從龍眼肉中分離木犀草素5-O-β-葡萄糖苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及龍眼肉中分離酚類化合物的方法，尤其涉及從龍眼肉中分離木犀草素 5-0-0-葡萄糖苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 龍眼被譽(yù)為"果中圣品"，有"南方人參"的美稱，在我國栽培歷史悠久，主要分布 于福建、廣西、廣東、四川和臺(tái)灣省，是我國南方的特色大宗水果，其中廣東省龍眼種植面積 12. 9萬公頃，年產(chǎn)55. 48萬噸，對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展起重要作用。龍眼果肉不僅營養(yǎng)豐 富，并且具有很高的藥用功效?！侗静菥V目》中記載"食品以荔枝為貴，而資益以龍眼為良"， 認(rèn)為龍眼肉具有"開胃健脾，補(bǔ)虛益智"的功效。中醫(yī)學(xué)著作中也有記載，龍眼果肉可用于 治療脾虛泄瀉，自汗盜汗，心血不足，失眠健忘等癥狀。已有研究人員對(duì)荔枝果肉生物活性 做了初步探索，報(bào)道荔枝果肉富含酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗輻射和保護(hù)肝臟等生物活性。
[0003] 龍眼資源在我國華南地區(qū)非常豐富，如果對(duì)龍眼果肉進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，確定 其抗氧化作用物質(zhì)基礎(chǔ)、鑒定其單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)、明析其作用機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出可 降低慢性疾病發(fā)生發(fā)展的功能食品，不僅可以充分利用龍眼資源，而且還可以減少慢性疾 病的發(fā)病率、促進(jìn)人們的健康水平、創(chuàng)造出較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。已有研究表明，龍 眼果肉中含有豐富的酚類化合物，目前已從龍眼果肉中分離得到的酚類化合物(見下圖和 表1)。大量試驗(yàn)表明龍眼果肉中的酚類化合物有較強(qiáng)的抗氧化、延緩衰老功效，是龍眼果肉 抗氧化活性的主要功效物質(zhì)。Rangkadilok等用70%甲醇從龍眼果肉中提取得到的酚類物 質(zhì)主要為沒食子酸、縣花單寧、縣花酸（Rangkadilok et al.，2005)。Jian Sun用聚酰胺柱 和Sephadex LH-20凝膠柱層析法分離純化果肉中酚類物質(zhì)，鑒定得到4-0-甲基沒食子酸 和（-)_表兒茶素（Jian et al.，2007)。其中4-0-甲基沒食子酸表現(xiàn)出較高的DPPH和自 由基清除活性，而后者證實(shí)與龍眼果肉的褐變反應(yīng)相關(guān)。王志遠(yuǎn)采用普魯士蘭法測定了龍 眼果肉70%丙酮提取物中多酚和單寧的含量分別約為0. 90±0. 06mg/g和0. 56±0. 06mg/g (王志遠(yuǎn)等，2008)。萬紅霞比較了不同濃度的甲醇、乙醇、丙酮對(duì)多酚提取含量的影響，結(jié)果 顯示以70%丙酮為提取劑時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大，為51. 5±1.4mg/100g (萬紅霞，2011)。 肖毅美用HPLC的方法測定了不同品種龍眼果肉中酚類物質(zhì)的組成和含量，發(fā)現(xiàn)酚類單體 含量最大的是表兒茶素，其次是四甲基鄰苯二酚和香豆素（肖毅美，2011)。酚類物質(zhì)在抗氧 化、延緩衰老等方面具有較強(qiáng)的作用，這與龍眼果肉的生理功效是一致的。

[0004] 目前，沒有人從龍眼果肉中分離得到木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種從龍眼肉中分離木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷的方法。 該方法工藝簡單，條件容易控制，易于產(chǎn)業(yè)化，為它在廣泛范圍內(nèi)使用提供了方便。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：從龍眼肉中分離木犀草素5-0-0 -葡萄 糖苷的方法，包括以下步驟： (1) 用丙酮提取龍眼果肉，獲得丙酮提取物； (2) 所述丙酮提取物上大孔樹脂分離柱，先后用超純水和95%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收 集乙醇溶液，濃縮至乙醇完全回收； (3) 所述濃縮液上聚酰胺樹脂柱，依次用水以及體積分?jǐn)?shù)為10%、20%的乙醇進(jìn)行梯度 洗脫，而后采用體積分?jǐn)?shù)為25-35%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液； (4) 將25-35%乙醇的洗脫液注入高效液相色譜儀，用甲醇-水進(jìn)行洗脫，收集含有木 犀草素5-0-P -葡萄糖苷的級(jí)分，濃縮，干燥獲得木犀草素5-0-P -葡萄糖苷。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟（1)具體操作為：取鮮龍眼果肉，按質(zhì)量體積比 1:2-5加入4°C預(yù)冷的80%丙酮，破碎組織，之后用均質(zhì)機(jī)在冰水浴下，4500-5500rpm均質(zhì) 4-6分鐘，然后離心4-6分鐘，取上清液，果渣重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，真空濃縮至 40mL，-80 °C冷藏備用。
[0008] 所述離心轉(zhuǎn)速 4500-5500 rpm。
[0009] 所述步驟（2)中的超純水和95%乙醇溶液的用量分別為2L。
[0010] 所述步驟（3)中的水和乙醇的用量分別為2L。
[0011] 所述步驟（4)中甲醇-水中甲醇和水體積比為45 : 55 ;流速5 mL/min，所述干燥 為冷凍干燥。
[0012] 本發(fā)明的有益效果： 1.本發(fā)明龍眼果肉丙酮提取物經(jīng)大孔吸附樹脂出去糖類化合物后，采用聚酰胺吸附樹 脂與高效液相色譜相結(jié)合的方式進(jìn)行純化，實(shí)現(xiàn)了木犀草素5-0-P -葡萄糖苷的快速高效 分離，且所得的木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷純度可達(dá)到95%以上。
[0013] 2.本發(fā)明獲得的木犀草素5-0-0 -葡萄糖具有細(xì)胞的抗氧化能力。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明30%乙醇洗脫液的高效液相色譜圖。
[0015]圖2是本發(fā)明提取的木犀草素5-0- P -葡萄糖苷的核磁共振H譜圖，各個(gè)H質(zhì)子 的信號(hào)位移值（ppm)示于圖中。
[0016]圖3是本發(fā)明提取的木犀草素5-0- P -葡萄糖苷的核磁共振C譜圖，各個(gè)C原子 的信號(hào)位移值（ppm)示于圖中。
[0017]
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例一 (1)取500g鮮龍眼果肉，按質(zhì)量體積比1:2加入4°C預(yù)冷的80%丙酮，采用飛利浦?jǐn)?拌機(jī)破碎組織，之后用XHF-D均質(zhì)機(jī)在冰水浴條件下，5000 rpm轉(zhuǎn)速下均質(zhì)5分鐘，均質(zhì)后 5000rpm離心5min，取上清液。果渣再重復(fù)提取一次。合并兩次離心上清液，真空濃縮至約 40mL，龍眼果肉提取物濃縮液在-80 °C冷藏備用。
[0019] (2)龍眼果肉提取物濃縮液首先采用填充了 HPD-826型大孔樹脂，直徑3. 5cm，長 40cm玻璃柱進(jìn)行分離，分別用2L超純水和2L 95%乙醇溶液（v/v)進(jìn)行洗脫。收集有機(jī)相 洗脫液，真空濃縮有機(jī)相洗脫液。
[0020] (3)將有機(jī)相濃縮液用填充了聚酰胺樹脂（PR)，直徑3. 5cm，長40cm玻璃柱作進(jìn) 一步純化，依次采用水和以下體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行洗脫：10%、20%、30%、40%、50%、80% 和100%，各洗脫液均為2L，分別收集洗脫液，各洗脫液采用HPLC進(jìn)行分析，HPLC分析采用 二極管陣列檢測器（DAD)。與木犀草素5-0-P-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，只有30%乙 醇洗脫液中含有木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷，如圖1所示，該圖橫坐標(biāo)表示出峰時(shí)間，從左 到右出峰時(shí)間依次為17. 864, 25. 421，28. 272, 29. 688, 34. 828。其中，在25. 421分鐘處出現(xiàn) 的是木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷的峰。
[0021] (4)將30%乙醇洗脫液注入高效液相色譜儀，液相色譜條件：檢測波長280nm ;流 動(dòng)相甲醇-水比例45:55，v/v ;流速5mL/min。收集25分鐘出峰段的洗脫液，濃縮，干燥獲 得單體，避光干燥器中保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定： 對(duì)所得的單體進(jìn)行1H NMR、13C NM