專利名稱：：硫醚類結合物的制作方法將細胞毒藥物連接到抗體上的雙功能化合物是已知的。這些化合物尤其可用于構成對準腫瘤結合抗原的免疫結合物。該免疫結合物可以選擇性輸送有毒藥物到達腫瘤細胞(例如參見Hermentin和Seiler，“InvestigationsWithMonoclonalAntibodyDrugConjugates”，BehringInsti.Mitl.82197～215(1988)；Gallego等，“PreparationofFourDaunomycin-MonoclonalAntibody791T/36ConjugatesWithAnti-TumorActivity”，Int.J.Cancer33737-44(1984)；Amon等，“InVitroandInVivoEfficacyofConjugatesofDaunomycinWithAnti-TumorAntibodies”，ImmunolgicalRev.625～27(1982))。Greenfield等近來報道了含有酰肼化合物3-(2-吡啶基二硫)丙?；ｋ碌?、通過酰腙鍵結合到蒽環(huán)分子13位的酮上，并且該蒽環(huán)衍生物與抗體分子結合的對酸敏感的免疫結合物的構成(Green-field等，歐洲專利公布號0328147，1989年8月16日公布，該專利對應于未決的美國專利系列號70/270,509，1988年11月16日申請，美國專利系列號07/155,181，1988年2月11日申請，現(xiàn)已放棄)。上述后面的參考文獻還公開了具體的含硫醚的連接物和結合物，包括含有腙硫醚的免疫結合物。Kaneko等(美國專利系列號07/522,996，1990年5月14日申請，該專利對應于歐洲專利公布號0,457,250，公布日期1991年11月21日)還公開了含有蒽環(huán)抗菌素的結合物的構成在蒽環(huán)分子的C-13位上通過酰腙連有雙功能的連接物。在他們的發(fā)明中，連接物含有活性的吡啶基二硫或鄰硝基苯基二硫基團，連接物通過這些基團與連接到細胞活性配位體上的合適基團反應，生成完整的結合物。提供在靶槍和藥物分子之間含有對酸敏感鍵的另外化合物用于體內(nèi)治療是有用的。因此，本發(fā)明提供了治療上有效的藥物分子與能夠識別選擇性靶細胞群體的配位體鍵合的新化學。然后，可應用該連接物化學來制備治療上有效的結合物。本發(fā)明還提供了含有該結合物的組合物、制備本發(fā)明結合物的方法、治療或預防有選擇的疾病的方法，該方法包括給病人服用本發(fā)明的結合物，本發(fā)明還提供了制備還原抗體的新方法，該還原的抗體可作為靶槍配位體用于制備本發(fā)明的結合物。按照本發(fā)明，每個藥物分子均經(jīng)過含硫醚的連接物臂連接配位體。藥物是通過酰腙鍵連接連接物。通過配位體上或連接配位體的短的“隔離基團”上的巰基與“邁克爾加成接受體”反應(在反應之后變成“邁克爾加成加合物”)，生成硫醚鍵。在較好的具體實例中，靶槍配位體通過共價硫醚鍵直接地連接在連接物上。上述新的結合物具有通式(I)，其中D為藥物部分，n為整數(shù)1～10，p為整數(shù)1～6，Y為氧或NH2+Cl-，Z為零或1，q為約1～10，X為配位體，A為邁克爾加成加合物部分。在一個具體實例中，藥物部分為蒽環(huán)抗菌素，配位體為抗體。在較好的具體實例中，蒽環(huán)化合物13位酮通過酰腙鍵使蒽環(huán)化合物與結合物的連接物部分結合。在尤其好的具體實例中，上述連接通過還原的二硫化物基團進行(即游離巰基(-SH)在抗體上)。在最好的具體實例中，蒽環(huán)藥物部分為阿霉素，邁克爾加成接受體(由該接受體生成邁克爾加成加合物)為馬來酰亞氨基，抗體部分為嵌合的抗體。本發(fā)明的結合物既保留了選擇性處理靶細胞群體的特性，也保留了治療活性。它們可用于藥物組合物，例如該組合物含有藥學上有效劑量的式(I)化合物以及藥用載體、稀釋劑或賦形劑。圖1A提供了應用SPDP作為巰基化劑制備巰基化抗體的合成反應式。圖1B提供了制備本發(fā)明免疫結合物的合成反應式，其中配位體為SPDP-巰基化的抗體。圖1C提供了制備本發(fā)明免疫結合物的合成反應式，其中配位體為亞氨基四氫噻吩-巰基化的抗體。圖2表示用DTT還原抗體以制備“寬松的”抗體和合成本發(fā)明免疫結合物的方法。圖3提供了本發(fā)明的BR64-阿霉素結合物對L2987腫瘤的體外細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖4提供了本發(fā)明的BR64-阿霉素結合物對L2987腫瘤的體內(nèi)細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖5提供了應用BR64、阿霉素和未結合的配合物(SN7-阿霉素)進行組合物治療的體內(nèi)細胞毒數(shù)據(jù)的比較。圖6提供了本發(fā)明的蛙皮素-阿霉素結合物對H345腫瘤的細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖7提供了寬松的嵌合BR96和SPDP-巰基化的嵌合BR96的阿霉素結合物體外的細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖8提供了寬松的BR64和寬松的嵌合L6的阿霉素結合物對L2987腫瘤的體內(nèi)細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖9～11提供了與游離的阿霉素和未結合的配合物相比，寬松的嵌合BR96的阿霉素結合物對L2987腫瘤的體內(nèi)細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖12提供了寬松的嵌合BR96的阿霉素結合物對MCA7人乳房腫瘤的體內(nèi)細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖13提供了寬松的嵌合BR96的阿霉素結合物對RCA人結腸腫瘤的體內(nèi)細胞毒活性數(shù)據(jù)。圖14為在惰性氣流下于寬松的抗體制劑中，以DTT與抗體的摩爾比為函數(shù)對-SH滴定度的影響圖。下面詳細地進行敘述，以便可以更充分地理解本發(fā)明。本發(fā)明提供了新的藥物結合物，它包括能夠對準經(jīng)選擇的細胞群體的配位體、藥物和含有硫醚的連接配位體和藥物的連接物。藥物通過酰腙鍵連接到連接物上。在較好的具體實例中，配位體通過硫醚鍵直接連接到連接物上。該鍵一般是通過配位體上或間隔基團(例如由下述的SPDP或亞氨基四氫噻吩化學得到)上的活性巰基(-SH)與邁克爾加成接受體反應產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了制備所述藥物結合物和藥用組合物的方法，以及輸送結合物到靶細胞的方法，其中生物技術進行修飾是需要的，本發(fā)明的結合物和藥用組合物可用于例如治療疾病如癌、病毒或其他致病性感染、自身免疫疾病或其他疾病。所述結合物包括至少一種藥物分子，該藥物分子通過本發(fā)明的連接物連接到對所要求的靶細胞群體是活性的靶槍配位體分子上。配位體分子可以是免疫活性的蛋白質，如抗體或其片段、非免疫活性的蛋白質或肽配位體如蛙皮素或識別有關細胞受體的結合配位體如外源凝集素或甾族化合物分子。如以上所述，本發(fā)明的結合物可以用通式(I)表示，其中D為藥物部分，n為整數(shù)1～10，p為整數(shù)1～6，Y為氧或NH2+Cl-，Z為零或1，q為約1～10，X為配位體，A為邁克爾加成加合物。為了更好地理解本發(fā)明，將藥物和配位體逐一進行敘述。然后敘述用于制備結合物的中間體和結合物的合成。藥物熟悉本
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的專業(yè)人員明白，本發(fā)明需要用酰腙鍵通過邁克爾加成加合物和含硫醚的連接物將藥物和配位體連接。本發(fā)明既不受具體藥物的限制，也不受具體配位體的限制。本發(fā)明的連接物可以與具有所需治療作用的、改進生物活性或預防作用的任何藥物一起應用，但用于制備結合物的該藥物僅限于能形成腙鍵的藥物。為了制備該腙，該藥物最好有可用的活性羰基，如能形成腙(即-C＝N-NH-鍵)的活性醛或酮(以“[D-(C＝0)”表示)。藥物腙鍵這里以表示。此外，無論活性是作用在所需部位藥物釋放的結果，或是整個結合物本身作用的結果，可用的活性基團與連接物的反應必須不破壞結合物最終的治療作用。熟悉本
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的專業(yè)人員懂得，對于缺少可用活性羰基的藥物，可以用本
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已知的方法制備含有該羰基的衍生物。從所述衍生的藥物制備的結合物必須保持在作用部位的治療活性，無論該活性是由于整體結合物或是其他方面所致。另外，衍生的藥物(例如前體藥物)必須以藥物治療上有效的形式作用于作用部位。本發(fā)明的連接物可以用于連接基本上所有種類的治療藥物，例如抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗癌藥物、抗支原體劑等。上述構成的藥物結合物可有效地用于通常的目的，雖然相應的藥物用于該目的是有效的，但由于配位體具有固有的輸送藥物到所需細胞位置的能力(這是特別有利的)，因此所述藥物結合物具有更優(yōu)良的效果。此外，由于本發(fā)明的結合物可用于改進的已知的生物反應，因此藥物部分不應看作限于經(jīng)典的化學治療藥物。例如該藥物部分可以是具有所需生物作用的蛋白質或多肽。所述蛋白質可以包括例如毒素(如紅豆毒素、蓖麻毒A、假單胞菌屬外毒素或白喉毒素)；蛋白質如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板誘生的生長因子、組織血漿酶原激活劑；或生物反應變更因子如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。用于本發(fā)明的較好的藥物是細胞毒藥物，特別是用于治療癌的細胞毒藥物。一般來講，所述藥物包括烷化劑、抗增殖劑、微管蛋白結合劑等。較好的細胞毒藥物包括蒽環(huán)類藥物、長春花類藥物、絲裂霉素類、博萊霉素類、細胞毒核苷類、蝶啶類藥物、diynenes和鬼臼毒類。上述各類中特別有效的包括例如阿霉素、洋紅霉素、柔紅霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲蝶呤、二氯甲氨蝶呤、絲裂毒素C、甲基絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，如表鬼臼吡喃葡萄糖甙或鬼臼吡喃葡萄糖甙磷酸酯、苯丙氨酸氮芥、長春堿、長春新堿、異長春堿、長春堿酰胺、環(huán)氧長春堿等。如以上所述，熟悉本
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的專業(yè)人員可以進行化學改變，制得所需的化合物，以便使該化合物的反應更適合制備本發(fā)明結合物的目的。優(yōu)先選擇用作本發(fā)明藥物的細胞毒藥物包括下式化合物，甲氨蝶呤(式2)其中R12為氨基或羥基，R7為氫或甲基，R8為氫、氟、氯、溴或碘，R9為羥基或形成羧酸鹽的基團。絲裂毒素(式3)其中R10為羥基或甲基，博萊霉素(式4)其中R11為羥基、氨基、C1～C3烷氨基、二(C1～C3烷基)氨基、C4～C6聚亞甲基氨基、或笨丙氨酸氮芥(式5)6-巰嘌呤(式6)阿糖胞苷(式7)鬼臼毒素(式8)或其磷酸鹽其中R13為氫或甲基，R14為甲基或噻吩基，長春花生物堿類藥物(式9)其中R15為H、CH3或CHO，當R17和R18獨立地存在時，R18為H，R16和R17中之一為乙基，另一個為H或OH；當R17和R18與它們所連接的碳一起形成環(huán)氧乙烷環(huán)時，則R16為乙基；R19為氫、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO，二氟核苷(式10)其中R21為下式之一的堿基，其中R22為氫、甲基、溴、氟、氯或碘，R23為-OH或-NH2，R24為氫、溴、氯或碘，蒽環(huán)類抗菌素(式11)其中R1為-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2，R3為-OCH3、-OH或-H，R4為-NH2、-NHCOCF3、4-嗎啉基、3-氰基-4-嗎啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、芐胺、二芐胺、氰基甲胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5為-OH、-OTHP或-H，R6為-OH或-H，條件是當R5為-OH或-OTHP時，R6不是-OH。最好的藥物是以上所述的蒽環(huán)類抗菌素(式11)。熟悉本
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的專業(yè)人員懂得，上述結構式包括作為藥物的化合物，或者是藥物的衍生物，它們在本
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具有各種未注冊的名稱或俗名。下表I表示一些蒽環(huán)類藥物以及它們的未注冊名稱或俗名，這些藥物特別優(yōu)先選用于本發(fā)明中。式(II)表I化合物R1R3R4R5R6柔紅霉素aCH3OCH3NH2OHH阿霉素bCH2OHOCH3NH2OHH阿霉素雙乙氧乙酸酯CH2OCOCH(OC2H5)2OCH3NH2OHH洋紅霉素CH3OHNH2OHH去甲氧柔紅霉素CH3HNH2OHH表阿霉素CH2OHOCH3NH2HOH去羥阿霉素CH2OHOCH3NH2HHTHPCH2OHOCH3NH2OTHPHAD-32CH2OCO(CH2)3CH3OCH3NHCOCF3OHH柔紅霉素的另一名稱是柔毛霉素阿霉素的另一名稱是亞德里亞霉素表I所示化合物中，最好的藥物是阿霉素。阿霉素(本申請中也稱為“ADM”)是式(11)蒽環(huán)化合物，其中R1為-CH2OH，R3為-OCH3，R4為-NH2，R5為-OH，R6為-H。配位體熟知本
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的專業(yè)人員懂得“配位體”所包括的范圍，它包括能與某種特定靶細胞群體有關的受體或其他易于接受部分特異性結合、或反應性地締合或絡合的任何一種分子。這種細胞活性分子可以是能夠與所述細胞群體結合或絡合或反應的任何一種分子。而這種細胞群體通常是試圖需要進行治療或者生物學上需要修飾的細胞，藥物能夠通過結合物中的連接物與上述細胞活性分子連接，所述細胞活性分子具有游離的活性巰基(-SH)，或者它能夠被改變?yōu)楹兴鰩€基。這種細胞活性分子的作用是把治療上有效的藥物輸送到配位體能夠與之反應的特定的靶細胞群體。這種分子包括(但不限于)大分子量的蛋白質(通常大于10,000道爾頓)如抗體，較小分子量的蛋白質(通常小于10,000道爾頓)，多肽或肽配位體，以及非肽基配位體。能夠用于形成本發(fā)明結合物的非免疫活性蛋白質、多肽或者肽配位體，可以包括(但不限于)鐵傳遞蛋白、表皮生長因子(EGF)、蛙皮素、促胃液激素、促胃液激素釋放的肽、血小板誘生的生長因子、IL-2、IL-6、腫瘤生長因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β、牛痘生成因子(VGF)、胰島素生成因子及類胰島素生成因子I和II。非肽基配位體可以包括甾族化合物，糖和外源性凝集素等。免疫活性配位體由識別抗原的免疫球蛋白(也稱為“抗體”)及識別抗原的片段組成。特別好的免疫球蛋白是能夠識別腫瘤結合抗原的免疫球蛋白。這里所說的“免疫球蛋白”可以指所有公認的免疫球蛋白類和亞類，例如IgG，IgA，IgM，IgD或IgE。較好的免疫球蛋白是IgG類免疫球蛋白。免疫球蛋白能夠從任何物種誘生出。但最好是來源于人、鼠或兔的免疫球蛋白。此外，免疫球蛋白可以是多克隆的或者單克隆的，最好是單克隆的。正如我們已注意到，熟悉本
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的專業(yè)人員明白，本發(fā)明還包括識別抗原的免疫球蛋白片段的應用。這些免疫球蛋白片段可以包括Fab’、F(ab’)2、Fv或Fab片段，或其他一些識別抗原的免疫球蛋白片段。這些免疫球蛋白片段可以通過蛋白水解酶消化(例如可以用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、還原烷基化法或基因重組技術進行制備。制備這些免疫球蛋白片段的材料和方法，對于熟悉本
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的專業(yè)人員是熟知的。通常可參閱以下文獻Parham，J.Immunology，131，2895(1983)；Lamoyi等；J.ImmunologicalMethods，56，235(1983)；Parham，同上，53，133(1982)；和Matthew等，同上，50，239(1982)。免疫球蛋白可以是“嵌合的抗體”，該術語在本專業(yè)技術中已被確認。同樣，免疫球蛋白也可以是“雙功能的”，或者“雜種的”抗體，也就是說，抗體可以是具有一條臂對一種抗原位點(例如對某種腫瘤結合抗原)具有特異體，而另一條臂能識別另一種不同的靶，例如半抗原，這種半抗原本身可以對抗原攜帶的腫瘤細胞是一種致死性藥物，或者這種半抗原與對該抗原攜帶的腫瘤細胞有致死性的藥物相連接。另外，所述雙功能抗體可以是其中每一條臂對需治療或進行生物學修飾的某種細胞的腫瘤結合抗原的一個不同的抗原決定簇具有特異性?？傊?，這種雜種抗體具有雙重特異性，最好是具有一個或多個對某種選定的半抗原有特異性的結合位點，或者具有一個或多個對某種靶抗原有特異性的結合位點，這種靶抗原包括例如與腫瘤細胞結合的抗原、傳染性微生物攜帶的抗原，或者引起其他疾病的抗原。生物雙功能抗體在專利文獻中已有介紹，例如歐洲專利公布號0105360中，熟悉本
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的專業(yè)人員可參考該文獻。正如已經(jīng)提到過的，該雜種抗體或雙功能抗體可以能過生物學方法，借助于細胞融合技術誘導產(chǎn)生、或者通過化學方法，特別是借助于交聯(lián)劑或形成二硫化物橋的試劑來得到，并且還可以構成整個抗體和/或它們的片段。得到所述雜種抗體的方法已經(jīng)公開，例如見專利合作條約國際申請83/03679，公布于1983年10月27日，以及已公布的歐洲專利申請0217577，公布于1987年4月8日。本申請中已收入這二篇專利作為參考文獻。特別好的雙功能抗體是通過生物學方法從“polydoma”或“quadroma”制備得到的雙功能抗體，或者是用如雙-(馬來酰亞氨基)-甲基醚(“BMME”)或專業(yè)人員熟悉的其他交聯(lián)劑通過化學合成方法得到的雙功能抗體。此外，免疫球蛋白可以是一個單鏈抗體(“SCA”)。它們可以由單鏈Fv片段(“SCFv”)組成，該片段中可變輕鏈區(qū)(“VL”)和可變重鏈區(qū)(“VH”)之間，是通過一個肽橋或借助于二硫化物鏈連接的。并且，免疫球蛋白也可以由具有抗原結合活性的單一的VH區(qū)(dAbs)組成。例如可參見G.Winter和C.Milstein，Nature，349，295(1991)；R.Glockshuber等，Biochemistry29，1362(1990)；E.S.Ward等，Nature341，544(1989)。用于本發(fā)明中特別好的是嵌合的單克隆抗體，特別是對腫瘤結合抗原具有特異性的嵌合抗體。正如本文中所示，術語“嵌合的抗體”是指單克隆抗體，構成這種單克隆抗體的可變區(qū)(即結合區(qū))，具有同一來源或來自同一物種，并且其穩(wěn)定區(qū)至少有一部分具有不同來源或來自不同的物種，這種嵌合的單克隆抗體通常是借助DNA重組技術制備的。由鼠可變區(qū)和人穩(wěn)定區(qū)構成的嵌合抗體，在本發(fā)明的某些應用中是特別好的，尤其是用于人疾病的治療，因為這種抗體容易被制備，并且與純的鼠單克隆抗體相比具有更小的免疫原性。這種鼠/人嵌合抗體是免疫球蛋白基因的表達產(chǎn)物，這種基因由編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段和編碼人免疫球蛋白穩(wěn)定區(qū)的DNA片段構成。本發(fā)明所包括的其他形式的嵌合抗體是其類或亞類已被修飾或改造的不同于原先的抗體。這種“嵌合”的抗體也稱為“類-夾心抗體”。制備嵌合抗體的方法包括目前本
技術領域：
已熟知的常規(guī)的DNA重組和基因轉染技術。參見例如Morriso，S.L.等，Proc.Nat’lAcadSci.，81，6851(1984)。術語“嵌合的抗體”的涵義包括“人屬性化抗體”的概念，與親本免疫球蛋白相比，其結構框架或“互補性決定區(qū)”(“CDR”)已被修飾為包括具有不同特性的免疫球蛋白的CDR。在較好的具體實例中，鼠互補性決定區(qū)(CDR)被移殖到人抗體的結構框架之中，其目的是制備“人屬性化抗體”。參見例如L.Riechmann等，Nature332，323(1988)；M.S.Neuberger等，Nature314，268(1985)。特別好的互補性決定區(qū)是與嵌合和雙功能抗體識別上述抗原的代表性程序相符合。讀者參見歐洲專利申請0239400(1987年9月30日公布)中有關CDR修飾抗體的論述。它已被收編在本申請中作為參考。熟悉本專業(yè)的人員都將認識到，雙功能-嵌合的抗體可以被制備出，這種抗體不但具有嵌合抗體或人屬性化抗體的較低免疫原性的優(yōu)點，并且具有上述雙功能的適應性，特別是針對治療性處理?？梢匀斯ず铣缮鲜鲭p功能-嵌合的抗體，例如可用交聯(lián)劑通過化學合成的途徑制備，和/或應用上述類型重組技術制備。無論如何也不應該認為本發(fā)明局限在用任一具體方法生產(chǎn)抗體的范圍，不論這種抗體是雙功能抗體，嵌合抗體，雙功能-嵌合抗體，人屬性化抗體，或者是識別抗原的片段或其衍生物。此外，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括與某些活性蛋白質融合的各種免疫球蛋白(如上面已經(jīng)確定的)或者免疫球蛋白片段，這種活性蛋白質可以是Nuberger等(專利合作條約國際申請86/01533，已于1986年3月13日公布)公開的某種類型的酶。這些產(chǎn)品的有關資料也收入在本申請中作為參考。已經(jīng)注意到，“雙功能抗體”，“融合抗體”，“嵌合抗體”(包括人屬性化的嵌合抗體)和“雙功能-嵌合抗體”(包括人屬性化的雙功能-嵌合抗體)，就其單獨而言，其結構也包括各種識別抗原片段組成的結構。熟悉本項技術的專業(yè)人員還會認識到，所述片段可以用傳統(tǒng)的酶切方法制備，即對完整的雙功能抗體，嵌合抗體，人屬性化抗體或嵌合-雙功能抗體進行酶切。但是，如果由于結構性質的原因，這些完整的抗體對這種酶切不敏感，那么上述結構片段可以通過用作起始物的免疫球蛋白片段來制備；或者如果應用基因重組技術，其DNA序列本身可被修整編碼成所需要的“片段”，這種片段在表達時，可以在體內(nèi)或體外應用化學或生物學的方法，制備成最終所需要的完整的免疫球蛋白“片段”。因此，在這方面使用了術語“片段”一詞。此外，如上所述，本發(fā)明中使用的免疫球蛋白(抗體)或其片段，就其性質來說，可以是多克隆的，也可以是單克隆的。但是，最好使用單克隆抗體。制備所述多克隆抗體或單克隆抗體的方法，現(xiàn)在對于本專業(yè)技術人員是熟知的，當然他們完全能夠制備出可用于本發(fā)明的有效的各種免疫球蛋白。例如參見G.Kohler和C.Milstenin，Nature256，495(1975)。此外，雜種體和/或由該雜種體產(chǎn)生并用于本發(fā)明實踐的單克隆抗體，可方便地從下列來源得到，例如AmericanTypeCultureCollection(“ATCC”)12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，或者可以從Boehringer-MannheimBiochemicals，P.O.Box50816，Indianapolis，Indiana46250買到。用于本發(fā)明的特別好的單克隆抗體是能識別腫瘤結合抗原的單克隆抗體。但是并不局限于此，并可以包括下列多種單克隆抗體，例如被識別的抗原位點單克隆抗體參考文獻肺癌KS1/4N.W.Varki等，CancerRes.44681，1984.534，F(xiàn)8；F.Cuttitta等，G.L.Wright編輯，604A9MonoclonalAntibodiesandCancer，MarcelDekker，Inc.，NY.，P.161，1984.鱗狀肺G1，LuCa2，Kyoizumi等，CancerRes.453274，LuCa3，LuCa41985.小細胞肺癌TFS-2Okabe等，CancerRes.451930，1985.結腸癌11.285.14G.Rowland等，CancerImmunol.14.95.55Immunother.，191，1985.NS-3a-22，Z.Steplewski等，CancerRes.41NS-10，2723，1981.NS-19-9，NS-33a，NS-52a，17-1A癌胚MoAb35或Acolla，R.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，ZCEO25(USA)，77563，1980.黑色素癌9.2.27T.F.BumolandR.A.Reisfeld，Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)，791245，1982.P9796.5K.E.Hellstrom等，MonoclonalAntibodiesandCancer，見上述引文P.31.抗原T65T101Boehringer-Mannheim，P.O.Box50816，Indianapolis，IN46250.鐵蛋白抗鐵蛋白Boehringer-Mannheim，P.O.Box50816，Indianapolis，IN46250.R24W.G.Dippold等，Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA).776114，1980.成神經(jīng)細胞瘤P1153/3R.H.KennetandF.Gibert，Science，2031120，1979.MIN1J.T.Kemshead，MonoclonalAntibodiesandCancer，見上述引文P.49.UJ13AGodman等，Pediatrics，105252，1984.神經(jīng)膠質BF7，GE2，N.deTribolet等，Monoclonal細胞瘤CG12AntibodiesandCancer，見上述引文P.81.神經(jīng)節(jié)苷脂L6I.Hellstrom等，ProcNatl.Acad.Sci.，(USA)，837059(1986)；U.S.Pat.Nos.4,906,562(1990，3，6頒布)及4,935,495(1990，6，19.頒布).嵌合的L6U.S.Ser.No.07/923,244(申請日期1986，10，27.)，對應于專利合作條約國際申請88/03145(1988，5，5.公布).LewisYBR64U.S.Ser.Nos.07/289,635(申請日期1988，12，22)，U.S.Ser.No.07/443,696(申請日期1989，11，29.)，對應于歐洲專利0375562(1990，6，27.公布).墨角藻糖BR96U.S.Ser.Nos.07/374,947(申請日基化的期1989，6，30.)，LewisY嵌合的BR64U.S.Ser.No.07.544,246(申請日期1990，6，26.)對應于專利合作條約國際申請91/00295(1991，1，10.公布).乳腺癌B6.2，B72.3D.Colcher等，MonoclonalAntibodiesandCancer，見上述引文P.121.生骨肉瘤791T/48，M.J.Embleto、ibid，P.181.791T/36白血病CALL2C.T.Teng等，Lancet，101，1982.抗遺傳型R.A.Miller等，N.Eng.J.Med.，306517，1982.卵巢癌OC125R.C.Bast等，J.Clin.Invest.，681331，1981.衰竭性癌D83.21，P6.2，J.J.Starling等，MonoclonalTurp-27AntibodiesandCancer，見下述引文P.253.腎癌A6H，D5DP.H.Lange等，Surgery，98143，1985.在最好的具體實例中，含有結合物的配位體是從嵌合的抗體BR96得到的，在U.S.Ser.No.07/544,246(申請日期1990年6月26日)中已公開了ChiBR96，該專利與專利合作條約國際申請91/00295(1991年1月10日公開)對應。嵌合的抗體BR96(ChiBR96)是內(nèi)在化的鼠/人嵌合抗本，并且正如已注意到的，它與墨角藻糖基化的lewisY抗原有反應活性，而這種LewisY抗原是通過人腫瘤細胞(例如從乳腺癌、肺癌、結腸癌和卵巢癌得到的腫瘤細胞)表達的抗原。表達嵌合抗體BR96的，并被選定為ChiBR96的雜種體已經(jīng)于1990年5月23日按布達佩斯公約存入美國標準菌種保藏(“ATCC”)，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852。這種雜種體的樣品可以根據(jù)其登記號ATCCHB10460得到。嵌合抗體BR96的一部分可以從其源親本抗體BR96得到。表達抗體BR96的雜種體也已經(jīng)于1989年2月21日按布達佩斯公約存入ATCC，并從登記號HB10036可以獲取。培養(yǎng)所希望的雜種體，產(chǎn)生的抗體可以用本
技術領域：
專業(yè)人員熟知的一般技術從培養(yǎng)細胞的上清液中分離出。參見例如“MonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications”，Hurell編輯，CRC印刷，1982。在另一個十分好的具體實例中，免疫復合物是來自BR64鼠單克隆抗體，該單克隆抗體已經(jīng)在如下專利中公開U.S.Ser.Nos.07/289,635(申請日期1988年12月22日)，以及07/443,696(申請日期1989年11月29日)，它對應于歐洲專利公布的申請0375562(1990年6月27日公布)。如上所述，上述抗體也是內(nèi)在化的，并且該抗體與來自人結腸癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌的腫瘤細胞表達的LewisY抗原有反應活性。表達抗體BR64的，并稱為BR64的雜種體，已經(jīng)于1988年11月3日按布達佩斯公約存入ATCC，可以根據(jù)登記號HB9895得到。培養(yǎng)這種雜種體，所希望的抗原可以用本
技術領域：
專業(yè)人員熟知的一般技術分離出。參閱上述所列出的文獻。在第三個十分好的具體實例，本發(fā)明的免疫結合物是來自鼠單克隆抗體L6，在如下專利中已經(jīng)公開了這種單克隆抗體U.S.PatentNos.4,906,562，已于1990年3月6日頒布，以及4,935,495已于1990年6月19日頒布。L6是非內(nèi)在化抗體，它對神經(jīng)節(jié)苷脂抗原具有活性，這種抗原是由人腫瘤細胞表達的抗原，而這種人腫瘤細胞則來源于人的非小細胞肺癌、乳腺癌、結腸癌或卵巢癌等。表達單克隆抗體L6的，并稱為K6的雜種體也已經(jīng)按布達佩斯公約于1984年12月6日存入ATCC。根據(jù)登記號HB8677可以獲取。培養(yǎng)這種雜種體，參照上述文獻中的一般技術，可以分離出所希望的抗體。如果需要，L6抗體的嵌合形式已經(jīng)在U.S.SerialNo.07/923,244中敘述，該專利與專利合作條約國際申請88/03145(1985年5月5日公布)對應。1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5為-OH、-OTHP或-氫，R6為-OH或-氫，條件是當R5為-OH或-OTHP時，R6不是-OH，n為整數(shù)1～10，R為邁克爾加成接受體。用于本發(fā)明的最好的中間體為式(IIc)化合物，其中R1、R3、R4、R5和R6的定義同以上式(IIb)。也用作為本發(fā)明中間體的是含有自由的活性巰基的靶槍配位體。該巰基可以包含在原有的靶槍配位體內(nèi)，或者可以由配位體或配位體衍生物直接地得到。在制備本發(fā)明結合物較好的方法中，配位體或變化的配位體上的巰基可以直接地與式(IIa)中間體邁克爾加成接愛反應，生成最終的結合物。應用該方法，每個配位體一般可以連接約1～10個藥物分子。因此，在式(I)中，q可以為約1～10。當結合物生成時，邁克爾加成接受體變成本發(fā)明中應用的“邁克爾加成加合物”。因此，例如，正象本
技術領域：
專業(yè)人員所了解的，如果式(IIa)或(IIb)化合物中的邁克爾加成接受體為馬來酰亞氨基，那么最終結合物式(I)的“邁克爾加成加合物”部分將是琥珀酰亞氨基。因此，“邁克爾加成加合物”是指經(jīng)邁克爾加成反應得到的有邁克爾加成接受體的部分，詳見以下更詳細的敘述。因此，本發(fā)明更進一步的具體體現(xiàn)是提供制備以上定義的式(I)化合物的方法，該方法包括使以上定義的式(IIa)化合物與含有或經(jīng)修飾或者衍生為含有活性巰基的配位體反應，如果需要，將產(chǎn)物進行分離。這是制備式(I)化合物較好的方法。另外，式(I)化合物可以由藥物或經(jīng)改變的藥物與共價連接配位體、經(jīng)修飾的配位體或衍生的配位體的?；ｋ逻B接物部分直接地反應而制得。特別是本發(fā)明提供了制備式(I)化合物的方法，該方法包括(a)使式(IIa)化合物與式(III)化合物反應，或者(b)使化合物[D-(C＝0)]與下式化合物反應，并且如果需要，將產(chǎn)物進行分離，其中D、n、p、Y、Z、q、X、R和A的定義同上。熟悉本
技術領域：
的專業(yè)人員懂得，在合成本發(fā)明化合物中，當所需要的反應在分子的其他部位進行時，需要保護或封閉起始化合物和中間體上的各種活性官能團。在所需要的反應完成之后或者在任一所要求的時候，通常需將上述保護基用例如水解或氫解法脫去。所述保護或脫保護步驟在有機化學中是常用的。關于在制備本發(fā)明化合物中有用的保護基，熟悉本
技術領域：
的專業(yè)人員可參閱ProtectiveGroupsinOrganicChemistry，Mcomie編輯，PlenumPress，N.Y.，N.Y.(1973)；ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，Greene編輯，JohnWiley&Sons，紐約(1981)。舉例來說，有用的氨基保護基可以包括例如C1～C10鏈烷?；?，如甲?；⒁阴；?、二氯乙?；?、丙?；?、己?；?、3，3-二乙基己?；?、γ-氯丁?；?；C1～C10烷氧基羰基和C5～C15芳氧基羰基，如叔丁氧基羰基、芐氧基羰基、烯丙氧基羰基、4-硝基芐氧基羰基和肉桂酰氧基羰基；鹵素-(C1～C10)烷氧基羰基，如2，2，2-三氯乙氧基羰基；以及C1～C15芳烷基和鏈烯基，如芐基、苯乙基、烯丙基和三苯甲基等。其他通常應用的氨基保護基是與β-酮-酯如甲基或乙基乙酰基乙酸酯制得的烯胺形式。常用的羧基保護基可以包括例如C1～C10烷基，例如甲基、叔丁基、癸基；鹵素-C1～C10烷基，如2，2，2-三氯乙基和2-碘乙基；C5～C15芳烷基，如芐基、4-甲氧基芐基、4-硝基芐基、三苯基甲基、二苯基甲基；C1～C10鏈烷酰氧基甲基，如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；以及例如苯甲酰甲基、4-鹵素苯甲酰甲基、烯丙基、二甲基烯丙基、三(C1～C3烷基)甲硅烷基如三甲基甲硅烷基、β-對甲苯磺?；一ⅵ?對硝基苯基-硫乙基、2，4，6-三甲基芐基、β-甲基硫乙基、鄰苯二甲酰亞氨基甲基、2，4-二硝基苯基亞磺?；?、2-硝基二苯甲基以及有關的基團。同樣，有用的羥基保護基可以包括例如甲?；?、氯乙?；?、芐基、二苯甲基、三苯甲基、4-硝基芐基、三甲基甲硅烷基、苯甲酰甲基、叔丁基、甲氧基甲基、四氫吡喃基等。一般來講，含有中間體邁克爾加成接受體的腙藥物衍生物(式(IIa)、(IIb)或(IIc))可以根據(jù)所應用的邁克爾加成接受體，按方法A中敘述的通法，通過藥物(或衍生的藥物)與含有酰肼的邁克爾加成接受體反應制得方法A如以下所述，當邁克爾加成接受體為馬來酰亞氨基時，方法A是較好的方法。另外，式(IIa)化合物可以按方法B所述的通法，通過藥物與酰肼反應，生成中間體腙藥物衍生物，接著使該化合物與含有邁克爾加成接受體的部分反應，方法B在方法A和方法B中，D、n和R的定義同前。在方法B中，L代表能進行親核取代的離去基團，如鹵素、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，而C代表可使邁克爾加成接受體R成為良好親核試劑的基團。C所代表的特別有用的基團包括堿金屬離子如Na+、K+或Li+。本
技術領域：
的專業(yè)人員懂得，“邁克爾加成接受體”是能夠與親核試劑反應的部分，以便經(jīng)歷為邁克爾加成反應所特有的親核加成反應。如以上所述，在發(fā)生親核加成以后，邁克爾加成接受體部分稱為“邁克爾加成加合物”。通常用于方法A的邁克爾加成接受體可以包括如α，β-烯酸或α，β-硫代酸，例如含有-C＝C-COOH、-C＝C-C(O)SH、-C＝C-C(S)SH或-C＝C-C(S)OH基團的化合物；α，β-烯酸酯或硫代烯酸酯，其中烷基部分不是甲基或乙基，例如含有-C＝C-COOR、-C＝C-C(S)OR、-C＝C-C(S)SR或-C＝C-C(O)-SR基團的化合物，這里R為除甲基或乙基之外的形成酯的基團；α，β-烯酰胺、酰亞胺、硫代酰胺和硫代酰亞胺(無論是環(huán)狀的或非環(huán)狀的)，例如含有-C＝C-CONR2、-C＝C-CONHCO-、-C＝C-CSNR2、-C＝C-CSNHCO-或-C＝C-CSNHCS-基團的化合物，無論是環(huán)狀的或非環(huán)狀的，并且其中-CONR2或-CSNR2代表伯、仲或叔酰胺或硫代酰胺；α，β-炔酸或硫代炔酸，例如含有-C≡C-COOH、-C≡C-C(S)OH、-C≡C-C(S)SH或-C≡C-C(O)-SR的化合物；α，β-炔酯，例如含有-C≡C-COOR、-C≡C-C(S)OR、-C≡C-C(S)SR或-C≡C-C(O)-SR的化合物，其中R為除甲基或乙基之外的形成酯的基團；α，β-烯腈，例如含有-C＝C-C≡N的化合物；邁克爾加成活性的環(huán)丙烷衍生物，例如1-氰基-1-乙氧基羰基環(huán)丙烷溴化乙烯基二甲基锍，例如含有-C＝C-S+(Me)2Br-的化合物；α，β-烯砜，例如含有的化合物；α，β-烯硝基化合物，例如含有-C＝C-NO2的化合物；α，β-烯鏻，例如含有基團的化合物；含有基團如C＝C-C＝N的化合物，在芳香族雜環(huán)中有例如2-或4-乙烯基吡啶；或者是含有α，β-不飽和锍離子的化合物，如用于方法B的邁克爾加成接受體可以包括α，β-烯醛，例如含有-C＝C-CHO的化合物；α，β-烯酮，例如含有的化合物；α，β-烯酯或硫代烯酯，例如含有-C＝C-COOR、-C＝C-C(S)OR、-C＝C-C(S)SR或-C＝C-C(O)-SR的化合物，其中R為形成酯的甲基或乙基，例如；α，β-炔醛或酮，例如含有-C≡C-CHO或-C≡C-CO-的化合物；α，β-炔酯或硫代炔酯，例如甲基或乙基作為酯的烷基部分，例如含有-C≡C-COOR、-C≡C-C(S)OR、-C≡C-C(O)SR或-C≡C-CSSR的化合物，其中R為形成酯的甲基或乙基。熟悉本
技術領域：
的專業(yè)人員對可用于本發(fā)明的其他邁克爾加成接受體是熟悉的。對于一般的邁克爾加成反應的討論，讀者可參閱E.D.Bergman，D.Ginsberg和R.Pappo，Org.React.10，179～555(1959)；和D.A.Oare和C.H.Heathcock，TopicsinStereo-chemistry，Vol.20，E.L.Eliel和S.H.Wilen編輯，JohnWiley和Sons，Inc.(1991)，以及其中所引的參考文獻。用于制備式(IIa)、(IIb)或(IIc)中間體的準確的反應條件是取決于反應中所應用的藥物和邁克爾加成接受體的特性。本發(fā)明最好的中間體為以上式(IIc)所示，其中藥物部分是蒽環(huán)藥物，并且邁克爾加成接受體是馬來酰亞氨基。如以前所述，關于該反應，可以應用上面所述的方法A。對于與配位體(巰基化的、修飾的或相反的情況)的反應，在最終結合物中，中間體的馬來酰亞氨基邁克爾加成接受體變成琥珀酰亞氨基(“邁克爾加成加合物”)。固有地存在含有巰基的配位體(即配位體未修飾)，或者可以制備，例如(a)通過與巰基化劑如SMCC或N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(“SPDP”)反應，接著還原產(chǎn)物；(b)與亞氨基四氫噻吩(“IMT”)反應，使原有的配位體巰基化；(c)如果配位體(如蛋白質肽或多肽)不具有活性的、有用的巰基，那么加入含有巰基的氨基酸殘基(如半胱氨酸殘基)到該配位體上；(d)應用還原劑如二硫蘇糖醇(“DTT”)還原原有分子中的二硫化物鍵。方法(d)是用于本發(fā)明結合物中制備抗體分子中巰基最好的方法。如果將巰基化試劑(例如SPDP或亞氨基四氫噻吩)用于制備本發(fā)明的結合物，那么熟悉本
技術領域：
的專業(yè)人員懂得，短的“間隔基團”殘基將插在式(I)結合物中邁克爾加成接受體部分和配位體之間。在該情況下，式(I)化合物中Z為1。在該情況下，其中配位體上游離的巰基可以直接地應用，例如應用DTT還原的配位體(特別是應用例如DTT制備“寬松的”抗體)，或者其中活性殘基如半胱氨酸插入分子的配位體部分，那么式(I)中Z為零，并且直接的硫醚鍵將存在于分子中結合的配位體與邁克爾加成部分之間。為了形成結合物，將巰基化的配位體或自由活性巰基的配位體與含有邁克爾加成接受體的式(IIa)腙進行反應。一般來講，關于配位體、藥物以及連接到配位體上所需藥物的數(shù)目，必須選擇反應條件。例如，熟悉本
技術領域：
的專業(yè)人員懂得，連接到配位體上的藥物分子的平均數(shù)目可以進行變化，通過(1)以結合物的配位體上活性巰基的數(shù)目為基準，改變中間體藥物-腙(式(IIa))的量；或者(2)(a)例如僅部分地還原該配位體，改變配位體上活性巰基的數(shù)目(在蛋白質、肽或多肽情況下)，(b)引入有限數(shù)量的半胱氨酸殘基到蛋白質、肽或多肽中，或(c)用少于最大量的巰基化劑如SPDP或亞氨基四氫噻吩，限制巰基化的程度。特別對于寬松的抗體來說，雖然-SH滴定度可以改變，但是自由巰基最好的數(shù)量是應用所述特定試劑可以得到的最大數(shù)目。-SH滴定度變化的程度在寬松的抗體步驟中可容易地控制。例如圖14表明了在37℃反應1.5小時，DTT與配位體的摩爾比對抗體BR64和嵌合的抗體BR96的-SH滴定度的影響。熟悉本
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的專業(yè)人員懂得，不同種類或不同亞類的免疫球蛋白可以有不同數(shù)目的對試劑如DTT還原作用敏感的二硫化物橋。因此，在測定所需水平的結合抗體或抗體片段中，更重要的是可用于還原為自由-SH基團的二硫化物基團的數(shù)量。但是，一般來說，按已知反應的平均值計算，較好的式(I)結合物是每個配位體分子有約1～10個藥物分子。藥物與配位體摩爾比(“MR”)尤其好的平均值是約4～8。在結合物的反應完成之后，可以將結合物進行分離，并用通常已知的透析、層析和/或過濾方法進行純化。通?？梢詫⒑薪Y合物的最終溶液進行冷凍干燥，以便得到干燥、穩(wěn)定形式的結合物，該結合物可以可靠地貯存和運輸。為了服用，最終可以將冷凍干燥的產(chǎn)品用無菌水或其他合適的稀釋劑重新進行配制。另外，在服用之前可以將最后的產(chǎn)品進行冷凍(例如用液氮進行冷凍)，解凍和溫至室溫。在第一個較好的具體實例中，式(IIa)蒽環(huán)腙可以通過蒽環(huán)與馬來酰亞氨基-(C1～C10)-烷基酰肼或其鹽反應制備。該反應已在上面方法A的敘述中概述。該反應一般按二步進行。第一步，制備馬來酰亞氨基-(C1～C10)-烷基酰肼或其鹽。用例如層析和/或結晶法純化之后，使酰肼的游離堿或其鹽與所需的蒽環(huán)或蒽環(huán)鹽反應。反應溶液經(jīng)濃縮后，收集含有馬來酰亞氨基的腙反應產(chǎn)物(式IIa)，并且如果需要，按一般的純化方法進行純化。然后將式(IIa)腙與上述含巰基的抗體進行反應。如果該抗體需巰基化，例如用N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(“SPDP”)，那么巰基化反應通常按二步進行(1)使抗體上游離的氨基與SPDP反應；(2)用DTT還原二硫化物SPDP，得到游離的-SH基團。在較好的方法中，步驟(1)的巰基化反應中SPDP/抗體摩爾比的范圍為約7.5∶1～60∶1，這取決于所需的巰基數(shù)目，尤其對于BR64來說，較好的比例范圍是約7.5∶1～約30∶1，對于BR96來說，較好的比例范圍是約20∶1。反應在約0℃～50℃進行，并且最好的反應溫度是約30℃。反應可以在pH范圍約6～8之間進行，最好的pH是約7.4。步驟(2)中的還原反應最好用DTT進行，應用DTT/SPDP的摩爾比為約2.5∶1～10∶1。DTT/SPDP最好的摩爾比為5∶1，并且SPDP的摩爾數(shù)是加在反應步驟(1)中的摩爾數(shù)。反應通常在約0℃～40℃，最好在0℃進行，并且反應通常在約20分鐘后完成。巰基化的配位體(在最好的具體實例中為抗體)溶液經(jīng)透析和濃縮之后，測定配位體上巰基的摩爾濃度，并以配位體上活性巰基的摩爾量為基準，使巰基化的配位體與所需摩爾比的式(IIa)腙衍生物進行反應。該比例至少為約1∶1較好。反應一般在約0℃～25℃，最好在約4℃進行。然后將得到的結合物通過一般的方法進行純化。該反應式見圖1a和1b。在第二個較好的具體實例中，按以上所述制備式(IIa)腙。然后按圖1c所示，使腙與預先用亞氨基四氫噻吩(“IMT”)巰基化的抗體進行反應。配位體(抗體較好)用IMT進行巰基化通常為一步反應。IMT/抗體的比例可以在約30∶1～80∶1，最好為50∶1。反應進行約30分鐘～2小時，最好為約30分鐘，pH為約7～9.5，最好為約9，溫度為約20℃～40℃，最好為約30℃。然后使反應產(chǎn)物與式(IIa)腙于約0℃～25℃，最好在約4℃，pH約7～9.5，最好為約7.4進行反應。然后用本
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一般的方法，例如透析、過濾或層析，將結合物進行純化。在第三個尤其好的具體實例中，中間體腙(式IIa)按上述方法進行制備。然后使該腙與配位體(最好是抗體)反應，其中至少一個二硫化物基團被還原形成至少一個巰基。尤其好的配位體是以下所述的“寬松的抗體”。制備游離巰基的較好的還原劑是DTT，但是熟悉本
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的專業(yè)人員明白，其他的還原劑也適用于本目的?！皩捤傻摹笨贵w是其中有一個或一個以上，較好的是三個或三個以上的二硫化物橋已被還原的抗體。寬板的抗體最好是其中至少有四個二硫化物橋被還原。在制備寬松的(即還原的)抗體較好的方法中，還原(尤其是用DTT還原)和反應產(chǎn)物的純化是在沒有氧存在的情況下，于惰性氣流(例如在氮或氬氣流)中進行。如以下詳細敘述，該方法便于人們小心地控制還原的程度。因此，該方法使熟悉本
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的專業(yè)人員在任何時候均可以再制備所需還原程度的配位體，以及得到可用于制備本發(fā)明結合物的游離的-SH數(shù)目。在另一方法中，反應是在環(huán)境條件下進行，但是最好應用充分大量的還原劑(最好是DTT)，以便克服已還原的二硫化物鍵可能發(fā)生的重新氧化。在上述任一情況下，反應完成之后應盡快將產(chǎn)品進行純化，并且最好在惰性氣流如氬或氮氣流下進行。但是制備含有游離巰基的配位體較好的方法是從反應液中排除大氣中的氧。用兩個方法中的任一方法制備的抗體稱為“寬松的”抗體。但是應將得到的抗體盡快地用于以后的反應或貯存在避免與氧接觸的條件下，并且最好在惰性氣流下反應或貯存。在從反應中排除氧(即反應最好在惰性氣流下進行)的方法中，將配位體與摩爾過量的DTT一起溫育約30分鐘～4小時，最好約3小時。DTT/配位體的比例取決于所需的巰基數(shù)目，可以為約1∶1～20∶1，較好的是約1∶1～10∶1，最好是約7∶1～10∶1。對于在氧存在下的還原作用，DTT與配位體的比例范圍為約50∶1～400∶1，較好的是約200∶1～300∶1。后者反應進行約1～4小時，較好的是1.5小時，反應溫度在約20℃～50℃，較好的是約37℃。反應在pH約6～8，較好的是在7～7.5下進行。然后用一般的方法如透析、過濾和/或層析將產(chǎn)品進行純化。較好的純化方法是透析過濾法。為了防止-SH的再氧化，在純化或貯存時最好將產(chǎn)物保持在惰性氣流下，以便排除與氧接觸。熟悉本
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的專業(yè)人員明白，不同的配位體(尤其是抗體)對還原和/或再氧化作用具有不同程度的敏感性。因此，需要改變以上所述的還原作用的條件，以便得到如以上所述特定的還原配位體。此外，用于結合物制備的還原抗體另外的制備方法，對于熟悉本
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的專業(yè)人員來說是明白的。因此，用于制備式(I)結合物的制得的還原配位體也包括在本發(fā)明中。為制備以上所述式(I)結合物，將已還原的抗體反應產(chǎn)物與式(IIc)腙中間體反應。反應在惰性氣流中于約0℃～10℃(最好在約4℃)和pH約6～8(最好約7.4)進行較好。應用一般的方法如透析、過濾或層析將免疫結合物進行純化。本發(fā)明的另一具體實例是將式(II)蒽環(huán)連接到帶有游離巰基的配位體上。在該實例中，配位體是非抗體配位體，如蛙皮素?？梢詫€基(例如半胱氨酸的殘基部分)加到原有的蛙皮素分子上。蒽環(huán)通過腙部分連接含有邁克爾加成接受體的部分，然后使其與修飾的蛙皮素反應，以便生成式(I)結合物。再將該產(chǎn)物用一般的技術如透析、離心或層析進行純化。本發(fā)明另一具體體現(xiàn)是提供了治療疾病或修飾生物功能的方法，該方法包括給需要處理的溫血動物服用治療上有效或修飾生物系統(tǒng)劑量的式(I)結合物。人們明白，應用的具體結合物取決于需治療疾病的情況或需修飾的生物系統(tǒng)。尤其是，熟悉本
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的專業(yè)人員能夠選擇具體的配位體和藥物，制備對所需治療的疾病或所需修飾的生物功能具有特異性的式(I)結合物。本發(fā)明又一較好的具體體現(xiàn)是提供冶療腫瘤疾病的方法，該方法包括給需要治療的溫血動物服用治療上有效劑量的細胞毒結合物式(I)。用于本目的的特別好的結合物是式(Ia)免疫結合物其中n、p、q、Z、X、R1、R3、R4、R5和R6的定義同前。上述后一具體體現(xiàn)的最好實例是下述式(Ia)免疫結合物，其中藥物部分是阿霉素，配位體部分系選自BR64、BR96、L6、嵌合的BR64、嵌合的BR96、嵌合的L6及其識別抗原的片段。該實例最好的配位體是嵌合BR96，尤其是寬松的嵌合BR96及其識別抗原的片段。本發(fā)明的結合物以藥用組合物的形式給患者服用，該藥用組合物包括式(I)結合物和藥學上適用的載體、賦形劑或稀釋劑。所用的“藥學上適用的”是指用于溫血動物治療或診斷的試劑，溫血動物包括例如人、馬、豬、牛、鼠、犬、貓或其他哺乳動物，以及鳥或其他溫血動物。較好的服用方式是非經(jīng)胃腸道給藥，特別是靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射或淋巴內(nèi)注射。所述組合物可以用本
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專業(yè)人員熟知的載體、稀釋劑或賦形劑進行制備。有關方面請參閱e.g.Remington’sPharmaceuticalSciences，16版，1980，Mack出版公司，由Osol編輯。該組合物可以包括蛋白質，如血清蛋白(如人血清白蛋白)、緩沖劑或緩沖物質如磷酸鹽、其他的鹽或電解質等。合適的稀釋劑可以包括例如無菌水、等滲鹽水、稀葡萄糖水溶液、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)或這些醇的混合液等。該組合物可以含有防腐劑如苯乙醇、羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯、乙基汞硫代水楊酸等。如果需要，組合物可以含有0.05～約0.20％(重量)的抗氧化劑，如焦亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉。對于靜脈注射給藥，最好使制得的組合物給患者注射的劑量為0.01～1克所需結合物。給患者注射的劑量為約0.2克～1克結合物較好。本發(fā)明的結合物在很大的劑量范圍內(nèi)是有效的，應用的劑量取決于如需治療的疾病狀況或需改變的生物作用、服用結合物的方式、患者的年齡、體重和體況，以及由治療醫(yī)生確定的其他因素。因此，給任何某一患者服用的劑量必須根據(jù)各個情況進行確定。熟悉本
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的專業(yè)人員明白。雖然在以下制備方法和實例中敘述了所用的具體試劑和反應條件，但是根據(jù)本發(fā)明精神和范圍可以進行改變。因此，本發(fā)明提供了以下的制備方法和實例，以便進一步詳細地敘述本發(fā)明。制備實例12，5-二氯-2，5-二氧-1H-吡咯并-1-己酰肼和它的三氟乙酸鹽(“馬來酰來氨基己?；ｋ隆?將馬來酰亞氨基己基(2.11克，10毫摩爾)[見e.g.，D.Rich等，J.Med.Chem.，18，1008(1975)；和O.Keller等，Helv.Chim.Acta，58，531(1975)]溶于無水四氫呋喃(200ml)中。溶液中氮氣流下攪拌，冷卻至4℃，并用N-甲基嗎啉(1.01克，10毫摩爾)處理，隨后滴加氯甲酸異丁酯(1.36克，10毫摩爾)的THF(10ml)溶液。5分鐘后，滴加肼基甲酸叔丁酯(1.32克，10毫摩爾)的THF(10ml)溶液。反應混合物于4℃保持1/2小時，于室溫保持1小時。蒸發(fā)溶劑，殘余物在乙酸乙酯和水之間進行分配。有機層依次用稀Hcl溶液、水和稀重碳酸鹽溶液洗滌，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，并蒸發(fā)溶劑。該物質經(jīng)快速層析純化，用二氯甲烷∶甲醇(100∶1-2)梯度溶劑系統(tǒng)進行洗脫。得到受保護的酰肼，產(chǎn)率70％(2.24克)。于0℃～4℃將上述物質(545毫克，2.4毫摩爾)溶于三氟乙酸中并攪拌8分鐘。于室溫在高真空下除去三氟乙酸。殘余物與乙醚一起研磨，得到馬來酰亞氨基己酰基酰肼三氟乙酸鹽結晶(384毫克，70％)。用甲醇-乙醚結晶制得分析樣品，得到產(chǎn)物，m.p.102℃～105℃。NMR和MS譜與結構一致。元素分析，C10H15N3O3·0.8CF3COOH計算值，C，44.02；H，4.99；N，13.28。實測值(雙份分析)，C，44.16，44.13；H，4.97，5.00；N，12.74，12.75。通過硅膠層析，用二氯甲烷∶甲醇∶濃氨水(100∶5∶0.5)溶劑系統(tǒng)洗脫，將上述鹽(220毫克)轉變成游離堿。得到的物質(124毫克，80％)用二氯甲烷-乙醚結晶，制得最后產(chǎn)物，m.p.92℃～93℃。NMR和MS譜與結構一致。元素分析，C10H15N3O3計算值，C，53.33；H，6.67；N，18.67。實測值，C，53.12；H，6.67；N，18.44。制備實例2阿霉素馬來酰亞氨基己?；陮⒚顾佧}酸鹽(44毫克，0.075毫摩爾)、馬來酰亞氨基己酰基酰肼[按制備實例1所述方法制備]和2～3滴三氟乙酸的無水甲醇(25ml)混合物在氮氣流和避光下攪拌15小時。在此期間的最后階段經(jīng)HPLC(流動相0.01摩爾乙酸鈉∶乙腈(70∶30))檢測無游離的阿霉素。于室溫和真空下將溶液濃縮至10ml，并且乙腈稀釋。將澄清的溶液濃縮至小體積，離心收集固體，產(chǎn)物在高真空下干燥，得標題化合物。NMR譜與結構一致。高分辨MS分析，C31H42N4O13計算值，751.2827，實測值，751.2804。也可用阿霉素和酰肼的三氟乙酸鹽制備上述腙。因此，將上述鹽(40毫克，0.12毫摩爾)[按制備實例1所述方法制備]和阿霉素鹽酸鹽(50毫克，0.086毫摩爾)于甲醇(30ml)中攪拌15小時。使溶液濃縮至2ml，并用乙腈稀釋。離心收集紅色固體，并真空干燥。該產(chǎn)物(28毫克，43％)的NMR和TLC譜與上述相同。高分辨MS分析，C31H42N4O13計算值，751.2827；實測值，751.2819。實例1ASPDP巰基化的單細胞系抗體BR64與阿霉素馬來酰亞氨基己?；甑慕Y合物BR64抗體溶液(25ml，10.37毫克/ml；經(jīng)紫外分析于280nm處確定，1.4吸光度相當于1毫克蛋白質)用SPDP的無水乙醇溶液(1.3ml10毫摩爾溶液)處理。溶液于31℃～32℃溫育1小時，然后用冰冷卻，用DTT的磷酸鹽緩沖鹽水(“PBS”)(1.3ml50毫摩爾溶液)處理。該溶液于冰中保持1小時，然后轉稱到透析管中，于至少8小時期間用PBS透析3次(每次透析用2ml)。透析后按上法測定蛋白質濃度，隨后通過Ellman法測定游離巰基的摩爾濃度。巰基化的蛋白質(3ml)用硫醇摩爾相當量的溶于二甲基甲酰胺(DMF)的阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙(按制備實例2制得)(5毫克/ml，0.131ml)處理，混合物于4℃溫育24小時。該溶液于至少8小時期間用PBS(1000ml)透析3次。將溶液離心，上清液與Bio-beadsTMSM-2(非極性中性大孔聚苯乙烯聚合物小球，Bio-Radlaboratories，RichmondCA94804)一起振蕩幾小時，最后經(jīng)Millex-GV(Millipore公司，Bedford，MA01730)0.22微米濾器過濾。于495nm處(ε＝8030cm-1M-1)的吸光度測定阿霉素的量，于280nm處的吸光度測定蛋白質的量，在280nm處校正阿霉素的吸光度之后按下式測定每分抗體的阿霉素分子的總平均數(shù)(“MR”)。產(chǎn)物的MR值為5.38；游離阿霉素占0.14％；蛋白質產(chǎn)率為60％。實例1BSPDP巰基化的BR64與阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙的結合物將BR64抗體(405ml，11.29毫克/ml)溶液攪拌，并用SPDP的無水乙醇溶液(22.3ml10毫摩爾溶液)處理。該溶液于31℃～32℃溫育1小時，同時緩慢地振蕩，然后在冰中冷卻至4℃，攪拌，并且DTT的PBS溶液(22.3ml50毫摩爾溶液)處理。溶液冰中保持1小時，然后分成2個等份，各份轉入透析管中，于至少8小時期間用PBS(6L/每次透析)透析6次，隨后將兩管中的物質合并(400ml)，測定蛋白質濃度和游離的巰基(-SH/蛋白質的摩爾比為8.5)。將巰基化的蛋白質溶液攪拌，并用硫醇摩爾相當量的溶于DMF的阿霉素馬來酰亞氨基己?；?5毫克/ml，35.7ml)處理，混合物于4℃溫育24小時。該溶液分成2等份，轉入透析管中，于至少8小時期間用PBS(6L/每次透析)透析5次。將兩透析管中的物質合并，經(jīng)0.22微米乙酸纖維素濾器過濾，濾液與Bio-beadsTMSM-2(Bio-RadLaboratories，RichmondCA94804)一起振蕩24小時。溶液經(jīng)0.22微米乙酸纖維素濾器過濾。測定蛋白質和阿霉素的濃度(分別為6.26毫克/ml和162.4微克/ml)，得摩爾比(MR)為7.18。蛋白質產(chǎn)率為77％。未結合的阿霉素為0.07％。實例2SPDP巰基化的SN7與阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙的結合物按實例1A和1B所述的類似方法，將不與抗原(由BR64識別)結合的單細胞系抗體SN7用SPDP巰基化，并與阿霉素馬來酰亞氨基己?；攴磻?，得摩爾比(MR)為4的結合物。蛋白質產(chǎn)率為51％。未結合的阿霉素為0.36％。實例3SPDP巰基化的ChiBR96與阿霉素馬來酰亞氨基己?；甑慕Y合物嵌合的BR96抗體(ChiBR96)的溶液(27.5ml，12.51毫克/ml)用10mMSPDP的無水乙醇(1.7ml)溶液處理。溶液于31℃溫育35分鐘，在冰中冷卻，并于4℃用0.50mMDTT的PBS(1.7ml)溶液處理15分鐘。將此溶液轉入透析管中，于至少8小時期間用PBS-0.1M組氨酸緩沖液(4.5L/每次透析)透析4次。測定蛋白質的量和巰基的摩爾濃度(分別為9.29毫克/ml和2.06×10-4M)。該溶液(17ml)用摩爾相當量的阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙的DMF中的溶液(5毫克/ml，0.59ml)處理，反應混合物于4℃溫育24小時。反應混合物于至少8小時期間在同樣的緩沖液(4.5L/每次透析)中透析3次。將透析過的溶液離心，上清液與BiobeadsTMSM-2(Bio-RadLaboratories，RichmondCA94804)一起于4℃緩慢振蕩幾小時。該溶液經(jīng)離心，測定上清液(19ml)中蛋白質和阿霉素的濃度(分別為6.5毫克/ml和67.86毫克/ml)。藥物/蛋白質的摩爾比為2.9。蛋白質的產(chǎn)率為72％；未結合的阿霉素為1.2％。實例4改變的蛙皮素與阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙的結合物蛙皮素不合有可通過含有邁克爾加成接受體的連接物用于連接藥物的游離的活性巰基。因此，需制備在原來的蛙皮素的氨基末端含有另外的半胱氨酸殘基的改變的蛙皮素。此外，將原來的蛙皮素的殘基-3變成賴氨酸殘基。因此改變的蛙皮素標示為“Cys0-lys3-蛙皮素”。將Cys0-lys3-蛙皮素(11.3毫克)溶于1.1ml去離子水中，并用10μl1.5MTris-HCl(pH8.8)，調至pH7～7.5，然后在室溫下與0.45ml阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙(15毫克/ml去離子水)反應數(shù)小時。反應混合物在透析管內(nèi)用水透析過夜(分子量極限1000)。經(jīng)離心(12,000×g)除去沉淀，留下上清液。用乙酸鹽緩沖液(pH6.0)按1∶50稀釋，測定蛙皮素-阿霉素結合物的阿霉素(“ADM”)含量。阿霉素(“ADM”)的含量用下式計算[O.D.495/8030]×50＝ADM(M)其中試液的O.D.495＝0.116，因此阿霉素的含量為7.2×10-4M。該產(chǎn)物用裝有C18(BackmanInstruments，Ultrasphere5微米，4.6微米×25厘米)柱的HPLC儀進行色譜分析。緩沖液A10mMNH4OAcpH4.5；緩沖液B90％乙腈/10％緩沖液A。色譜柱用90％緩沖液A/10％緩沖液B平衡，色譜條件90％緩沖液A/10％緩沖液B～60％緩沖液A/60％緩沖液B2分鐘，梯度至50％緩沖液A/50％緩沖液B15分鐘。在上述條件下產(chǎn)物的保留時間為9.3分鐘。實例5亞氨基四氫噻吩巰基化的嵌合的BR96和阿霉素馬來酰亞氨基己?；甑慕Y合物將嵌合的BR96(15ml，9.05毫克/ml)用4L0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液(pH9.1)透析2次。然后抗體溶液與亞氨基四氫噻吩(0.75ml，20mM)于32℃加熱45分鐘。溶液再用4L碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液(pH9.1)透析，隨后用4L0.0095MPBS-0.1ML-組氨酸(pH7.4)透析。該溶液-SH/蛋白質的摩爾比為1.35。然后按上述方法將蛋白質再巰基化，得-SH/蛋白質的摩爾比為5.0的溶液。在攪拌下于4℃向巰基化的蛋白質溶液中加入阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙(3.2毫克/0.640mlDMF)結合物于4℃溫育16小時，然后將其用4L0.0095MPBS-0.1ML-組氨酸(pH7.4)進行透析。透析的結合物通過0.22微米乙酸纖維素膜濾入加有小量(＞5％v/v)BioBeadsTMSM-2(Bio-Radlaboratories，RichmondCA94804)的無菌管中。緩慢地振蕩24小時后，濾出小球，結合物在液氮中冷凍并于-80℃貯存。所得結合物的阿霉素分子/蛋白質分子的摩爾比為3.4，并由嵌合的BR96計算，結合物產(chǎn)率為24％。實例6阿霉素馬來酰亞氨基己?；昱cDTT還原的人體IgG(“寬松的人體IgG”)的結合物人體IgG(從Rockland，Gilbertsville，PA獲得)用0.0095MPBS稀釋至蛋白質濃度為10.98毫克/ml。在氮氣流下將該溶液于水浴中加熱至37℃。加入二硫蘇糖醇(16.8ml，10mM)的PBS溶液，并于37℃攪拌3小時。溶液等分在兩個Amicon(AmiconDivisionofW.R.Grace和Co.，Beverly，MA0.1915)8400型帶攪拌的超濾池中，每個超濾池裝配有AmiconYM30超濾膜(分子量極限30,000，直徑76毫米)，每個超濾池通過AmicoCDS10型濃縮/透析選擇器連接到AmiconRC800型小型儲存容器上。每個儲存容器含有700ml0.0095MPBS-0.1ML-組氨酸。將蛋白質溶液進行透析，直至濾液中游離硫醇的濃度為41微摩爾。保留液中-SH/蛋白質的摩爾比經(jīng)測定為8.13。將保留液從上述超濾池轉移到保持在氮氣流下的無菌容器中，在攪拌下加入阿霉素馬來酰亞氨基己?；耆芤?36.7ml，5毫克/ml水)。結合物于4℃溫育48小時，將其通過0.22微米乙酸纖維素膜過濾。Bio-RadEconocolumTM(2.5厘米×50厘米，Bio-Radlaboratories，RichmondCA94804)用100克BioBeadsTMSM-2(Bio-RadLaboratoriesRichmond，CA94804)在0.00095M-0.1ML-組氨酸緩沖液中的漿液填充。上述小球依次用甲醇、水和數(shù)倍體積的緩沖液洗滌。經(jīng)過濾的結合物以2ml/分的速度通過該柱滲濾。層析后結合物通過0.22微米乙酸纖維素膜過濾，并在液氮中冷凍，于-80℃貯存。獲得的結合物有阿霉素分子/蛋白質分子的平均摩爾比為7.45，由人體IgG計算，結合物產(chǎn)率為99％。實例7寬松的BR64與阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙的結合物BR64溶液(435ml；11.31毫克/ml，7.07×10-5M)DTT(947毫克)處理，并在緩慢攪拌下于42℃～43℃加熱2小時。溶液于冰中冷卻，轉入兩個透析管中，每個管用PBS(14L/每次透析)于4℃透析5次，需8小時。合并兩管的內(nèi)含物(400ml)，測定蛋白質和-SH含量(分別為10.54毫克/ml，6.58×10-5M；5.14×10-4M)。-SH/蛋白質的摩爾比為7.8。在緩慢攪拌下，向抗體溶液中加入阿霉素馬來酰亞氨基己?；甑腄MF溶液(5毫克/ml，32.6ml)，然后于4℃溫育24小時。溶液通過0.22微米乙酸纖維素濾器過濾，再轉入兩個透析管中，并按上述方法進行透析。透析后合并兩管的內(nèi)含物，過濾并與BioBeadsTMSM-2(Bio-Radlaboratories，RichmondCA94804)一起于4℃振蕩24小時。經(jīng)乙酸纖維素濾器濾出小球，得結合物溶液。測定蛋白質和阿霉素的濃度(分別為8.66毫克/ml，5.42×10-5M；168微克/ml，2.89×10-4M)。蛋白質的產(chǎn)率為97％。阿霉素/蛋白質的摩爾比為5.33；未結合的阿霉素為0.5％。實例8結合阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙與寬松抗體的通法1.將抗體(3克，10毫克/ml)在PBS緩沖液(注1)中的溶液(300ml)連續(xù)通入氮氣，浸沒在37℃水浴中并用磁力攪拌器緩慢攪拌。溶液用7摩爾相當量的DTT(注2，3)處理3小時。一開始就測定最大結合產(chǎn)物的-SH/蛋白質的摩爾比(“MR”)，每小時測定一次，其摩爾比應保持恒定在約15(注2，4)。2.溶液盡可能迅速地轉稱到保持在約4℃～約7℃的Amicon透析過濾池(AmiconDivsionofW.R.Grace和Co.，Bevely，MA01915)(注5)中。該系統(tǒng)用氬氣和氮氣加壓，用含有0.1M組氨酸的PBS緩沖液(預先冷卻至約4℃～約7℃)開始透析過濾。在開始透析過濾之后，流出液的最初溫度立即為16℃～18℃，在約90分鐘內(nèi)下降到8℃～9℃。檢測流出液的-SH/蛋白質的摩爾比，當摩爾比值＜1時完成透析過濾(注6)。3.將上述溶液轉回到裝有磁力攪拌器的圓底燒瓶中并置于冰中。向溶液中連續(xù)通入氮氣。記錄該溶液的體積。取出0.1ml試樣，用PBS緩沖液稀釋至1.0ml以便測定蛋白質的量，以毫克/ml表示(也可以蛋白質的摩爾相當量表示，以及-SH的體積摩爾濃度表示)(并可以-SH/蛋白質的MR表示)。制得阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙的蒸餾水溶液(5毫克/ml，6.3×10-3M)(注7，8)。按下式確定結合所需要的上述溶液的量(以ml表示)(注9)，將上述確定的量慢慢加到緩慢攪拌的蛋白質溶液中。該溶液于4℃保持30分鐘。4.于4℃用Bio-BeadsTMSM-2，20～50目(Bio-RadLaboratories，RichmondCA94804)填充柱子。紅色蛋白質溶液通過0.22微米乙酸纖維素濾器過濾，然后以2.5ml/分的速度通過上述柱子，收集紅色流出液。最后將PBS-0.1M組氨酸緩沖液倒入柱頂部，收集流出液直至流出液無色。記錄收集的紅色流出液的體積。取0.1ml等分試樣用PBS緩沖液稀釋至1ml，測定蛋白質和阿霉素的量。以495nm處的吸光度(ε＝8030cm-1M-1)測定結合的阿霉素的量，并以微摩爾/ml和微克/ml表示。按上述方法讀出280nm處的吸光度，并于相同波長處校正阿霉素的吸光度，根據(jù)以下通式測定蛋白質的量，以毫克/ml和微摩爾表示，其中A為指定波長處測定的吸光度。然后計算阿霉素/蛋白質的MR。5.取5ml結合物等分試樣按上述方法通過Econo-PacTM10SM-2柱(預先裝填的Bio-BeadsTMSM-2柱(Bio-RadLaboratories，RichmondCA94804)，10ml體積，用PBS-0.1M組氨酸緩沖液洗滌和平衡)。測定蛋白質和結合的阿霉素的量，并測定MR。該值應與大容積溶液的值是相同的(注11)。6.將結合物于液氮中冷凍，并于-80℃貯存。取等分試樣測定細胞毒性、結合和存在的游離阿霉素(注12)。通法的注釋1.抗體濃度通常為7～10毫克/ml(～6.25×10-5M)，該濃度是最合適的濃度。如濃度太高，溶液可用緩沖液稀釋。如果濃度小于10毫克/ml，那么可以按此應用。通過280nm處的紫外吸光度(1毫克/ml＝1.4吸光度單位)測定濃度。2.應用的DTT是從BoeringerMannheimBiochemicals，Indianapolis，Indiana46250獲得，m.p.42℃～43℃。如果出現(xiàn)質量問題，那么DTT應該重結晶(例如用乙醚-己烷重結晶)。通過m.p.、NMR和-SH含量確定其純度。根據(jù)Ellman方法(Anal.Biochem.94，75～81，1979)進行巰基滴定取0.1ml等分試樣用PBS稀釋至1ml，并用0.05ml試劑(50毫微摩爾二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)(“DTNB”)的100毫微摩爾Na2HPO4溶液；pH7.04)處理。1mlPBS空白按相同的方法用DTNB處理。5分鐘后，于412nm處測定試樣和空白的吸光度(A)，按下式測定-SH的摩爾濃度(“MCSH”)3.DTT可以固體或溶液的形式加入。最好應用新鮮制備的10毫摩爾在緩沖液中的溶液。為了使反應達到一定規(guī)模，通常應用13.13ml。4.按Ellman方法(見注2)測定SH的摩爾濃度并除以蛋白質的摩爾濃度，從而確定-SH/蛋白質的MR。在反應期間如果MR值小于14，以加入適當量另外的DTT。5.就3克/300ml的規(guī)模而言，需將該溶液分成2份，每份150ml，這樣需用兩個各350ml的Amico池。6.就反應規(guī)模而言，透析過濾通常進行2～4小時。持續(xù)時間將取決于各種因素，例如膜的使用期限、溶液攪拌速度和池內(nèi)壓力。7.腙不溶于PBS，并在短時間內(nèi)形成沉定。8.短時間應用超聲波粉碎器將有利于在蒸餾水中的溶解作用。所得的溶液是穩(wěn)定的。9.該量保證腙過量5％。所述的過程一般需要約15～20分鐘。10.制備Bio-BeadTM用于層析使其于甲醇中膨脹至少1小時，最好過夜，用蒸餾水洗滌，最后用PBS-0.1M組氨酸緩沖液平衡。應用3克蛋白質，需用100克小球裝填2.5厘米×30厘米的柱。11.由于所用的光譜法固有的誤差，1MR單位的變差是可接受的滿意結果。一般來講，MR變化小于0.5MR單位。12.結合物中游離阿霉素的值通常小于1％很多。實例9寬松的嵌合BR96與阿霉素馬來酰亞氨基己?；甑慕Y合物按前面所述方法制備的嵌合的BR96，用0.0095MPBS稀釋至蛋白質濃度為10.49毫克/ml。在氮氣流下將該溶液于水浴中加熱至37℃。加入二硫蘇糖醇(26.2ml，10mM)和PBS溶液，并于37℃攪拌3小時。溶液等分到兩個Amicon8400型帶攪拌的超濾池中，每個超濾池裝配有YM30超濾器(分子量極限30,000，直徑76毫米)，每個超濾池通過CDS10型濃縮/透析選擇器連接到RC800型小型儲存容器上(Amicon，DivisionofW.R.GraceandCo.，BeverlyMA01915～9843)。每個儲存容器含有800ml0.0095MPBS-0.1ML-組氨酸。將蛋白質溶液進行透析直至溶液中游離硫醇的濃度為63微摩爾。保留液中-SH/蛋白質的摩爾比經(jīng)測定為8.16。保留液從上述池轉移到保持在氮氣流下的無菌容器中，在攪拌下加入阿霉素馬來酰亞氨基己?；耆芤?42.6ml，5毫克/ml水)。結合物于4℃溫育48小時，隨后將其通過0.22微米乙酸纖維素膜過濾。2.5厘米×50厘米Bio-RadEconocolumn用100克BioBeadsTMSM-2(Bio-Radlaboratories，RichmondCalifornia94804)在0.00095M-0.1ML-組氨酸緩沖液中的漿液填充。小球依次用甲醇、水和數(shù)倍體積的緩沖液洗滌。經(jīng)過濾的結合物以2ml/分的速度通過該柱滲濾。層析以后，結合物通過0.22微米乙酸纖維素膜過濾，并在液氮中冷凍，于-80℃貯存。獲得的結合物阿霉素/蛋白質的摩爾比為6.77，由嵌合的BR96計算，結合物產(chǎn)率為95％。實例10寬松的鼠抗體L6與阿霉素馬來酰亞氨基己?；甑慕Y合物按前述方法制備的鼠抗體L6用0.0095MPBS稀釋至蛋白質濃度為11.87毫克/ml。在氮氣流下該溶液(350ml)于水浴中加熱至37℃。加入二硫蘇糖醇(18.2ml，10mM)的PBS溶液，并于37℃攪拌3小時。溶液等分到兩個Amico8400型帶攪拌的超濾池中，每個超濾池裝配有YM30超濾器(切割分子量30,000，直徑76毫米)，每個超濾池通過CDS10型濃縮/透析選擇器連接到RC800型小型儲存容器上(Amicon，DivisionofW.R.GraceandCo.，BeverlyMA01915～9843)。每個儲存容器含有800ml0.0095MPBS-0.1ML-組氨酸。將蛋白質溶液進行透析，直到溶液中游離硫醇的濃度為14微摩爾。保留液中-SH/蛋白質的摩爾比經(jīng)測定為9.8。將保留液從上述池轉移到保持在氮氣流下的無菌容器中，在攪拌下加入阿霉素馬來酰亞氨基己酰基腙溶液(40.4ml，5毫克/ml水)。結合物于4℃溫育48小時，隨后將其通過0.22微米乙酸纖維素膜過濾。2.5厘米×50厘米Bio-RadEconocolumn用100克BioBeadsTMSM-2(Bio-RadLaboratories，RichmondCalifornia94804)在0.00095M-0.1ML-組氨酸緩沖液中的漿液填充。該小球依次用甲醇、水和數(shù)倍體積的緩沖液洗滌。經(jīng)過濾的結合物以2ml/分的速度通過該柱滲濾。層析以后結合物通過0.22微米乙酸纖維素膜過濾，并在液氮中冷凍，于-80℃貯存。獲得的結合物阿霉素/蛋白質的摩爾比為7.39，由鼠L6計算，結合物產(chǎn)率為100％。生物學活性對本發(fā)明有代表性的結合物進行體外和體內(nèi)系統(tǒng)試驗，以測定其生物活性。在這些試驗中，通過檢測所述結合物抗人的癌細胞的細胞毒性，測定具有細胞毒作用的藥物結合物的效力。下面闡述所用的有代表性的試驗和所得到的結果。在所給出的全部數(shù)據(jù)中，結合物用配位體和藥物之間的配位體-藥物-摩爾比形式表示。這樣，例如“BR64-ADM-5.33”指的是抗體BR64和阿霉素的結合物，并且藥物與抗體的摩爾比為5.33。熟悉本
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的專業(yè)人員將認識到，任何可表達所要求抗原的瘤株都可以用來替代下述各項試驗中所用的特定瘤株。試驗IBR64-阿霉素結合物的體外活性試驗了實例1B和2的免疫結合物在體外抗人肺癌細胞系L2987的活性，該細胞株[從I.Hellstrom，Bristol-MyersSquibbSeattle公司獲得，還可參見I.Hellstrom等，CancerResearch502183(1990)]表達由單克隆抗體BR64，L6和BR96識別的抗原。用胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，GrandIsland，NY)收獲L2987細胞的單層培養(yǎng)物，細胞經(jīng)計數(shù)后重新懸浮于含10％熱滅活小牛血清的RPMI-1640(簡稱為“RPMI-10％FCS”)中，使細胞量為1×105/ml。將細胞懸液加到96孔平底微量滴定板中，每孔0.1ml，并在37℃和5％CO2及一定濕度環(huán)境條件下溫育過夜。移除滴定板中的培養(yǎng)液，將阿霉素或其抗體結合物的系列稀釋液加到各孔中。所有的稀釋液都作4次測定。加入藥物或結合物后2小時，將滴定板進行離心(100×g，5分鐘)，除去藥物或結合物，用RPMI-10％FCS洗滌板3次，細胞在RPMI-10％FCS中再培養(yǎng)48小時。此時用1.0μci/孔的[3H]標記胸苷(NewEnglandNuclear公司，Boston，MA)攻擊細胞2小時。采集滴定板中細胞，測定每分鐘計數(shù)值(“CPM”)。通過比較處理樣品和未處理的對照樣品的平均CPM值，測定細胞增殖的抑制作用。圖3所列數(shù)據(jù)表明，與未結合的SN7和阿霉素的免疫配合物相比(阿霉素與SN7的摩爾比等于4，以“SN7-THADMHZN-4”表示)，結合的免疫結合物(阿霉素與BR64的摩爾比等于7.18，以“BR64-THADMHZN-7.18”表示)具有抗L2987肺細胞的細胞毒性。按實例1B所述方法制備的BR64結合物是有活性的，并證明在該體外篩選試驗中具有抗原特異的細胞毒性。試驗IIBR64-阿霉素結合物的體內(nèi)活性進行體內(nèi)試驗，評價實例1B和2的免疫結合物的抗原特異抗腫瘤活性。在這些試驗中采用有BALB/C遺傳背景的先天無胸腺的雌性小鼠(BALB/Cnu/nu；HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)。將小鼠放進能控制溫度和濕度的、置于無菌床上的Thoren鼠籠中飼養(yǎng)。給動物隨意喂無菌飼料和飲水。如上所述，在這些研究中用的是L2987人肺腫瘤細胞株。業(yè)已證明，在反復的體內(nèi)繼代移植后，該細胞株能維持表達BR64、BR96和L6抗原。按前述方法[P.A.Trail等人，invivo3319～24(1989)]通過在無胸腺小鼠上作系列繼代移植，保持該腫瘤細胞株。一周1次或二周1次用卡尺量取腫瘤的兩條垂直方向的長度。按下式計算腫瘤的體積式中V＝體積(毫米3)L＝最長軸的測量值(毫米)W＝與L軸垂直的軸的測量值(毫米)治療組和對照組的數(shù)據(jù)以平均腫瘤大小表示。每一治療組或對照組有8～10只小鼠。當腫瘤平均大小達50～100毫米3時開始治療。正如用符號表示的那樣，以不同的療程，經(jīng)腹腔注射(ip)或靜脈注射(iv)途徑給藥進行治療。供給藥用的阿霉素用生理鹽水稀釋，自然抗體和阿霉素配合物則用磷酸鹽緩沖鹽水(“PBS”)稀釋。所有劑量均以體重為基礎(毫克/公斤)給與，并計算出每只小鼠的給藥量。在這些研究中，將結合的BR64免疫結合物的抗腫瘤活性與最適劑量的阿霉素、自然BR64與阿霉素的混合物以及未結合的配合物的抗腫瘤活性進行比較。未結合的阿霉素按照經(jīng)證明對L2987人異體移植模型是最適的途徑、劑量和療程條件給藥。iv途徑，每4天注射1天，共注射3次(用“8毫克/公斤，q4d×3，iv”表示)。結合的(BR64)和未結合的(SN7)免疫配合物則在幾個劑量水平上，以ip途徑給與，每4天注射1次，共注射3次(用“q4d×3，ip”表示)。如圖4所示。注射可耐受的BR64-阿霉素結合物(10和15毫克/公斤/每次注射)后，可觀察到明顯的抗腫瘤活性。用BR64結合物治療后所觀察到的抗腫瘤活性明顯好于用最適劑量的阿霉素和對等劑量的未結合(SN7)的配合物治療后所觀察到的抗腫瘤活性。在本實驗中，用BR64結合物治療(15毫克/公斤每次注射)后可觀察到66％動物的腫瘤完全消退，用劑量為10毫克/公斤/每次注射的BR64結合物治療后觀察到50％動物的腫瘤完全消退。用最適劑量的阿霉素、自然BR64與阿霉素的混合物以及相當劑量的未結合的配合物治療后尚未觀察到確認的L2987腫瘤的部分消退或完全消退。為了證明所觀察到的抗腫瘤活性需要抗體與阿霉素的共價結合，用自然BR64和阿霉素的混合物做了幾個對照試驗。圖5A-C表示若干類型復合治療方案的有代表性的數(shù)據(jù)。用單克隆抗體和阿霉素組成的幾種復合治療方案所觀察到的抗腫瘤活性和單用最適劑量阿霉素治療所觀察到的抗腫瘤活性，并無顯著差別。所有這些數(shù)據(jù)表明，為了得到圖4所示的抗腫瘤活性，BR64和阿霉素的共價結合是必需的。實驗III蛙皮素結合物的體內(nèi)活性評價實例4結合物在體內(nèi)的抗腫瘤活性。用套針對H345人小細胞肺癌瘤小片(由UniversityofColoradomedicalSchool公司的D.Chan博士提供)植入BALB/C無胸腺裸小鼠的皮下。待腫瘤長至50～100毫米3大小時開始治療。移植腫瘤后23、26、28和30天給小鼠靜注下列藥物進行治療單用阿霉素(1.6毫克/公斤)，或蛙皮素-阿霉素結合物(“BN-ADM(TH)”，劑量相當于1.6毫克/公斤阿霉素)，或P77-阿霉素結合物(“P77-ADM(TH)”，劑量相當于1.6毫克/公斤阿霉素)。P77是帶有內(nèi)半胱氨酸殘基的12個氨基酸組成的肽(其氨基酸序列為KKLTCVQTRLKI)，按實例4所示方法，該肽不與H345細胞結合，但可與阿霉素的馬來酰亞氨基己酰基腙結合。因此，“P77-ADM(TH)”結合物代表一種不能與H345細胞結合的結合物。用卡尺量取腫瘤大小，并按下式計算腫瘤體積式中V、L和W的定義同試驗II。測定了腫瘤的平均體積，觀察到的結果見圖6。試驗IV寬松的ChiBR96抗體結合物的體外細胞毒性數(shù)據(jù)按實例8所述，采用制備寬松抗體的一般方法，制備阿霉素與ChiBR96抗體的免疫結合物。按下面的試驗方案，測定結合物的體外細胞毒性，并與游離的阿霉素和按實例1B所述方法制備的SPDP巰基化的免疫結合物的細胞毒性進行比較。這些試驗的結果見圖7所示。L2987人肺細胞的單層培養(yǎng)物置于含10％熱滅活的小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(RPMI-10％FCS)中保養(yǎng)。用胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，GrandIsland，NY)收獲細胞，計數(shù)細胞后重新懸浮于RPMI-10％FCS中，使細胞數(shù)達1×105/ml。將細胞懸液加到96孔微量滴定板中，每孔0.1ml，并在37℃約5％CO2的有一定濕度的環(huán)境條件下溫育過夜。除去滴定板中的培養(yǎng)液，將阿霉素或抗體/ADM結合物的系列稀釋液加到各孔中。所有的稀釋液都作4次測定。加入藥物或結合物(接觸細胞)后2小時，將滴定板進行離心(200×g，5分鐘)，除去藥物或結合物，用RPMI-10％FCS洗滌板3次。細胞在RPMI-10％FCS培養(yǎng)液中再另外培養(yǎng)48小時。此時用10μci/孔的氚標記胸苷(NewEnglandNuclear，Boston，MA)攻擊細胞2小時。采集滴定板中細胞，測量每分鐘細胞計數(shù)值(“CPM”)。通過比較處理樣品與未處理樣品的平均CPM值，測定細胞增殖的抑制。按相當于阿霉素的微摩爾數(shù)，報告半數(shù)細胞的抑制值IC50。試驗VBR64和鼠L6結合物的體內(nèi)抗腫瘤活性評價阿霉素和寬松的BR64或寬松的L6的免疫結合物在體內(nèi)的抗腫瘤活性。所觀察到的數(shù)據(jù)見圖8所示。本試驗采用有BALB/C遺傳背景的先天性無胸腺雌性小鼠(BALB/Cnu/nu；HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)。將小鼠放進能控制溫度和濕度的、置于無菌床上的Thoren鼠籠中飼養(yǎng)。給小鼠隨意喂無菌飼料和飲水。按腫瘤異體移植模型，在無胸腺小鼠中建立L2987人肺瘤細胞株。通過在體內(nèi)作系列繼代移植，保持該腫瘤株。每周1次或二周1次，用卡尺在二個垂直的方向上測量腫瘤。按下面的公式計算腫瘤體積式中V＝體積(毫米3)L＝最長軸的測量值(毫米)W＝與L軸垂直的軸測量值(毫米)每個對照或治療組的小鼠數(shù)通常為8～10只。數(shù)據(jù)以對照或治療組的平均腫瘤大小表示?？鼓[癌活性以術語總的對數(shù)細胞殺死值(“LCK”)表示，這里LCK=T-C3.3&times;TVDT]]>式中T-C定義為被治療的腫瘤達到目標大小所需要的平均時間(天)減去對照腫瘤達到目標大小所需要的平均時間(天)；TVDT為對照腫瘤體積達2倍大小(250～500毫米3)所需要的時間(天)。腫瘤部分消退(“PR”)是指腫瘤體積減少到初始腫瘤體積的50％或50％以下。腫瘤的完全消除(“CR”)是指在一定時間內(nèi)未觸及到腫瘤；治愈定義是確認的腫瘤在≥10TVDT的周期內(nèi)未能觸及到。對植入L2987人肺腫瘤的動物，通常在腫瘤體積平均大小達75毫米3時(腫瘤移植后12-14天)開始進行治療。平均TVDT為4.8±0.9天，在瘤體大小為500毫米3時評價抗腫瘤活性。在幾個試驗(在下面試驗VI中敘述)中，當L2987腫瘤長至225毫米3大小時開始治療。研究中的藥物或結合物經(jīng)ip或iv途徑給與。阿霉素用生理鹽水稀釋，抗體和抗體/阿霉素結合物則用磷酸鹽緩沖鹽水稀釋。以每只動物計算的毫克/公斤為基礎給與化合物，劑量以相當于一次注射的阿霉素毫克/公斤表示。免疫結合物按q4d×3療程投與。對一個治療方案的最大耐受劑量(“MTD”)定義為，按已定療程給藥，引起死亡率≤20％的最高劑量。在圖8所示的數(shù)據(jù)中，注射最適劑量的阿霉素產(chǎn)生相當于1.1LCK的抗腫瘤活性，腫瘤未見消退。在所試的所有各劑量下，BR64-ADM結合物產(chǎn)生相當于＞10LCK的抗腫瘤活性，在BR64-ADM劑量分別為5毫克/公斤、8毫克/公斤和10毫克/公斤時，觀察到治愈率分別為89％、78％和100％。在8毫克/公斤或10毫克/公斤的劑量下，L6-ADM結合物產(chǎn)生的抗腫瘤活性(分別為1.8和3.5LCK)明顯優(yōu)于最適劑量的阿霉素所產(chǎn)生的抗腫瘤活性，但小于相當劑量的內(nèi)化BR64-ADM結合物。因此，該數(shù)據(jù)表明，可結合的未內(nèi)化的L6-ADM結合物的抗腫瘤活性優(yōu)于未結合的阿霉素的抗腫瘤活性。用L6-阿霉素結合物治療產(chǎn)生的抗腫瘤活性低于用相當劑量內(nèi)化的BR64-阿霉素結合物治療所觀察到的抗腫瘤活性。試驗VIChiBR96-ADM結合物的體內(nèi)抗腫瘤活性對ChiBR96-ADM結合物抗確定的人肺腫瘤(“L2987”)、乳房腫瘤[“MCF7”，從美國標準菌種保藏所得到，登記號為ATTCCHTB22，也可參見I.Hellstrom等，CancerResearch502183(1990)]和結腸腫瘤[“RCA，從M.Brattain，BaylorUniversity得到，也可參見I.Hellstrom等，CancerResearch502183(1990)”]的抗腫瘤活性進行評價。飼養(yǎng)動物并建立MCF7、RCA和試驗V所述的L2987人腫瘤株的異體移植模型。各物質的給藥途徑和劑量同試驗V所述。對帶有L2987人肺腫瘤的動物一般是從平均瘤體大小為75毫米3(腫瘤移植后12-14天)時開始治療。平均TVDT為4.8±0.9天，在瘤體大小為500毫米3時評價抗腫瘤活性。在幾個試驗中，治療從L2987腫瘤達225毫米3大小時開始。MCF7腫瘤是一種與雌激素有關的人乳房瘤株。在MCF7腫瘤移植的當天，給無胸腺小鼠植入0.65毫克(釋放速率為65天)雌二醇丸劑(InnovativeResearchofAmerica，Toledo，Ohio)。當平均腫瘤大小為100毫米3(一般在腫瘤移植后13天)時開始治療。MCD7腫瘤的平均TVDT為6.4±2.0天，在腫瘤大小為500毫米3時評價抗腫瘤活性。對帶有RCA結腸腫瘤的動物是從腫瘤移植后15天平均腫瘤大小達75毫米3時開始治療。RCA腫瘤異體移植的平均TVDT為9.5±1.5天，在腫瘤大小達400毫米3時評價抗腫瘤活性。在L2987、MCF7和RCA異體移值模型上最適劑量的阿霉素抗腫瘤活性的數(shù)據(jù)總結在下面諸表和參考圖中。比較了ChiBR96-ADM結合物、最適劑量的阿霉素和相當劑量的未結合(IgG)配合物的抗腫瘤活性。在每個異體移植模型上，注射可耐受劑量的ChiBR96-ADM結合物后，均可觀察到已確定的腫瘤完全消退和/或治愈。圖9和圖10列示了ChiBR96-ADM結合物具有抗原特異的抗腫瘤活性的具有代表性的數(shù)據(jù)。如圖9所示，腹腔注射相當于10毫克/公斤阿霉素劑量的ChiBR96-ADM結合物，能產(chǎn)生相當于＞10LCK的抗腫瘤活性。在該ChiBR96-ADM結合物劑量下，78％小鼠的腫瘤可治愈，另外的11％小鼠的腫瘤完全消退。腹腔注射5毫克/公斤的ChiBR96-ADM結合物也可產(chǎn)生相當于＞10LCK的抗腫瘤活性，其腫瘤治愈率和腫瘤完全消退率分別為88％和12％。腹腔注射ChiBR96-ADM結合物后所觀察到的抗腫瘤活性(＞10LCK)顯著好于注射最適量的阿霉素所觀察到的(1.0LCK)。而且，ChiBR64-阿霉素結合物的抗腫瘤作用也比最適劑量的阿霉素強，即在相當于阿霉素5毫克/公斤劑量下，受試的ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤活性相當于靜脈注射8毫克/公斤阿霉素的抗腫瘤活性。未結合的人IgG配合物(MR＝7.16)在相當于阿霉素10毫克/公斤的劑量下進行試驗時，無抗L2987異體移植活性，這表明ChiBR96-ADM結合物優(yōu)良的抗腫瘤活性是由于該免疫結合物與L2987腫瘤細胞的抗原特異的結合。圖10表示類似的數(shù)據(jù)。如圖10所示，在相當于阿霉素10毫克/公斤的劑量下，受試的ChiBR96-ADM結合物(MR＝5.8)能產(chǎn)生相當于＞10LCK的抗腫瘤活性。在該劑量下觀察到的腫瘤治愈率和完全消退率分別為90％和10％。腹腔注射5毫克/公斤的ChiBR96-ADM結合物能產(chǎn)生4.8LCK的抗腫瘤活性，腫瘤的治愈率、完全消退率和部分消退率分別為10％、50％和10％。ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤活性大大超過最適劑量的阿霉素(1.6LCK)，而且如上所述，ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤作用也比未結合的阿霉素強。未結合的IgG-ADM配合物(MR＝7.16)在10毫克/公斤劑量下，是無活性的。用“寬松”抗體技術制備的各種ChiBR96-ADM結合物制劑對已確定的L2987人肺腫瘤異體移植的抗腫瘤活性評價結果列于表II。表IIChiBR96-ADM結合物對已確定的L2987人肺腫瘤異體移植的抗腫瘤活性**所有治療均按q4d×3給藥如表II所示，ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤活性優(yōu)于最適劑量的阿霉素，ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤效力比未結合的阿霉素強6～8倍。ChiBR96-ADM結合物對已確定的L2987大型腫瘤(225毫米3)的抗腫瘤活性也進行了評價(圖11)。腹腔注射相當于阿霉素10毫克/公斤劑量的ChiBR96-ADM結合物(MR＝6.86)產(chǎn)生相當于＞10LCK的抗腫瘤活性，觀察到的腫瘤治愈率和部分消退率分別為70％和30％。采用已確定的(50～100毫米3)L2987人肺腫瘤異體移植模型，評價未結合的ChiBR96抗體的抗腫瘤活性。如表III所示，ChiBR96抗體以100、200或400毫克/公斤劑量作靜注，對已確定的L2987腫瘤是無效的。ChiBR96和阿霉素混合物的抗腫瘤活性與單用阿霉素無差別。所以，ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤活性反映了結合物本身的效力而不是抗體和阿霉素協(xié)同的抗腫瘤作用。表III阿霉素、ChiBR96以及ChiB96和阿霉素的混合物對已確定的異體移植人肺腫瘤的抗腫瘤活性</tables>a按q4d×3靜脈給藥治療總之，在評價ChiBR96-ADM結合物對已確定的L2987人肺腫瘤的活性時，證明它具有抗原特異的抗腫瘤活性。ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤活性優(yōu)于最適劑量的阿霉素、ChiBR96和阿霉素混合物以及相當劑量的未結合的配合物。ChiBR96-ADM結合物的抗腫瘤效力比未結合的阿霉素約強6倍。在用≥2.5毫克/公斤劑量的ChiBR96-ADM結合物治療的動物中，有50％動物可觀察到已確定的腫瘤的治愈率或完全消退。如圖12所示，ChiBR96-ADM結合物(MR＝7.88)被證實對抗原特異的已確定的(75～125毫米3)MCF7腫瘤具有活性。ChiBR96-ADM結合物以5毫克/公斤劑量腹腔注射或靜注給藥，具有的抗腫瘤活性(4.2LCK)均優(yōu)于最適劑量的阿霉素(1.4LCK)或劑量相當?shù)奈唇Y合的IgG合物(1.2LCK)ChiBR96-ADM和未結合的IgG-ADM配合物的抗腫瘤活性總結于表IV中。象游離阿霉素的MTD值一樣，由于腫瘤生長所需要的雌二醇的補給，在MCF7模型上ChiBR96-ADM結合物的MTD值較低。表IVChiBR96-ADM硫醚結合物對已確定的異體移植MCF7人乳房腫瘤的抗腫瘤活性評價</tables>a所有治療均按q4d×3給藥b在該免疫結合物劑量下，40％動物致死。在RCA人結腸癌模型上還評價了ChiBR96-ADM結合物的抗原特異的抗腫瘤作用和劑量效應。RCA腫瘤對未結合的阿霉素的敏感性比L2987和MCF7腫瘤小。此外，如前所述，RCA腫瘤的瘤體積倍增時間比L2987和MCF7腫瘤長，形成血管困難，RCA腫瘤中放射性標記的BR64抗體的定位作用低于L2987腫瘤。如圖13所示，腹腔注射10毫克/公斤劑量ChiBR96-ADM結合物(MR＝7.88)的抗腫瘤活性優(yōu)于阿霉素和劑量相當?shù)奈唇Y合的IgG配合物(MR＝7.16)。如表V所示，ChiBR96-ADM結合物在10毫克/公斤劑量下進行試驗，產(chǎn)生的抗腫瘤活性相當于＞3LCK。在ChiBR96-ADM結合物的該劑量下，可有89％腫瘤治愈率和11％腫瘤部分消退率。本試驗中，未結合的阿霉素顯示相當于0.4LCK的抗腫瘤活性。因此，在本試驗中，該ChiBR96-ADM結合物對已確定的腫瘤可產(chǎn)生89％治愈率，而未結合的阿霉素是無活性的。表VChiBR96-ADM硫醚結合物對已確定的異體移植RCA人結腸腫瘤的抗腫瘤活性評價</tables>a所有治療均按q4d×3給藥總之，在RCA人結腸腫瘤模型上，ChiBR96-ADM結合物被證明具有抗原特異的抗腫瘤活性。腹腔注射5～10毫克/公斤劑量的ChiBR96-ADM結合物后，可觀察到已確定的RCA腫瘤的治愈和完全消退。關于本發(fā)明的具體實例、材料和數(shù)據(jù)，業(yè)已作了闡述。因為熟悉本
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的專業(yè)人員明白，應用或制備本發(fā)明不同方面的另外方法是存在的。該另外的方法包括在由以下權利要求所述的本發(fā)明目的和精神之內(nèi)。權利要求1.一種生成硫醚結合物的方法，該方法包括在一種惰性氣氛下還原含有二硫(化)橋鍵的蛋白質配位體，回收還原的配位體產(chǎn)物，和使還原的蛋白質配位體與式(IIa)的化合物反應其中，D為藥物部分，n為1-10的整數(shù)，R為邁克爾加成接受體。2.按照權利要求1的方法，其中，藥物部分為蒽環(huán)抗菌素，R為馬來酰亞氨基部分，n為5。3.按照權利要求2的方法，其中，蒽環(huán)抗菌素為亞德里亞霉素。4.按照權利要求1的方法，其中，還原劑為二硫蘇糖醇。5.按照權利要求4的方法，其中，蛋白質配位體為免疫球蛋白或其抗原結合片段。6.按照權利要求5的方法，其中，免疫球蛋白系選自BR64、BR96、嵌合的BR96、嵌合的L6或其抗原結合的片段。7.按照權利要求1的方法，其中，二硫蘇糖醇與免疫球蛋白的摩爾比為約1∶1～約10∶1。8.按照權利要求7的方法，其中，二硫蘇糖醇與免疫球蛋白的摩爾比為約6∶1～約10∶1。9.按照權利要求1的方法，其中，還原步驟的pH為約6.0～8.0。10.按照權利要求9的方法，其中，還原步驟的pH為約7.0～7.5。11.按照權利要求1的方法，其中，還原的蛋白質配位體產(chǎn)物用透析過濾法純化。12.按照權利要求1的方法，其中，藥物部分為蒽環(huán)抗菌素，R為馬來酰亞氨基部分，n為5。13.按照權利要求12的方法，其中，蒽環(huán)抗菌素為阿霉素。全文摘要本發(fā)明提供了藥物/配位體化合物(式Ⅰ),其中D為藥物部分,n為整數(shù)1～10,p為整數(shù)1～6,Y為氧或NH文檔編號C07K14/705GK1180711SQ97117908公開日1998年5月6日申請日期1997年8月29日優(yōu)先權日1992年1月23日發(fā)明者D·韋爾納,P·A·特雷爾,H·D·金,S·J·霍夫斯泰德,R·S·格林菲爾德,G·R·布拉斯羅斯基申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司