一種沾化冬棗葉片愈傷組織的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于植物組培領(lǐng)域，具體涉及一種沾化冬棗葉片愈傷組織的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 率樹（ZizyphusjujubaMill)是我國的特有果樹，具有很高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值。 沾化冬棗是棗類中最優(yōu)良的的品種之一，北京市營養(yǎng)源研究所分析化驗(yàn)表明：沾化冬棗富 含人體所需的19種氨基酸和多種維生素，其中維生素C的含量是蘋果的70倍、梨的100 倍、金絲小棗的20倍，還含有鉀、鈉、鐵、銅等多種微量元素，營養(yǎng)價值居"百果之冠"，被譽(yù) 為"活維生素丸"。但由于冬棗高度雜合、花小、人工去雄難、坐果率低、胚敗育等方面的緣 故，雜交育種工作難以開展，極大地限制了良種繁育和推廣，冬棗產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了現(xiàn)實(shí)的 需要。因此，優(yōu)良冬棗繁育和推廣有著廣闊的發(fā)展空間。
[0003] 生產(chǎn)中多采用選擇自然芽變與根蘗苗分株、扦插和嫁接等方法進(jìn)行繁育，利用根 孽分苗繁殖，需與嫁接繁殖相結(jié)合，不僅費(fèi)工費(fèi)時，成苗率較低，且易侵染各種植物病毒，如 棗瘋病類菌原體（M0L)等。而愈傷組織是進(jìn)行植株再生、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合、 細(xì)胞生理生化研究和遺傳改良等研究工作的基礎(chǔ)材料，在植物組織培養(yǎng)中具有重要的應(yīng)用 價值。因此，開展棗樹組培研究，對加速優(yōu)良品種繁殖，培育無病毒苗，開展細(xì)胞融合和體細(xì) 胞雜交等生物工程技術(shù)育種有著極其重要的意義。
[0004] 由棗樹莖尖、莖段進(jìn)行組培快繁國內(nèi)外已進(jìn)行了不同程度的研究，但誘導(dǎo)率差強(qiáng) 人意。而葉片取材方便，來源廣泛，操作容易，從理論上講是進(jìn)行棗樹組織培養(yǎng)育種快繁的 很好的外植體材料。棗樹葉片培養(yǎng)的研究也有一些報(bào)道。但其愈傷組織培養(yǎng)再生植株的系 統(tǒng)研究報(bào)道極少。在組織培養(yǎng)過程中，常會遇到污染、褐變和玻璃化等問題使試驗(yàn)失敗，給 科研和生產(chǎn)造成損失，并且出愈率低。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種最適的沾化冬棗葉片愈傷組織的培養(yǎng)方法，利用該方法 能夠高效的獲得沾化冬棗葉片愈傷組織，其出愈率高達(dá)85%以上。
[0006] 本發(fā)明的沾化冬棗葉片愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0007] 選擇沾化冬棗水培苗20天葉齡，取自葉基部向上第3-4葉作為外植體，消毒后，接 種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，然后置于溫度28土 1°C，暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)，得到冬棗葉片愈傷組織；
[0008] 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每升含有TDZ(苯基噻二唑基脲）1~1. 5mg、麥芽糖20g、瓊脂 l〇g，余量為3/4MS培養(yǎng)基，pH5. 8。
[0009] 優(yōu)選，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每升含有TDZ1.5mg、麥芽糖20g、瓊脂10g，余量為 3/4MS培養(yǎng)基，pH5. 8,然后置于溫度28± 1°C，暗培養(yǎng)，得到冬棗葉片愈傷組織。
[0010] 所述的消毒為將外植體用無菌水浸泡lOmin，于超凈工作臺內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)70%的 酒精進(jìn)行表面消毒30-60S，無菌水沖洗2-3次，再用體積分?jǐn)?shù)20 %次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒 5min，無菌水沖洗3-5次。
[0011] 優(yōu)選，所述的弱光培養(yǎng)是在5001UX光照下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0012] MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，其成份和配置方法見MurashigeT,Skoog F(1962)(Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassaywithtobaccotissue cultures.PhysiolPlant15:473 - 497)。3/4MS培養(yǎng)基是指將MS培養(yǎng)基中大量元素用量 為原來的3/4,其余成份不變。
[0013] 按照本發(fā)明的方法能夠高效的獲得沾化冬棗葉片愈傷組織，其出愈率高達(dá)85%以 上，并且無褐變和玻璃化等問題，從而為獲得組培苗，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良株系的無性快繁，建立一個 高效穩(wěn)定的葉片再生體系，同時也為基因工程操作提供優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料和遺傳轉(zhuǎn)化體系的 建立奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】：
[0014] 圖1是不同光照條件下冬棗葉片愈傷組織。A、外植體在強(qiáng)光條件下培養(yǎng)14d后愈 傷組織的生長情況。B、外植體在弱光條件下培養(yǎng)14d后愈傷組織的生長情況。C、外植體在 黑暗條件下培養(yǎng)14d后愈傷組織的生長情況。
[0015] 圖2是第8組冬棗葉片愈傷組織。外植體在3/4MS+1. 5mg/LTDZ+2%麥芽糖+1 % 瓊脂，PH調(diào)為5. 8,弱光培養(yǎng)14天后愈傷組織生長情況。
[0016] 圖3是愈傷組織的增殖生芽。外植體在3/4MS+1. 5mg/LTDZ+2%麥芽糖+1 %瓊脂， PH調(diào)為5. 8,黑暗培養(yǎng)14天后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，誘導(dǎo)出不定芽。
【具體實(shí)施方式】：
[0017] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0018] 實(shí)施例1:
[0019] 第一章材料與方法
[0020] 1. 1材料與儀器
[0021] LL1實(shí)驗(yàn)材料和生長條件
[0022] 剪取山東省沾化縣優(yōu)良冬棗品種-沾化冬棗的一年生休眠樹枝，將休眠樹枝浸泡 在蒸餾水，并放置在28°C下，冷白色熒光燈照明，保持14h/10h的（光/暗）的溫室培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，5-10d內(nèi)使其長出幼葉。取幼葉作為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。
[0023] 1. 1. 2 儀器
[0024]YT-CJ-2ND型超凈工作臺（北京亞泰克隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心）
[0025] G154D型自動全高壓滅菌鍋（rybioscientific)
[0026]B⑶-272WBCS海爾冷凍冷藏冰箱（青島海爾股份有限公司）
[0027] FA1004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）
[0028] SL502電子天平（上海民僑精密科技儀器有限公司）
[0029] GBC-1000光照植物生長箱（寧波江南儀器廠）
[0030] 可調(diào)萬用電爐（龍口市電爐制造廠）
[0031] 1.1. 3實(shí)驗(yàn)用具
[0032] 剪刀、研缽、鑷子、解剖針、移液管、量筒、移液槍、容量瓶、試劑瓶、燒杯、玻璃棒、濾 紙片、牛皮紙等。
[0033] 1. 1. 4 培養(yǎng)基
[0034] 本實(shí)驗(yàn)選取MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、3/4MS培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。
[0035] 1. 1. 5激素類母液的配制
[0036] (1)lg/L2, 4-D的配制
[0037] 稱取0.以的2,4-0粉末，用70%酒精溶解，然后用1001^蒸餾水定容，濃度均為 lg/L的母液，4°C保存?zhèn)溆谩Ｃ看问褂萌mL稀釋至1L。
[0038] (2)lg/L6-BA的配制
[0039] 稱取0.lg的6-BA粉末，用70%酒精溶解，然后用100mL蒸餾水定容，濃度均為lg/ L的母液，4°C保存?zhèn)溆?。每次使用取lmL稀釋至1L。
[0040] (3)lg/LTDZ的配制
[0041] 稱取0.lg的TDZ粉末，用70%酒精溶解，然后用100mL蒸餾水定容，濃度均為lg/ L的母液，4°C保存?zhèn)溆?。每次使用取lmL稀釋至1L。
[0042] 1. 1. 6緩沖液的配制
[0043] (1)lmol/L鹽酸溶液配制
[0044] 用滴定管量取密度為1. 19g/mL的濃鹽酸8. 25mL，加蒸餾水至100mL
[0045] (2)lmol/L氫氧化鈉溶液配制
[0046] 用托盤天平稱出4g氫氧化鈉固體，加蒸餾水至100mL
[0047] 1. 2實(shí)驗(yàn)方法
[0048] 1. 2. 1材料的消毒
[0049] 取步驟1. 1. 1中的生長健壯且全部展開的冬棗葉片用無菌水浸泡10min，于超凈 工作臺內(nèi)用70%的酒精進(jìn)行表面消毒30-60s，無菌水沖洗2-3次，再用20%次氯酸鈉溶液 進(jìn)行消毒5min，無菌水沖洗3-5次。
[0050] 1. 2. 2影響冬棗愈傷組織因素的研究
[0051] 1. 2. 2. 1外植體特性對愈傷組織誘導(dǎo)的影響<