專利名稱：應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷儀器領(lǐng)域，特別涉及ー種斑點(diǎn)閱讀儀中微孔板孔底圖像精確定位方法。
背景技術(shù)：
ELISP0T技術(shù)即酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測技術(shù)，它是ー種免疫學(xué)檢測技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技木)的長處，具備一系列的優(yōu)點(diǎn)靈敏度極高，能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況，能檢測活生生的免疫細(xì)胞的功能與狀態(tài)，而且操作簡單經(jīng)濟(jì)，可進(jìn)行高通量篩選等。它是當(dāng)今唯一能夠檢測到百萬分之ー陽性細(xì)胞率的檢測技術(shù)，靈敏度比普通ELISA技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)(細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色)和Tetramer技術(shù)至少高了 1_2個數(shù)量級。這些獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)使其成為抗原特異性T-細(xì)胞免疫學(xué)研究的主流技術(shù)。 ELISP0T檢測的最終數(shù)據(jù)是細(xì)胞頻率，即在細(xì)胞群體中，受某種特異性抗原刺激而分泌某種細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞比例。細(xì)胞總數(shù)在試驗開始已經(jīng)計數(shù)，需要統(tǒng)計的是陽性細(xì)胞(也稱斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目)。根據(jù)以前的技術(shù)研究，每ー個ELISP0T斑點(diǎn)對應(yīng)唯一一個陽性細(xì)胞，所以ELSPOT數(shù)據(jù)處理最重要的工作就是進(jìn)行斑點(diǎn)計數(shù)。事實上到目前為止，以目視法判讀少量細(xì)胞族群的特性如激活T細(xì)胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。ELISP0T結(jié)果的判讀常需要專聘的、有經(jīng)驗的技術(shù)員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計算斑點(diǎn)數(shù)仍不免會偶有主觀意見，而有所偏頗?？茖W(xué)實證的本質(zhì)，在于如何使實驗結(jié)果能盡可能客觀、精確、同時有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計算法顯然無法達(dá)到此要求。ELISP0T斑點(diǎn)閱讀儀在分析ELISP0T實驗數(shù)據(jù)的過程中，先拍攝微孔板中孔底載體上(如膜)呈色影像，而后儲存成各種數(shù)據(jù)格式的圖像文件，包括未處理與處理過的膜表面影像；這些影像可以進(jìn)一歩使用手動、或是自動方式計算斑點(diǎn)數(shù)目，如果采取自動分析功能，則利用儀器的內(nèi)嵌分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時分析斑點(diǎn)的大小，以推估激素分泌的多寡。ELISP0T斑點(diǎn)分析儀能自動進(jìn)行圖像掃描并分析，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費(fèi)人力、及人為客觀性等缺點(diǎn)，徹底解除ELISP0T分析技術(shù)的瓶頸問題，進(jìn)ー步推廣該技術(shù)的新穎應(yīng)用。但是，對微孔板的每個孔來說，所拍攝的圖像不僅包含了分析所需要的孔底信息，還包括了孔底之外的圖像。因此首先要做的是找到孔底圓，把圓之外的圖像部分減去，然后在裁剪之后的圖像上繼續(xù)進(jìn)行圖像分析。常見的思路是通過機(jī)電結(jié)構(gòu)，例如步進(jìn)電機(jī)、絲桿或者同步帶，精確控制每個孔運(yùn)動到固定位置，這樣拍攝的時候就可以認(rèn)為每個孔的位置是固定的，同是也認(rèn)為孔底圓的大小是不變的，從而以固定位置的、固定大小的圓去裁剪所拍攝的圖片。但實際上，由于機(jī)電結(jié)構(gòu)的精度、制造誤差以及微孔板本身的制造誤差、板條裝配較松等原因，以圖像中固定位置圓裁剪所拍攝圖片，所得結(jié)果和真實孔底位置有較大的偏差，偏差方向沒有規(guī)律。另外ー個問題是，由于制造公差等原因，每孔的孔底圓的大小實際上不一樣的，所以成像后對應(yīng)的圓的大小也是不一樣的，用固定大小的圓裁剪，會導(dǎo)致或者裁掉有用的孔底圖像，或者包含了多余的孔外干擾圖像?？傊?，用固定大小、固定位置的裁剪圓不能精確定位微孔板的孔底，導(dǎo)致裁剪到圖像不僅丟失了所需要的真實孔底信息，還包含進(jìn)了孔底之外的很多干擾信息，從而導(dǎo)致了后續(xù)圖像分析失去真實性基礎(chǔ)，分析結(jié)果沒有意義。對于傳統(tǒng)加工制造業(yè)中的圖像分析來說，由于光照控制容易、背景及目標(biāo)對比度可以非常強(qiáng)，エ況也相對固定，所以實現(xiàn)起來容易。但Elispot的微孔板圖像是生化反應(yīng)后的圖像，圖像的深淺不定、均勻性的規(guī)律也很差，是ー種類似自然場景的圖像，要進(jìn)行圖像分析是相對復(fù)雜的ー個問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種斑點(diǎn)閱讀儀中微孔板孔底圖像精確定位方法，能保證Elispot斑點(diǎn)閱讀儀進(jìn)行圖像分析時能對微孔板孔底進(jìn)行精確裁剪，克服了傳統(tǒng)技術(shù)中的不足，從而實現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題可以采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn) 應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的自動精確定位方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟I)拍攝原始微孔板的原始圖像；2)對原始圖像進(jìn)行灰度化處理，得到灰度圖像；3)對灰度圖像進(jìn)行ニ值化處理和邊緣檢測，獲取邊緣線條的ニ值圖像；4)對ニ值圖像進(jìn)行進(jìn)行孔底圓查找，得到所有目標(biāo)圓的半徑及圓心；5)按照得到的目標(biāo)圓的半徑及圓心對原始圖像進(jìn)行裁剪，即得到去掉無關(guān)信息的目標(biāo)圖像。在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟2)中灰度化的方法為采用以下公式把原始圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像Y=O. 299*R+0. 587*G+0. 114*B ；其中，Y為轉(zhuǎn)化后的灰度值，R、G、B分別為彩色圖像中同一像素點(diǎn)的紅色、緑色、藍(lán)色分量。在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟3 )采用邊緣檢測算子對ニ值圖像進(jìn)行邊緣檢測。進(jìn)一步,所述邊緣檢測算子包括Sobel算子、Priwitt算子、Robberts算子、LoG算子、Canny 算子和 Zero crossings 算子。在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟4)的具體方法如下a.設(shè)定圖像的大小為W*H，要查找的圓的半徑Rs，圓心的像素坐標(biāo)是[X，Y]；其中，W、H、R的單位都是像素；RS的范圍是在區(qū)間[R1, R2]里，單位是像素，R1和R2預(yù)先設(shè)定，保證區(qū)間包含R ；X是圓心的行坐標(biāo)，Y是圓心的列坐標(biāo)，像素坐標(biāo)系的圓心在圖像的左上角。b.以圖像的第一行第一列像素為圓心，然后計算步驟三的圖像里的每個邊緣點(diǎn)到圓心的距離，把像素距離值等于R1的邊緣點(diǎn)個數(shù)統(tǒng)計下來，記作N (1，1，R1)；c.以圖像的第一行第二列的像素為圓心，然后計算步驟三的圖像里的每個邊緣點(diǎn)到圓心的距離，把像素距離值等于R1的邊緣點(diǎn)個數(shù)統(tǒng)計下來，記作N (1，2，R1)；d.同理，計算圖像里每個位置的N，第！·行、第c列的像素對應(yīng)的值為N Cr7C7R1);e.同理，對于半徑R1+1，可 以計算所有的N (ntRi+l);f.同理，對與區(qū)間[R1, R2]里的所有半徑Ri,計算出所有的N (r，c，Ri)g.在N (r,c, Ri)中尋■找最大值,對應(yīng)的半徑和圓心就是要找的孔底圓的半徑R和圓心[X, Y] ο進(jìn)ー步，如果所述最大值有若干個，那么把對應(yīng)的半徑和圓心取出來根據(jù)以下原則處理a)如果圓心比較接近，取平均值作為最終的半徑和圓心；b)如果圓心差值很大，排除明顯不可能的圓心位置。本發(fā)明的有益效果在干結(jié)合Elispot斑點(diǎn)分析的圖像特點(diǎn)，基于邊緣檢測后圖像進(jìn)行微孔板孔底圓周搜索，解決了微孔板孔底圖像的精確裁剪問題。降低了對機(jī)電定位和微孔板制造精度的要求。本發(fā)明的方法可以用在Elispot斑點(diǎn)閱讀儀圖像分析中，也可用在類似基于微孔板圖像分析的目標(biāo)區(qū)域定位上。


圖I為本發(fā)明所述的自動精確定位方法的簡要流程圖。圖2為本發(fā)明所述的原始圖像。圖3為本發(fā)明所述的灰度圖像。圖4為本發(fā)明所述的ニ值圖像。圖5為本發(fā)明所述的定位圖像。圖6為本發(fā)明所述的目標(biāo)圖像。
具體實施例方式為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施方式
，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。如圖I所示,本發(fā)明所述的應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的自動精確定位方法，主要包括如下步驟I)獲取原始微孔板的灰度圖像參見圖2和圖3，所拍攝的圖像一般是彩色圖像，在進(jìn)行Elispot斑點(diǎn)分析的時候，并不需要這些顏色信息，主要是利用圖像中包含的亮度信息，所以這ー步就是把彩色圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像；對于直接用黑白攝像機(jī)獲取的灰度圖像，則不需要進(jìn)行這一歩。可采用以下公式把彩色圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像Y=O. 299*R+0. 587*G+0. 114*B ；其中，Y為轉(zhuǎn)化后的灰度值，R、G、B分別為彩色圖像中同一像素點(diǎn)的紅色、緑色、藍(lán)色分量。2 )對灰度圖像進(jìn)行邊緣檢測對灰度圖像進(jìn)行ニ值化處理和邊緣檢測，獲取邊緣線條的ニ值圖像。經(jīng)過這一歩處理后，微孔板孔底的圓周包含在邊緣圖像里。當(dāng)然邊緣圖像中還包括了很多無關(guān)的邊緣點(diǎn)，后續(xù)處理步驟將進(jìn)ー步尋找其中的圓周。邊緣檢測算子可以選擇Sobel算子、Priwitt算子、Robberts算子、LoG算子、Canny算子、Zero crossings算子的ー種。根據(jù)實際情況確定最佳效果的算子。參見圖4,在本實施例中，選用的是LoG算子。在對大量的微孔板微孔圖像研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)幾個特點(diǎn)a.圖像中不僅有孔底的圓周，而且孔內(nèi)壁反光形成很多模糊的同心圓；相比來說，孔底圓的對比度較大，邊緣細(xì)節(jié)豐富。b.很多小的斑點(diǎn)也有著類似圓的外觀；這些斑點(diǎn)雖然也細(xì)節(jié)豐富，但是其邊緣點(diǎn)的數(shù)目應(yīng)該遠(yuǎn)小于孔底圓的邊緣點(diǎn)數(shù)目，同時半徑懸殊較大?；谝陨蟽蓚€特點(diǎn)，采用邊緣檢測的方法做以處理，孔底圓可以形成較多的邊緣 點(diǎn)，并且對應(yīng)的半徑較大，這樣就利于將其從眾多的干擾圓中檢測出來。3)對ニ值圖像進(jìn)行孔底圓查找I.設(shè)定圖像的大小為W*H，要查找的圓的半徑Rs，圓心的像素坐標(biāo)是[X. Y]。其中W、H、R的單位都是像素；RS的范圍是在區(qū)間[R1, R2]里(單位是像素)，R1和R2可以預(yù)先設(shè)定，只要保證區(qū)間能包含R即可；X是圓心的行坐標(biāo)，Y是圓心的列坐標(biāo)，像素坐標(biāo)系的圓心在圖像的左上角。2.以圖像的第一行第一列像素為圓心，然后計算步驟三的圖像里的每個邊緣點(diǎn)到圓心的距離，把像素距離值(經(jīng)過圓整)等于R1的邊緣點(diǎn)個數(shù)統(tǒng)計下來，記作N (1，1，R1)；3.以圖像的第一行第二列的像素為圓心，然后計算步驟三的圖像里的每個邊緣點(diǎn)到圓心的距離，把像素距離值(經(jīng)過圓整)等于R1的邊緣點(diǎn)個數(shù)統(tǒng)計下來，記作N (1，2，札)；4.同理，可以計算圖像里每個位置的N，第！·行、第c列的像素對應(yīng)的值為N Cr,c, R1)；5.同理，對于半徑R1+1，可以計算所有的N (ntRi+l);6.同理，對與區(qū)間[R1, R2]里的所有半徑Ri,計算出所有的N (r, c, Ri)7.在N (r,c, Ri)中尋■找最大值,對應(yīng)的半徑和圓心就是要找的孔底圓的半徑R和圓心[X, Y] ο8.如果第7步同時有幾個最大值，那么把對應(yīng)的半徑和圓心取出來根據(jù)以下原則處理a)如果圓心比較接近，取平均值作為最終的半徑和圓心；b)如果圓心差值很大，用先驗條件(比如，圓心只可能在圖像中心的某個小區(qū)域里)排除明顯不可能的圓心位置；實際上這些先驗條件在計算N (r，c，Ri)時就可以加進(jìn)去，可以大大減少不必要的計算，其結(jié)果參見圖5。最后按照得到的圓半徑及圓心對原始圖像進(jìn)行裁剪，即得到去掉板孔外無關(guān)信息的圖像(圖6)，可用于后續(xù)分析。本發(fā)明的方法結(jié)合Elispot斑點(diǎn)分析的圖像特點(diǎn)，基于邊緣檢測后圖像進(jìn)行微孔板孔底圓周捜索，解決了微孔板孔底圖像的精確裁剪問題。降低了對機(jī)電定位和微孔板制造精度的要求。本發(fā)明的方法可以用在Elispot斑點(diǎn)閱讀儀圖像分析中，也可用在類似基于微孔板圖像分析的目標(biāo)區(qū)域定位上。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟 .1)拍攝原始微孔板的原始圖像； .2)對原始圖像進(jìn)行灰度化處理，得到灰度圖像； . 3)對灰度圖像進(jìn)行ニ值化處理和邊緣檢測，獲取邊緣線條的ニ值圖像； .4)對ニ值圖像進(jìn)行進(jìn)行孔底圓查找，得到所有目標(biāo)圓的半徑及圓心； .5)按照得到的目標(biāo)圓的半徑及圓心對原始圖像進(jìn)行裁剪，即得到去掉無關(guān)信息的目標(biāo)圖像。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法，其特征在于，所述步驟2)中灰度化的方法為采用以下公式把原始圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像Y=O. 299*R+0. 587*G+0. 114*B ； 其中，Y為轉(zhuǎn)化后的灰度值，R、G、B分別為彩色圖像中同一像素點(diǎn)的紅色、緑色、藍(lán)色分量。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法，其特征在于，所述步驟3)采用邊緣檢測算子對ニ值圖像進(jìn)行邊緣檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法，其特征在于，所述邊緣檢測算子包括Sobel算子、Priwitt算子、Robberts算子、LoG算子、Canny算子和Zero crossings算子。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法，其特征在于，所述步驟4)的具體方法如下 a.設(shè)定圖像的大小為W*H，要查找的圓的半徑Rs，圓心的像素坐標(biāo)是[X，Y]； 其中，W、H、R的単位都是像素；RS的范圍是在區(qū)間[R1, R2]里，單位是像素，R1和R2預(yù)先設(shè)定，保證區(qū)間包含R ；X是圓心的行坐標(biāo)，Y是圓心的列坐標(biāo)，像素坐標(biāo)系的圓心在圖像的左上角。
b.以圖像的第一行第一列像素為圓心，然后計算步驟三的圖像里的每個邊緣點(diǎn)到圓心的距離，把像素距離值等于R1的邊緣點(diǎn)個數(shù)統(tǒng)計下來，記作N (1，1，R1); c.以圖像的第一行第二列的像素為圓心，然后計算步驟三的圖像里的每個邊緣點(diǎn)到圓心的距離，把像素距離值等于R1的邊緣點(diǎn)個數(shù)統(tǒng)計下來，記作N (1，2，R1)； d.同理，計算圖像里每個位置的N，第！·行、第c列的像素對應(yīng)的值為NCr7C7R1); e.同理，對于半徑R1+1，可以計算所有的N(r, CjR1+!)； f.同理，對與區(qū)間[R1,R2]里的所有半徑Ri,計算出所有的N Cr7C7Ri) g.在N(r, c, Ri)中尋■找最大值,對應(yīng)的半徑和圓心就是要找的孔底圓的半徑R和圓心[X，Y]。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法，其特征在于，如果所述最大值有若干個，那么把對應(yīng)的半徑和圓心取出來根據(jù)以下原則處理 a)如果圓心比較接近，取平均值作為最終的半徑和圓心； b)如果圓心差值很大，排除明顯不可能的圓心位置。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用圖像識別對Elispot斑點(diǎn)分析的精確定位方法，主要包括如下步驟首先對原始微孔板單孔彩色圖像進(jìn)行灰度值轉(zhuǎn)化、再對灰度圖進(jìn)行邊緣檢測、然后對邊緣檢測圖進(jìn)行孔底圓查找、最后對原來的整幅圖進(jìn)行孔底裁剪。本發(fā)明的方法結(jié)合Elispot斑點(diǎn)分析儀的圖像特點(diǎn)，基于邊緣檢測后圖像進(jìn)行微孔板孔底圓周搜索，解決了微孔板孔底圖像的精確裁剪問題。降低了對機(jī)電定位和微孔板制造精度的要求。本發(fā)明的方法可以用在Elispot斑點(diǎn)閱讀儀圖像分析中，也可用在類似基于微孔板圖像分析的目標(biāo)區(qū)域定位。
文檔編號G06K9/32GK102693541SQ20121014702
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者吳雪瓊, 姚涌, 張香琴, 梁艷, 田涌濤, 許穎原 申請人:上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司, 中國人民解放軍第三O九醫(yī)院