍病病原菌小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum)和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)的鑒定時(shí)間，從而盡早的在帶菌苗木 和發(fā)病早期的病組織中檢測(cè)到病原菌的存在，達(dá)到早期針對(duì)性防病的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明的引物B. d-F/B. d-R特異性檢測(cè)的結(jié)果，圖中，泳道M為分子 量Marker (DL2000plus DNA Marker)，泳道1-3分別為分離自不同地區(qū)的小新殼梭 抱(Neofusicoccum parvum)菌株，4-5 :葡萄潰瘍病菌 Lasiodiplodia theobromae ； 6-8 ;葡萄潰瘍病菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea) ;9_10 :葡萄潰瘍病菌 Diplodia seriata;ll:葡萄糖軸褐枯病菌Alternaria viticola;12:葡萄枝枯病菌 Neopestalotiopsis sp. ; 13 :葡萄炭疽病菌 Colletotrichum viniferum ;14 :葡萄灰霉 病菌Botrytis cinerea;15:葡萄白腐病菌Coniella diplodiella;16:葡萄蔓枯病菌 Diaporthe eres : 17是以ddH20為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0020] 圖2為本發(fā)明的引物N. P-F/N. P-R特異性檢測(cè)的結(jié)果，圖中，泳道M為分子 量Marker (DL2000plus DNA Marker)，泳道1-3分別為分離自不同地區(qū)的小新殼梭 抱(Neofusicoccum parvum)菌株，4-5 :葡萄潰瘍病菌 Lasiodiplodia theobromae ； 6-8 ;葡萄潰瘍病菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea) ;9_10 :葡萄潰瘍病菌 Diplodia seriata;ll:葡萄糖軸褐枯病菌Alternaria viticola;12:葡萄枝枯病菌 Neopestalotiopsis sp. ; 13 :葡萄炭疽病菌 Colletotrichum viniferum ;14 :葡萄灰霉 病菌Botrytis cinerea;15:葡萄白腐病菌Coniella diplodiella;16:葡萄蔓枯病菌 Diaporthe eres : 17是以ddH20為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0021] 圖3為本發(fā)明的引物B. d-F/B. d-R靈敏性檢測(cè)的結(jié)果，泳道M為分子量 Marker (DL2000 DNA Marker)，泳道 1-7 分別是以濃度分別為 1，10 \ 10 2, 10 3, 10 4, 10 5， 10 Vg/μ L葡萄潰瘍病菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)基因組DNA為模板的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022] 圖4為本發(fā)明的引物N. p-F/N. p-R靈敏性檢測(cè)的結(jié)果，泳道M為分子量 Marker(DL2000DNA Marker)，泳道 1-7 分別是以濃度分別為 1，10 \ 10 2, 10 3, 10 4, 10 5， 10 6 μ g/ μ L葡萄潰瘍病菌小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum)基因組DNA為模板的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0023] 圖5為本發(fā)明引物B. d-F/B. d-R和N. p-F/N. p-R的雙重PCR反應(yīng)驗(yàn)證結(jié)果，泳 道M為分子量Marker (DL2000DNA Marker)，泳道1為以已知含有葡萄潰瘍病菌葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭抱（Neofusicoccum parvum)基因組DNA為模板的 雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0025] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可 從商業(yè)途徑得到。
[0026] 實(shí)施例1、一組同時(shí)檢測(cè)2種葡萄潰瘍病菌的雙重PCR引物及其檢測(cè)方法
[0027] 一、葡萄潰瘍病菌 Neofusicoccum parvum 和 Botryosphaeria dothidea 雙重 PCR 引物的獲得
[0028] 提取GeneBank中我國(guó)已報(bào)道的引起葡萄潰瘍病菌的4個(gè)種（Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum 和 Diplodia seriata) 的EF延伸因子和β -tubul in序列（登錄號(hào)分別為：JX462265 ;⑶294727 ;KJ146834 ; KJ146833 JX462263；JX462272 ；JX462280 ；HQ288289 JX462291 ；GU294713 ；KJ146836 ； KJ146835 JX462289 JX462299 JX462306 ;HQ288254 JX521848)進(jìn)行同源性比較。根 據(jù)Botryosphaeria dothidea與其他3個(gè)種EF延伸因子序列上的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)出 Botryosphaeria dothidea的特異性引物B. d-F/B. d_R，序列分別為上游正向引物B. d_F 序列：5' -GTCTGCATCATTCTCAGCGTGGG-3'（序列表中序列1);下游反向引物B. d-R序列： 5'-TTACCCTCAGTGTAGTGACCCTTG-3'（序列表中序列 2)。根據(jù) Neofusicoccum parvum 與其 他3個(gè)種β-tubul in序列上的差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)得到Neofusicoccum parvum的特異性引物 N. p-F/N. p-R，序列分別為：上游正向引物N. p-F序列：5' -CTCGGCGGCTTCCTGGGAT-3'（序列 表中序列3);下游反向引物N. p-R序列：5'-CGCACTCAATTTGCCTTATCGCTTC-3'（序列表中序 列4)。
[0029] 二、本發(fā)明的用于葡萄潰瘍病菌 Neofusicoccum parvum 和 Botryosphaeria dothidea雙重PCR引物的效果驗(yàn)證
[0030] 1、引物合成
[0031] B. d-F/B. d-R引物：上游正向引物B. d-F序列：
[0032] 5' -GTCTGCATCATTCTCAGCGTGGG-3'（序列表中序列 1);下游反向引物 B. d-R 序列： 5'-TTACCCTCAGTGTAGTGACCCTTG-3'（序列表中序列 2);
[0033] N. p-F/N. p-R引物：上游正向引物N. p-F序列：
[0034] 5' -CTCGGCGGCTTCCTGGGAT-3' ；下游反向引物 N. p-R 序列：
[0035] 5' -CGCACTCAATTTGCCTTATCGCTTC-3'，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
[0036] 2、特異性引物B. d-F/B. d-R和N. p-F/N. p-R的準(zhǔn)確性驗(yàn)證
[0037] 2. 1菌株的采集和鑒定
[0038] 研究中所用菌株均采用常規(guī)組織分離法（方中達(dá).植病研究方法[M].第三版.北 京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.1998 :122-137.)分離自我國(guó)不同地區(qū)的葡萄病樣上，獲得了菌株的 純培養(yǎng)，并通過(guò)接種實(shí)驗(yàn)完成了柯赫氏法則的驗(yàn)證。菌株信息如下：
[0039] 葡萄潰瘍病菌分別為：3 株 Neofusicoccum parvum，3 株 Lasiodiplodia theobromae;2 株葡萄潰瘍病菌 Botryosphaeria dothidea，2 株 Diplodia seriata。其 他菌株信息如下：2株葡萄穗軸褐枯病菌Alternaria viticola ;2株葡萄枝枯病菌 Neopestalotiopsis sp. ;2 株葡萄炭疽病菌 Colletotrichum viniferum;2 株葡萄灰霉病 菌 Botrytis cinerea;2 株葡萄蔓枯病菌 Diaporthe eres。
[0040] 2. 2菌株的鑒定采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定
[0041] 對(duì)上述菌株的鑒定采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定2種方法。首先觀察28°C黑 暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d的菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征以及分生孢子形態(tài)和 顏色等，對(duì)菌株種類進(jìn)行初步確定。進(jìn)一步采用PCR技術(shù)對(duì)菌株種類進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定， 具體方法如下：
[0042] 采用CTAB法提取菌株DNA，PCR擴(kuò)增其rDNA-ITS區(qū)段用于菌株種類鑒定。PCR反 應(yīng)體系為：了39 0嫩聚合酶（51]/^1^)0.25 4 1^，10\緩沖液（含100臟〇1/11^8-!1(：1?!18.3， 500mmol/L KCl，15mmol/L Mg2+)2. 5yL，dNTP (各 2. 5臟〇171)2以1^，1(^111〇1/1引物1丁51(序 列為：5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4(序列為：5' -TCCTCCGCTATGAATGC-3'）各 〇. 5 μ L，模板5-20ng，用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至25 μ L。PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min ; 94°C 30s，59°C 30s，72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)：取 5 μ L PCR 擴(kuò) 增產(chǎn)物于〇. 8 %的瓊脂糖凝膠上電