利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的敲除IFN-β基因的293T細(xì)胞系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的敲除IFN-β基 因的293T細(xì)胞系。
【背景技術(shù)】
[0002] 293T細(xì)胞由293細(xì)胞衍生而出，293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒ElA基因的人腎上皮細(xì) 胞系，同時(shí)表達(dá)SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)?？梢詮?fù)制。用 Ca3(PO4)2轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)50%。蛋白表達(dá)水平高，轉(zhuǎn)染后2-3天用堿性磷酸酶分析可較容 易地檢測(cè)到表達(dá)的蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞是過(guò)表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外（分泌 的或膜）蛋白的便捷方式。
[0003] IFN-β是在細(xì)菌、病毒、多聚肌苷酸多聚胞苷酸（Poly 1C)、核苷酸等刺激物誘導(dǎo) 下，主要由成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞等產(chǎn)生的一種糖蛋白。HuIFN-β的基因均定位于人第9號(hào)染 色體，HuIFN-β蛋白由166個(gè)氨基酸組成，屬于糖基化蛋白，分子量約23KD，肽鏈中含3個(gè) Cys，分別在17、31和141位，其中31和141位的半胱氨酸之間形成的二硫鍵對(duì)HuIFN-β 的生物學(xué)活性非常重要。IFN-β具有多種生物學(xué)功能，主要包括抗病毒、抑制某些細(xì)胞的 生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)及抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。IFN-β的抗病毒效果針對(duì)不同的病毒，甚 至是同一病毒的不同血清型而不同。其抗病毒的作用機(jī)理主要是通過(guò)兩個(gè)方面實(shí)現(xiàn)：1)通 過(guò)抑制某些病毒的吸附、脫衣殼和轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白合成以及成熟病毒的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗病 毒功能；2)通過(guò)增強(qiáng)自然殺傷NK細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗病毒功 能。IFN-β還可以抑制某些細(xì)胞的生長(zhǎng)，如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及造血細(xì)胞 的增殖，其機(jī)理可能是通過(guò)使細(xì)胞分裂停留在G0/G1期，降低DNA的合成，下調(diào)細(xì)胞原癌基 因的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)某些生長(zhǎng)因子受體表達(dá)。IFN- β還具有免疫調(diào)節(jié)作用，包括促進(jìn)大多數(shù) 細(xì)胞MHC-I類抗原的表達(dá)，活化NK細(xì)胞和殺傷性T淋巴細(xì)胞增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)Τ、 B淋巴細(xì)胞的功能。IFN-β可抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞，主要是通過(guò)促進(jìn)機(jī)體的免疫功能，提高 巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和CT L的殺傷水平。
[0004] CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)是繼ZFN和TALEN技術(shù)之后迅速發(fā)展起來(lái)的第三代基 因組編輯技術(shù)，該技術(shù)來(lái)源于細(xì)菌和古細(xì)菌中存在抵抗噬菌體入侵的CRISPR-Cas獲得性 免疫系統(tǒng)，經(jīng)人工改造而逐漸發(fā)展起來(lái)。CRISPR是指規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列，Cas是 指CRISPR相關(guān)蛋白。CRISPR-Cas基因組編輯技術(shù)是通過(guò)一段RNA來(lái)識(shí)別打靶位點(diǎn)，通過(guò) Cas核酸內(nèi)切酶對(duì)打靶位點(diǎn)附近的核酸進(jìn)行切割來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)編輯，因此該技術(shù) 也叫做RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶技術(shù)。與ZFN和TALEN技術(shù)相比，CRISPR-Cas基因組編輯技 術(shù)在設(shè)計(jì)、合成與陽(yáng)性克隆的篩選上都更為便捷，而且可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)對(duì)多個(gè) 位點(diǎn)進(jìn)行編輯，提高基因編輯的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種敲除IFN- β基因的293T細(xì)胞系。
[0006] 本發(fā)明所提供的敲除IFN-β基因的293Τ細(xì)胞系具體為人胚腎細(xì)胞 293T-K〇-IFN-f3，它在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 10096。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種基于CRISPR-Cas9構(gòu)建敲除IFN-β基因的293T 細(xì)胞系的方法。
[0008] 本發(fā)明所提供的基于CRISPR-Cas9構(gòu)建敲除IFN-β基因的293T細(xì)胞系的方法， 是以序列表中序列1所示IFN-β基因序列中符合5'-GG-18N-NGG-3'或5'-GG-20N-NGG-3' 或5' -CCN-18N-CC-3'或5' -CCN-20N-CC-3'序列排列規(guī)則的序列中的"18N"或"20N"所 示序列為靶序列的；N為A或T或C或G。其中，18N為18個(gè)脫氧核糖核苷酸，20N為20個(gè) 脫氧核糖核苷酸.
[0009] 所述靶序列可為1-2個(gè)；當(dāng)所述靶序列為2個(gè)時(shí)，2個(gè)所述靶序列之間的間隔優(yōu)選 為大于200bp。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述靶序列為序列表中序列1所示IFN-β基因序列的 第216-235位，（記為靶序列1);在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述靶序列為序列表中序列 1所示IFN-β基因序列的第545-562位（記為靶序列2)。
[0011] 更加具體的，所述方法為如下（A)或（B):
[0012] (A)包括如下步驟（al)-(a4):
[0013] (al)合成名稱為正向單鏈DNAl和名稱為反向單鏈DNAl的兩個(gè)單鏈DNA ;所述正 向單鏈DNAl的序列如序列表中序列2所示，為在所述靶序列1的5'端加上ACCG ;所述反 向單鏈DNAl的序列如序列表中序列3所示，為在所述靶序列1的反向互補(bǔ)序列的5'端加 上 AAAC ;
[0014] (a2)將所述正向單鏈DNAl和所述反向單鏈DNAl進(jìn)行退火反應(yīng)，得到雙鏈 DNAl (特異于靶序列1)，該雙鏈具有粘末端，其粘末端與BsaI酶切后的pGL-U6-gRNA質(zhì)粒 的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，可直接進(jìn)行連接反應(yīng)；
[0015] (a3)將所述雙鏈DNAl連接到pGL-U6-gRNA質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶BsaI的切割位點(diǎn) 處，得到的重組質(zhì)粒記為pGL-U6-gRNA-IFN|3 -1 ;
[0016] (a4)將所述 pGL_U6-gRNA_IFN β-I (Puromycin 抗性）和 Cas9 質(zhì)粒（Blasticidin 抗性），共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用Puromycin (3ug/ml)和Blasticidin (3ug/ml)進(jìn)行抗性篩選， 篩選時(shí)間為7天，然后換為正常的DMEM培養(yǎng)基，從轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中獲得IFN-β基因 被敲除的293Τ細(xì)胞系；
[0017] (B)包括如下步驟（bl)-(b4):
[0018] (bl)合成名稱為正向單鏈DNA2和名稱為反向單鏈DNA2的兩個(gè)單鏈DNA ;所述正 向單鏈DNA2的序列如序列表中序列4所示，為在所述靶序列2的反向互補(bǔ)序列的5'端加 上ACCG ;所述反向單鏈DNA2的序列如序列表中序列5所示，為在所述靶序列2的5'端加 上 AAAC ;
[0019] (b2)將所述正向單鏈DNA2和所述反向單鏈DNA2進(jìn)行退火反應(yīng)，得到雙鏈 DNA2 (特異于靶序列2)，該雙鏈具有粘末端，其粘末端與BsaI酶切后的pGL-U6-gRNA質(zhì)粒 的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，可直接進(jìn)行連接反應(yīng)；
[0020] (b3)將所述雙鏈DNA2連接到pGL-U6-gRNA質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶BsaI的切割位點(diǎn) 處，得到的重組質(zhì)粒記為pGL-U6-gRNA-IFN|3 -2 ;
[0021] (b4)將所述 pGL_U6-gRNA_IFN β-2 (Puromycin 抗性）和 Cas9 質(zhì)粒（Blasticidin 抗性），共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，用 Puromycin (3 μ g/ml)和 Blasticidin (3 μ g/ml)進(jìn)行抗性篩 選，篩選時(shí)間為7天，然后換為正常的DMEM培養(yǎng)基，從轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中獲得IFN- β基 因被敲除的293Τ細(xì)胞系；
[0022] 在所述方法的步驟（a2)和（b2)中，所述退火反應(yīng)的條件均可為：97°C作用7min， 然后關(guān)機(jī)，自然降溫lh。
[0023] 在所述方法的步驟（a4)和（b4)中，將所述pGL-U6-gRNA-IFN β -1 (或所述 pGL-U6-gRNA-IFN β -2)和 Cas9 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293Τ 細(xì)胞時(shí)，所述 pGL-U6-gRNA-IFN β -1 (或所 述pGL-U6-gRNA-IFN0-2)和所述Cas9質(zhì)粒的質(zhì)量比可為1:1。
[0024] 利用所述方法制備得到的IFN- β基因被敲除的293T細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0025] 所述IFN-β基因被敲除的293Τ細(xì)胞系具體為所述人胚腎細(xì)胞 293T-KO_IFN-0 CGMCC No. 10096。
[0026] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種成套質(zhì)粒。
[0027] 本發(fā)明所提供的成套質(zhì)粒由所述pGL-U6-gRNA-IFNf3_l