一種干細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種干細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用。尤其涉 及一種含脂肪干細(xì)胞的干細(xì)胞制劑及其制備方法與制備治療股骨頭壞死的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 股骨頭壞死，也叫做股骨頭無菌性壞死，在骨關(guān)節(jié)疾病中挑戰(zhàn)性及破壞性疾病，也 是骨科領(lǐng)域常見且難治性疾病。股骨頭壞死可發(fā)生于任何年齡但以31-60歲最多，無性別 差異，開始多表現(xiàn)為髖關(guān)節(jié)或其周圍關(guān)節(jié)的隱痛、鈍痛，活動后加重，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致髖 關(guān)節(jié)的功能障礙，股骨頭壞死嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和勞動能力，若治療不及時，還可導(dǎo) 致終身殘疾。
[0003] 股骨頭壞死的治療方法，由單一藥物治療，發(fā)展到髓新減壓、旋轉(zhuǎn)截骨、骨水泥填 充術(shù)等保守、手術(shù)及組織工程技術(shù)治療。非手術(shù)治療包括介入治療、高壓氧治療、物理療法。 目前治療股骨頭壞死的方法雖然很多，但尚無滿意的治療方案。手術(shù)創(chuàng)傷性大，技術(shù)要求 高，有可能加重原有的創(chuàng)傷，增加患者的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。藥物治療股骨頭壞死配方很多， 但是治愈效果差、病人受折磨時間長，費(fèi)用巨大。
[0004] 目前治療股骨頭壞死的最為尖端的技術(shù)是干細(xì)胞治療股骨頭壞死，也是療效中最 好的一種手段。干細(xì)胞具有多向分化的能力和高度的可塑性，當(dāng)干細(xì)胞被置于新的生存壞 境下，他們的特性就會發(fā)生改變，具有很強(qiáng)的分化能力，它穿透毛細(xì)血管壁，特異性的分化 為身體所需要的細(xì)胞并對于壞死的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)和再生。干細(xì)胞能新生血管，恢復(fù)血管功 能是治療股骨頭壞死的重要原因。干細(xì)胞能分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)鈣質(zhì)沉著，修復(fù)被破壞的 股骨頭。同時，干細(xì)胞還有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能，對股骨頭壞死的治療 有全面支持作用。
[0005] 在股骨頭壞死的干細(xì)胞治療中，常用的種子細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但是由于 獲得自體骨髓數(shù)量極少，難以體外培養(yǎng)擴(kuò)增到一定治療量的細(xì)胞，且不利于維持其基因組 穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種干細(xì)胞制劑及 其制備方法。本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，來源豐富、體外分化能力強(qiáng)， 安全性高、治療效果好。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種干細(xì)胞制劑，包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0009] 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC)是2002年zuk等人在脂肪組織中分離出來的，具有多 向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，其來源豐富、取材方便、細(xì)胞獲取量大，可稱為組織工程理想 的種子細(xì)胞來源之一。
[0010] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑中所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的用 量為每lOmL所述干細(xì)胞制劑含1.OX10s個-5.OX10 8個脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的干細(xì)胞制劑，還包括高濃度血小板血漿。
[0012] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑中所述高濃度血小板血漿的用 量為每10mL所述干細(xì)胞制劑含lmL-2mL所述高濃度血小板血漿。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的干細(xì)胞制劑，還包括白蛋白和生理鹽水。
[0014] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑中所述白蛋白的用量為每10mL 所述干細(xì)胞制劑含〇. 2g-0. 4g白蛋白。
[0015] 在一些實(shí)施例中，所述白蛋白為人血清白蛋白。優(yōu)選為20 %人血清白蛋白。所述 20%人血清白蛋白的用量為每10mL所述干細(xì)胞制劑含lmL-2mL20%人血清白蛋白。
[0016] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑中所述生理鹽水的用量為每 10mL所述干細(xì)胞制劑含5mL-7mL生理鹽水。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的干細(xì)胞制劑的制備方法，將生理鹽水與白蛋白混合后重懸 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，然后與高濃度血小板血漿混勻。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的制備方法中所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法 為膠原酶I消化50min，加入完全培養(yǎng)基，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后換液，待細(xì)胞匯合 度達(dá)到80% -90%時，傳代；取第三代至第五代的脂肪干細(xì)胞，胰蛋白酶消化2min，1500rpm 離心5min收集細(xì)胞。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的制備方法中所述高濃度血小板血漿的制備方法 為自體全血200g_400g離心5min-10min，取上層血衆(zhòng)1200g_1600g離心5min-10min，取lmL 上層血衆(zhòng)，重懸沉淀。
[0020] 體內(nèi)鈣磷大部分存在于骨中，而血中鈣磷含量的高低直接影響骨的鈣化與溶解， 其乘積超過一定限度，則沉淀為骨鹽。因此，鈣磷乘積升高有利于鈣鹽的沉積，促進(jìn)骨基質(zhì) 的生成，使成骨細(xì)胞數(shù)量增多，從而促進(jìn)骨生成。在某一實(shí)施例中，本發(fā)明采用全自動生化 分析儀進(jìn)行鈣磷的檢測考察本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑對鈣磷代謝的影響。結(jié)果顯示，本發(fā)明 所述干細(xì)胞制劑鈣磷乘積都比模型空白組高，且差異極顯著。表明本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑 可促進(jìn)成骨細(xì)胞活動，有利于新骨的生成。
[0021] 血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，是血管內(nèi)皮 細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。在某一實(shí)施例中，本發(fā)明采用 Western-blot對股骨頭組織進(jìn)行檢測考察本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑對VEGF表達(dá)的影響。結(jié) 果顯示，采用本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑治療后VEGF表達(dá)量有顯著性提高，表明本發(fā)明所述干 細(xì)胞制劑能夠增強(qiáng)VEGF表達(dá)，加強(qiáng)壞死局部血管增生，形成較為完善的血管網(wǎng)，輸送更多 的成骨前體細(xì)胞，分泌更多相關(guān)的生長因子，加速壞死的修復(fù)。
[0022] 因此，本發(fā)明還提供了所述的干細(xì)胞制劑在制備治療股骨頭壞死的藥物中的應(yīng) 用。
[0023] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可將所述的干細(xì)胞制劑直接或間接加入制備不同劑型時所需的 藥學(xué)上可接受的各種常用輔料，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用制劑如注射液、凍干粉、口 服液等。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述藥物為注射液。
[0025] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā) 明所述干細(xì)胞制劑包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，來源豐富、體外分化能力強(qiáng)，安全性高、治療效 果好。本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑還包括高濃度血小板血漿提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在制劑中的 活率，同時促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對股骨頭壞死的治療。本發(fā)明所述制備方法制備時間短， 適合規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明所述干細(xì)胞制劑可促進(jìn)成骨細(xì)胞活動，有利于新骨的生成，同時能 夠增強(qiáng)VEGF表達(dá)，加強(qiáng)壞死局部血管增生，形成較為完善的血管網(wǎng)，可用于制備治療股骨 頭壞死的藥物。
【附圖說明】
[0026] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0027]圖1示實(shí)施例1制得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞P1代的細(xì)胞形態(tài)圖，其中圖a放大倍數(shù) 為40倍，圖b放大倍數(shù)為100倍；
[0028]圖2示實(shí)施例2細(xì)胞活力檢測圖，其中圖a為臺盼藍(lán)染色圖；圖b為細(xì)胞直徑柱狀 圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞直徑，單位ym，縱坐標(biāo)為細(xì)胞總數(shù)；
[0029] 圖3示實(shí)施例1制得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞P1代細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果圖，其 中圖a-c為對照細(xì)胞組，圖d-f為實(shí)施例1制得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞P1代細(xì)胞組；圖a為 FSC及SSC表達(dá)情況圖，圖b為HLA-DR及⑶59表達(dá)情況圖，圖c為⑶45及⑶90表達(dá)情況 圖，圖d為FSC及SSC表達(dá)情況圖，圖e為HLA-DR及⑶59表達(dá)情況圖，圖f?為⑶45及⑶90 表達(dá)情況圖；
[0030] 圖4示實(shí)施例9Western-blot檢測VEGF蛋白的表達(dá)結(jié)果圖，其中泳道1為正常組， 泳道2為模型空白組，泳道3為對比例組，泳道4為實(shí)施例組。
[0031] 圖5示實(shí)施例9Western-blot檢測VEGF蛋白的相對表達(dá)量對比圖，橫坐標(biāo)為組 另IJ，從左到右依次為正常組、模型空白組、對比例組、實(shí)施例組；縱坐標(biāo)為VEGF蛋白的表達(dá) 量與0-actin表達(dá)量的比值。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0033] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0034] 實(shí)施例1、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞獲取
[0035] 取501^脂肪，用？83清洗2次，加入0.3%-0.5%膠原酶1消化501^11后用？83 清洗1次，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種至培養(yǎng)皿中后放于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 48