專利名稱:從分化細胞制備干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及制備干細胞。更具體地，本發(fā)明涉及通過將已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)與分化細胞融合而制備干細胞的方法。所得到的胞質(zhì)雜種(cybrid)及其子代展示出干細胞特異性標記物。具體而言，所得到的胞質(zhì)雜種及其子代展示出多能干細胞特異性標記物?，F(xiàn)認識到干細胞可表達與分化細胞相同的人類白細胞抗原(HLA)。
背景技術(shù)：
干細胞是未功能特定化的或未分化的細胞，它們具有產(chǎn)生例如皮膚、神經(jīng)元或者其他器官的細胞等多種不同細胞類型的獨特能力。它們還具有無限期的自我復(fù)制的能力。干細胞具有發(fā)育為特定細胞類型的潛能且能夠無限增殖這一實事，使得干細胞具有多種潛在的用途，例如產(chǎn)生用于移植的器官和組織、用于退行性疾病的細胞治療、基因治療、以及新藥的毒理學(xué)測試。
胚胎干細胞產(chǎn)生自胚胎發(fā)育的最早階段之一——胚泡期。更具體地，胚胎干細胞源自植入子宮壁之前這一階段的胚泡的內(nèi)部細胞團。更重要的是，胚胎干細胞具有多能性，這意味著它們能夠自我更新并能夠分化成為肌體內(nèi)絕大多數(shù)任何類型的細胞，包括所有三個胚層的細胞。
還存在與胚胎干細胞不同的成體干細胞。成體干細胞是未功能特定化的或未分化的細胞，其存在于分化的組織中。成體干細胞能夠分化為其從中產(chǎn)生的組織的細胞類型。成體干細胞可見于骨髓、血液、眼睛的角膜和視網(wǎng)膜、牙齒的牙髓、肝臟、皮膚、胃腸道、以及胰腺。不過，與胚胎干細胞不同的是，沒有跡象表明成體干細胞具有多能性。因此存在制備多能干細胞這一需求。
人胚胎干細胞的一個來源是通過體外受精(IVF)產(chǎn)生的胚胎。IVF技術(shù)使得能夠在實驗室中進行受精和胚胎發(fā)育。一般來說，這種技術(shù)是用來使許多不育夫婦得到孩子。不過，在很多情況下，并非所有如此產(chǎn)生的胚胎都會被使用，所剩下的胚胎可以冷凍并保存。這些胚胎提供了人胚胎干細胞的一個潛在來源?；蛘?，也可采用核移植技術(shù)產(chǎn)生胚胎干細胞，這被稱為治療性克隆。
不過，來自體外受精產(chǎn)生的剩余胚胎的人胚胎干細胞及其用途已經(jīng)引起了一些論理學(xué)問題和政策問題。已經(jīng)在改進例如IVF技術(shù)和治療性克隆等技術(shù)以期解決部分這些問題，不過與應(yīng)用這些技術(shù)相關(guān)的問題依舊存在。
本發(fā)明基于這樣一種認識，即已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)能夠使分化細胞的細胞核發(fā)生“程序重調(diào)(reprogram)”，成為多能干細胞。還認識到所得到的胞質(zhì)雜種與供者分化細胞具有免疫學(xué)相容性。新產(chǎn)生的多能干細胞系可分化為與所述細胞核所來源的細胞表達相同的人類白細胞抗原(HLA)的細胞，由此可避免組織在患者體內(nèi)可能發(fā)生的免疫學(xué)排異反應(yīng)。因此，本發(fā)明旨在解決上面所提到的以及其他的問題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了通過使分化細胞發(fā)生程序重調(diào)成為干細胞而產(chǎn)生干細胞的方法。所述產(chǎn)生干細胞的方法包括以下步驟從已有的胚胎干細胞獲得胞質(zhì)；將所述胞質(zhì)與分化細胞融合以產(chǎn)生胞質(zhì)雜種；培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種以產(chǎn)生干細胞。所得到的胞質(zhì)雜種是多能干細胞。
圖1顯示了生長于薄層生長培養(yǎng)基中的已有的胚胎干細胞系(10x物鏡)；圖2顯示了去核后并以Hoechst 33342染色的已有的胚胎干細胞(20x物鏡)；和圖3顯示了將淋巴細胞與胚胎干細胞胞質(zhì)融合后，培養(yǎng)一至兩周后的干細胞集落(20x物鏡)。
發(fā)明詳述雖然本發(fā)明允許有多種不同形式的實施方式，但本說明書將詳細披露本發(fā)明的至少一種優(yōu)選的實施方式和其他可能的替代性實施方式，同時應(yīng)該認識到，本說明書公開的內(nèi)容應(yīng)該被視為僅僅是在例證本發(fā)明的原則，而無意于將本發(fā)明的廣泛的方面限制在所描述的具體的實施方式中。
本發(fā)明涉及產(chǎn)生干細胞的方法，其中將來自己有的胚胎干細胞的胞質(zhì)與分化的供體細胞融合而產(chǎn)生胞質(zhì)雜種，后者也稱為“干胞質(zhì)雜種(stemcybrid)”其是多能干細胞。認為所產(chǎn)生的干胞質(zhì)雜種表達所述分化的供體細胞的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)，特別是表達與所述分化細胞相同的人類白細胞抗原(HLA)。
本發(fā)明使用的是已有的胚胎干細胞系?？刹捎靡阎姆椒ǐ@得分化的二倍體哺乳動物細胞。優(yōu)選地，對于本發(fā)明所使用的哺乳動物二倍體細胞，其胞質(zhì)的量相對于細胞核而言較少。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用了二倍體哺乳動物淋巴細胞，因為淋巴細胞的胞質(zhì)的量相對于其細胞核而言相對較少。典型地，淋巴細胞僅在其細胞核周邊具有很薄的一圈胞質(zhì)。使用具有很少量胞質(zhì)的分化細胞與已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)進行融合是合適的。由于認識到存在使得宿主細胞核的表型表達發(fā)生改變的某些胞漿因子，因此，優(yōu)選地供體細胞的胞質(zhì)相對于分化細胞的胞質(zhì)要更多?？刹捎靡阎姆椒◤母嗡乜鼓娜搜褐蝎@得人二倍體淋巴細胞，然后以不含Ca、Mg的磷酸緩沖液(PBS)稀釋。
通過將細胞集落在EDTA或EGTA(0.02％，溶于無Ca、Mg的PBS或Hank′s溶液)中解聚(disaggregating)，然后通過100μM的Nylon細胞濾網(wǎng)過濾，制備得到胚胎干細胞懸液。將胚胎干細胞簇以大約80％匯合的密度、在覆有生長培養(yǎng)基(例如Matrigel)的圓形18mm蓋片上生長過夜。培養(yǎng)胚胎干細胞至少18小時。待胚胎細胞解聚后，使所述胚胎干細胞同步化，在細胞融合之前使得它們處于細胞周期的同一期內(nèi)?？梢詫毎M行同步化以便增加細胞融合的效率。
可通過采用已知的方法獲得分化的哺乳動物二倍體細胞來制備分化細胞懸液。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用肝素抗凝的血液制備人二倍體細胞。更優(yōu)選地，采用密度梯度方法制備人類淋巴細胞。以不含Ca、Mg的PBS稀釋人的肝素抗凝血液。優(yōu)選地，人的肝素抗凝血液的量與PBS溶液的比例是1∶2。加入PBS之后，將例如Histopaque 1083這樣的試劑加入到抗凝血液與PBS的混合物中。優(yōu)選地，所加入的Histopaque1083的量是抗凝血液體積的2倍。Histopaque 1083這種試劑的密度被調(diào)整為1.083g/mL，其有助于回收具有活力的單個核細胞。懸浮淋巴細胞所使用的密度梯度是一階梯度。將抗凝血液懸浮于PBS和Histopque之后，在室溫以600G將懸液離心大約30分鐘。離心后的抗凝血液根據(jù)密度被分離，含有血小板的紅細胞沉淀到管底，而淋巴細胞在管中位于梯度上面的一層。取出并處理淋巴細胞層以去除任何殘留的血清，以便制備用于細胞融合的淋巴細胞。
為了提高融合效率，優(yōu)選地在將其去核之前對已有的胚胎干細胞進行同步化。優(yōu)選地，在融合之前，使大約50％的細胞群體停滯在細胞周期中的一個期內(nèi)，更優(yōu)選地使70％的細胞群體停滯在細胞周期中的一個期內(nèi)，且最優(yōu)選地使大約90％的細胞群體停滯在細胞周期中的一個期內(nèi)?？刹捎靡阎姆椒ㄊ挂延械呐咛ジ杉毎交??？筛鶕?jù)細胞的相對大小或者通過多種已知的細胞標記物來區(qū)分細胞周期的各個期。在本發(fā)明中，優(yōu)選地根據(jù)細胞的相對大小來分離已有的胚胎干細胞群。更加優(yōu)選地，在去核之前使已有的胚胎干細胞群停滯在G0/G1期。當細胞處于G0/G1期時，它們不會通過有絲分裂進行活躍增殖。由于淋巴細胞通常處于G0/G1期，因此在融合之前不必進行同步化。
將已有的胚胎干細胞同步化于G0/G1期之后，將其去核以便自細胞分離胞質(zhì)。去核是一種已知的技術(shù)，其中將細胞核自細胞的胞質(zhì)中分離除去?？赏ㄟ^在存在細胞松弛素B(Cytochalasin B)或細胞松弛素D(Cytochalasin D)的情況下在ficoll梯度密度中高速離心對分化細胞進行去核。用于去核的其他試劑包括但不限于那些破壞細胞骨架的肌動蛋白纖絲的生物或者化學(xué)產(chǎn)品。參見Wigler & Weinstein(1975)Biochem.Biophys.Res.Commun.63(3)669-674。對已有的胚胎干細胞進行去核需要采用不同于對分化的和粘附的細胞進行去核的技術(shù)，因為胚胎干細胞的胞質(zhì)與其細胞核相比相對較少，且不能按照與分化細胞例如成纖維細胞相同的方式來分離。對胚胎干細胞進行去核涉及的方法使用高密度支持的溶液，其能夠使得胞質(zhì)在離心過程中保持錨定在玻璃上，同時細胞核則遷移到管底。在一個實施方式中，在ficoll一階梯度中將已有的胚胎干細胞去核。通過混和3.3mL的25％ficoll F400和標準的HTF-HEPES溶液(含4.7mL HTF-HEPES和1.3mL血清代用品(Serum Replacement))來產(chǎn)生所述密度梯度。細胞去核溶液包括3.4 μg/mL細胞松弛素D和0.5μg/mL的Nocodasol。將載有已有的胚胎干細胞的玻璃蓋片面朝底部置于圓形離心管中，蓋片的下方不能有氣泡。將它們在預(yù)熱至35℃的HB-4Bucket Rotor中以20,000G離心，在1小時的離心過程中將溫度保持在36℃。離心結(jié)束后，以含有10％胎牛血清的HTF-HEPES或Hank′s溶液洗滌載有已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)的蓋片，并將其轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的35mm Petri皿中，恢復(fù)2至3小時。然后使用Hoechst 33342(3mkg/mL)在UV顯微鏡下評價去核的效率，如圖2所示。染色的部分是細胞核，而未染色的部分是胞質(zhì)。
獲得去核的已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)和分化細胞(例如淋巴細胞)之后，即可實施細胞胞質(zhì)與分化細胞的融合。在本發(fā)明的一個方面，可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的電方法或者化學(xué)方法進行脂質(zhì)膜的融合。例如，可使用化學(xué)融合劑(聚乙二醇(PEG))以化學(xué)方式實施融合。參見Pontecorvo“Polyethylene Glycol(PEG)in the Production of MammalianSomatic Cell Hybrids”Cytogenet Cell Genet.(1976)16(1-5)399-400。優(yōu)選地，PEG的分子量至少是大約1500。不過，大范圍分子量的PEG分子均可用于進行細胞融合。
胞質(zhì)與分化細胞的融合如下進行自6mL血液中分離哺乳動物淋巴細胞，以Hank′s溶液洗滌細胞并小心地鋪加到附著的已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)之上。將懸液以1500rpm離心10分鐘，以便在去核的已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)與哺乳動物淋巴細胞之間形成緊密接觸。優(yōu)選地，使用每10個淋巴細胞1個胞質(zhì)的比例。將包含40-50％PEG和5％二甲基亞砜(DMSO)的融合劑加至玻璃蓋片上并在室溫孵育60至90秒。隨后通過加入額外的無血清培養(yǎng)基來稀釋所述融合劑(PEG)。然后將無血清培養(yǎng)基更換為生長培養(yǎng)基，并將玻璃蓋片轉(zhuǎn)移至含有Matrigel的Petri皿內(nèi)，并通過在+37℃孵育大約18小時使細胞增殖。
可采用標準方法培養(yǎng)干胞質(zhì)雜種以進一步增殖。例如，將粘附有干胞質(zhì)雜種的玻璃蓋片轉(zhuǎn)移至含有胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層的Petri皿內(nèi)并孵育以便進一步增殖。
在第二周結(jié)束時，出現(xiàn)了初級集落。由已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)與哺乳動物淋巴細胞所形成的融合的干胞質(zhì)雜種進一步增殖，參見圖3和表1。那些沒有融合的已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)以及哺乳動物淋巴細胞則沒有增殖。
采用雜交方法，例如熒光原位雜交(FISH)，進一步篩查與多能干細胞相關(guān)的特異性標記物。篩查結(jié)果見表2。表2表明所得到的干胞質(zhì)雜種含有多能干細胞特異性標記物。
實施例以下實施例是非限制性的，且僅僅是本發(fā)明的各種方面和特征的代表。
實施例1雄性淋巴細胞發(fā)生程序重調(diào)成為多能干細胞采用上述技術(shù)，使用的是來自生殖遺傳學(xué)研究所(ReproductiveGenetics Institute)保藏的已有細胞系96的雌性胞質(zhì)。該已有細胞系含有整倍體核型46，XX。預(yù)測試的淋巴細胞具有二倍體核型46，XY。按照方案中的記載，通過將鋪有15×104個已有的胚胎干細胞的18mm玻璃蓋片在高密度溶液中以20,000g離心1小時，而對已有的胚胎干細胞系96進行去核。在細胞培養(yǎng)基中恢復(fù)2小時后，將已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)在PBS(無血清)中洗滌2次，并將1.5×106個預(yù)分離的淋巴細胞沉積到所述胞質(zhì)的上方。通過含有5％DMSO的40％PEG 1500進行細胞-胞質(zhì)融合。
表1
采用熒光原位雜交篩查分離的克隆的多能干細胞特異性標記物(如下所示)，分離的克隆可以成功地進行冷凍和解凍。
表2
已經(jīng)通過與使用細胞松弛素B和50％PEG 4000去核并進一步培養(yǎng)的小鼠L-細胞的胞質(zhì)融合而使得人類淋巴細胞發(fā)生程序重調(diào)并達到永生化。作為人淋巴細胞與胞質(zhì)相融合的結(jié)果，獲得了一種發(fā)生程序重調(diào)的淋巴樣細胞系。參見Abken et al.，Immortalization of Human Lymphocytesby Fusion with Cytoplasts of Transformed Mouse L Cells，The Journal of CellBiology，September 1986(103)795-805。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生干細胞的方法，其包括以下步驟a.從已有的胚胎干細胞獲得胞質(zhì)；b.將所述胞質(zhì)與分化細胞融合，以產(chǎn)生胞質(zhì)雜種；c.培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種以產(chǎn)生干細胞。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中所述已有的胚胎干細胞源自哺乳動物物種。
3.權(quán)利要求
1的方法，還包括使所述已有的胚胎干細胞停滯在G0/G1期的步驟。
4.權(quán)利要求
1的方法，其中所述獲得胞質(zhì)的步驟包括將所述已有的胚胎干細胞去核的步驟。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中所述獲得胞質(zhì)的步驟還包括分離所述已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)的步驟。
6.權(quán)利要求
1的方法，還包括將所述已有的胚胎干細胞去核以獲得胞質(zhì)的步驟。
7.權(quán)利要求
1的方法，還包括自哺乳動物物種得到所述分化細胞的步驟。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中所述分化細胞包括人類淋巴細胞。
9.權(quán)利要求
8的方法，還包括在融合胞質(zhì)之前使所述人類淋巴細胞停滯在G0/G1期的步驟。
10.權(quán)利要求
9的方法，其中所述融合步驟通過化學(xué)融合完成。
11.權(quán)利要求
1的方法，還包括在培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種以產(chǎn)生干細胞的步驟之前將所述胞質(zhì)雜種轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層上的步驟。
12.權(quán)利要求
11的方法，其中所述飼養(yǎng)層包括成纖維細胞飼養(yǎng)層。
13.權(quán)利要求
1的方法，其中所述胞質(zhì)雜種是干胞質(zhì)雜種。
14.權(quán)利要求
1的方法，其中所述干細胞是多能干細胞。
15.權(quán)利要求
1的方法，其中所述胞質(zhì)雜種表達所述分化細胞的人類白細胞抗原(HLA)。
16.產(chǎn)生胚胎干細胞的方法，其包括以下步驟a.從已有的胚胎干細胞獲得胞質(zhì)；b.將所述胞質(zhì)與淋巴細胞融合，以產(chǎn)生胞質(zhì)雜種；c.培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種以產(chǎn)生干細胞。
17.權(quán)利要求
16的方法，其中所述已有的胚胎干細胞源自哺乳動物物種。
18.權(quán)利要求
16的方法，還包括使所述已有的胚胎干細胞停滯在G0/G1期的步驟。
19.權(quán)利要求
16的方法，其中所述獲得胞質(zhì)的步驟包括將所述已有的胚胎干細胞去核的步驟。
20.權(quán)利要求
19的方法，其中所述獲得胞質(zhì)的步驟還包括分離所述已有的胚胎干細胞的胞質(zhì)的步驟。
21.權(quán)利要求
16的方法，還包括將所述已有的胚胎干細胞去核以獲得胞質(zhì)的步驟。
22.權(quán)利要求
16的方法，還包括自哺乳動物物種得到所述淋巴細胞的步驟。
23.權(quán)利要求
22的方法，還包括在融合胞質(zhì)之前使所述淋巴細胞停滯在G0/G1期的步驟。
24.權(quán)利要求
23的方法，其中所述融合步驟通過化學(xué)融合完成。
25.權(quán)利要求
16的方法，還包括在培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種以產(chǎn)生干細胞的步驟之前將所述胞質(zhì)雜種轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層上的步驟。
26.權(quán)利要求
25的方法，其中所述飼養(yǎng)層包括成纖維細胞飼養(yǎng)層。
27.權(quán)利要求
16的方法，其中所述胞質(zhì)雜種是干胞質(zhì)雜種。
28.權(quán)利要求
16的方法，其中所述干細胞是多能干細胞。
29.權(quán)利要求
16的方法，其中所述胞質(zhì)雜種表達所述分化細胞的人類白細胞抗原(HLA)。
專利摘要
本發(fā)明公開了產(chǎn)生干細胞的方法，并具體公開了通過使分化細胞發(fā)生程序重調(diào)而產(chǎn)生多能干細胞的方法。所述產(chǎn)生干細胞的方法的步驟包括從已有的胚胎干細胞獲得胞質(zhì)；將所述胞質(zhì)與分化細胞融合以產(chǎn)生胞質(zhì)雜種；和培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種以產(chǎn)生多能干細胞。
文檔編號C12N5/16GK1997275SQ20048004360
公開日2007年7月11日 申請日期2004年8月16日
發(fā)明者尼古拉·斯特列利琴科, 尤里·韋爾林斯基 申請人:生殖遺傳學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan