pBI121-A^/^7和AhAPG2重組質(zhì)粒利用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細胞，篩選出含有重組質(zhì)粒的重組菌株。挑取重組菌株單菌落，接種到Y(jié)EB (利福平50 mg/L，卡那霉素50 mg/L)液體培養(yǎng)基中，28°C、180 rpm培養(yǎng)至0D_=0.5~0.8時，取2 mL菌液轉(zhuǎn)移到50 mL YEB (利福平50mg/L，卡那霉素50 mg/L)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD6qq=0.6~0.8。將菌液于5000 rpm離心15 min后，用相同體積的液體]\^85懸浮備用。
[0037]b、花生子葉外植體的分離:選取飽滿的花生種子，在70%酒精中浸泡I min，0.1%升汞浸泡20 min，無菌水沖洗4-6次。去種皮和胚軸，將每片子葉縱向切成2半。
[0038]C、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化:切好的外植體浸于已備好的農(nóng)桿菌菌液中，28°C、90rpm溫和震蕩侵染10 min，用無菌濾紙將殘留菌液吸干，接入SIM誘導(dǎo)培養(yǎng)基上在暗中共培養(yǎng)3 d。轉(zhuǎn)移到添加250 mg/L頭孢霉素的SM誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將外植體切口端嵌入培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 w左右，誘導(dǎo)叢生芽，培養(yǎng)條件:光強為1500-2000 lx、光照12 h、溫度為26°C ±1°C。
[0039]將形成叢生芽的外植體轉(zhuǎn)移外到250 mg/L頭孢霉素、100 mg/L卡那霉素的SEM培養(yǎng)基上篩選抗性芽，培養(yǎng)2 ?，培養(yǎng)條件:光強為1500-2000 lx、光照12 h、溫度為26 0C ±1°C。
[0040]培養(yǎng)2 w后，切下不定芽部分轉(zhuǎn)移到250 mg/L頭孢霉素、150 mg/L卡那霉素的SEM培養(yǎng)基上，進行抗性芽的篩選及誘導(dǎo)芽伸長，培養(yǎng)4w左右，期間繼代培養(yǎng)2-3次(如圖1所示)。
[0041]4、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
提取再生植株的基因組DNA，利用上述CaMV 35S啟動子的引物對進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序為:95°C、5 min;95°C、30 s，56°C、35s，72°C、40 s，35 個循環(huán)；72°C、10 min。
[0042]將花生APG-1和AdC因在花生中過量表達，對花生轉(zhuǎn)基因植株進行PCR檢測的引物均為:
P5:5-GCTCCTACAAATGCCATCA-3 (SEQ ID No:11);
P6:5- GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3 (SEQ ID No:12)。
[0043]如圖2所示(圖2中為部分轉(zhuǎn)基因植株樣品)，全部擬轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性率均在20%以上。
[0044]5、熒光定量PCR，包括以下步驟:
a、用1.5% NaCl處理‘花育23號’的幼苗，在不同時間段取幼苗葉片，立即在液氮中冷凍處理后備用。分別取不同時間段脅迫處理的花生幼葉0.05 g，液氮速凍并研磨成粉末狀，用RNA提取試劑盒提取RNA。抽提后的總RNA用DNase I處理，并進行純化。
[0045]b、樣品在ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)。20 PL反應(yīng)體系包括:10 M-L 2 X SybrGreen qPCR Master Mix, 20 Mmol/L 正反向引物各 0.25 M-L, 20 ng 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。擴增程序為:先95°C預(yù)變性2 min;接著進入40個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)中95°C變性10 s，60°C延伸33 s ;循環(huán)結(jié)束后，緩慢升至95°C，制備熔解曲線。每個反應(yīng)設(shè)2個復(fù)孔。
[0046]c、J/^7基因定量PCR 的正向引物序列為 5’- CATGGCTTGATTATGGGTTG -3’(SEQ IDNo: 13);反向引物序列為 5’- GGAAACGATATAAGAACACAAAGGTA -3’ (SEQ ID No: 14)。APG2基因定量PCR的正向引物序列為5’- CATGGCTTGATTATGGGTTG -3’ (SEQ ID No:15);反向引物序列為 5’- AGCGATATAAGAACACAAAGGGT -3’ (SEQ ID No: 16)。
[0047]以花生如ii/?基因為內(nèi)標，擴增正向引物序列為5’- GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3’ (SEQ ID No: 17);反向引物序列為 5’- ATGGATGGCTGGAAGAGAACT -3’ (SEQ ID No: 18)。
[0048]實驗結(jié)果如圖3所示，J/^-2和AdC因均受鹽脅迫誘導(dǎo)表達，J/^-7基因受鹽脅迫誘導(dǎo)48 h時可達到對照的27.7倍基因受鹽脅迫誘導(dǎo)6 h時可達到對照的9倍。
[0049]6、T2代轉(zhuǎn)基因種子的耐鹽性鑒定
以丁2代種子轉(zhuǎn)基因花生種子和花育23號種子(對照)為材料，挑選飽滿種子，加0.7%NaCl充分浸泡4 h，倒掉多余NaCl溶液至適量，于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為25°C、暗培養(yǎng)24 h，處理期間每I d更換一次NaCl溶液。5 d后統(tǒng)計發(fā)芽率，胚根長度多種子長度為發(fā)芽標準。每個處理設(shè)兩個重復(fù)。
[0050]將花生J/^-7和AdC因在花生中超量表達，花生轉(zhuǎn)基因種子在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率分別可達到36%和49%，而非轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽率只有15% ;本發(fā)明將J/^-2和
基因在花生過量表達可顯著提高種子(圖4)和植株(圖5)的耐鹽性。
[0051]7、T2代轉(zhuǎn)基因植株生育酚含量的測定
挑選培養(yǎng)I個月的PCR陽性植株和未轉(zhuǎn)基因的野生型植株的葉片各100 mg，用液氮研磨后轉(zhuǎn)入到含600 UL甲醇:氯仿(2: I)抽提液的1.5 mL離心管中，充分震蕩混勻，然后加入200 UL氯仿和200 UL無菌水，充分混勻。12 000 r/min離心15 min，取下層有機相轉(zhuǎn)入到新的離心管中，氮氣吹干，溶于400 UL的無水乙醇中。進行高效液相色譜儀分析。
[0052]分析條件:流動相為正己烷:異丙醚(90: 10，V/V);硅膠柱為粒度5 μ L，4.6 cmX25 cm ;檢測波長為激發(fā)波長:298 nm ;發(fā)射波長:325 nm ;柱溫:40°C ;流速:1.5mL.mirT1;分析時間:20 min。標準品α、β、γ、δ -生育酸的濃度均為10 ng.yL_l，上樣體積為10 ULo
[0053]如圖6所示，轉(zhuǎn)J/^-7和AdC因花生植株形態(tài)發(fā)育正常，過量表達APG-1和基因后，轉(zhuǎn)基因花生葉片中α生育酚含量分別可達到295.4和226.5 gg/g鮮重，分別為對照(169.6 μδ/δ鮮重)的1.74和1.34倍；而將花生J/^-7和反義載體進行遺傳轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量可降低到35.5和23.2 Pg/g鮮重，分別只有對照的20.9%和13.7%。本發(fā)明中的可明顯改變花生葉片中α生育酚含量。
[0054]8、轉(zhuǎn)基因T2代花生種子品種性狀的測定
采用傅立葉變換近紅外光譜儀對轉(zhuǎn)基因1~2代花生種子品種性狀進行測定(在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實驗室測試)，每個材料測定2次，用山東農(nóng)科院花生所王傳堂創(chuàng)建的多粒模型進行分析。
[0055]采用傅立葉變換近紅外光譜儀對轉(zhuǎn)基因1~2代花生種子品種性狀進行測定(在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實驗室測試)。結(jié)果表明過量表達基因后，有7個材料的含油量范圍在57.19-58.77%之間，顯著高于對照花育23號(55.94%) ；7個材料的棕櫚酸含量范圍在
6.52-7.42%之間，顯著高于對照(5.38%);8個材料的的蛋白質(zhì)含量范圍在28.61-29.70%之間，顯著高于對照(27.62%)(圖7)。過量表達4/??基因后，有19個材料的棕櫚酸含量范圍在6.62-8.55%之間，顯著高于對照；14個材料的蛋白質(zhì)含量范圍在28.87-29.51%之間，顯著高于對照(圖8)。
[0056]以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項】
1.花生J/^-2基因在提高植物α生育酚含量中的應(yīng)用，其特征在于所述花生J/^-7基因的序列表如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生基因在提高植物α生育酚含量中的應(yīng)用，其特征在于所述花生基因能提高植物的α生育酚含量，轉(zhuǎn)J/^-2基因植株葉片中α生育酚含量達到對照的1.74倍；將花生反義載體進行遺傳轉(zhuǎn)化后明顯減少α生育酚含量，轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量達對照的20.9%。
3.花生AdC因在提高植物α生育酚含量中的應(yīng)用，其特征在于所述花生AdC因的序列表如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生基因在提高植物α生育酚含量中的應(yīng)用，其特征在于所述花生AdC因能提高植物的α生育酚含量，轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量達到對照的1.34倍；將花生反義載體進行遺傳轉(zhuǎn)化后能明顯減少α生育酚含量，轉(zhuǎn)基因植株葉片中α生育酚含量達對照的13.7%。
5.花生基因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于所述花生基因的序列表如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID Νο:2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的花生基因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于所述花生基因受鹽脅迫處理的誘導(dǎo)表達，將花生基因在花生中超量表達，花生轉(zhuǎn)基因種子在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率達到36%，同時轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強。
7.花生AdC因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于所述花生AdC因的序列表如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的花生基因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于所述花生AdC因受鹽脅迫處理的誘導(dǎo)表達，將花生AdC因在花生中超量表達，花生轉(zhuǎn)基因種子在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率達到49%，同時轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強。
【專利摘要】本發(fā)明提供了花生維生素E合成相關(guān)基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐鹽性中的應(yīng)用，兩基因APG1、APG2的氨基酸序列的同源性為98.6%。本發(fā)明經(jīng)實驗證明，將這2個基因分別在花生中超量表達后，得到活性最高的α生育酚含量明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株，且可明顯增強轉(zhuǎn)基因花生種子和植株的耐鹽性；將這2個基因的反義載體轉(zhuǎn)入花生后，轉(zhuǎn)基因植株的α生育酚含量明顯減少。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锞S生素E合成機制的研究，提高植物的α生育酚含量，改良植物的抗逆性具有重要的理論及實際意義，應(yīng)用前景廣闊。
【IPC分類】C12N15-84, A01H5-00, C12N15-29, C07K14-415
【公開號】CN104774848
【申請?zhí)枴緾N201510141218
【發(fā)明人】隋炯明, 鄭春花, 孔祥遠, 王晶珊, 喬利仙
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年3月30日