專利名稱：miR-24用于治療或診斷心衰或患心衰傾向或者改善心肌細胞功能的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及MicroRNA領域。本發(fā)明還涉及心衰的診斷或治療，特別是心衰的早期診斷或治療。本發(fā)明還涉及用于篩選診斷或治療心衰的藥物的方法。
背景技術：
心力衰竭(簡稱“心衰”)是各種心血管疾病發(fā)展的最終階段，主要表現(xiàn)為心臟泵血能力下降、全身體血液循環(huán)不能維持正常運行而出現(xiàn)的系列綜合征。隨著經(jīng)濟社會發(fā)展和人口老齡化進程，心衰的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。我國50家主要醫(yī)院病例調查顯示， 心衰患者的住院數(shù)量占同期心血管疾病的20%，但死亡數(shù)量卻占40%。2005年美國心臟病學會和美國心臟病學院(ACC/AHA)公布的心衰治療指南指出心衰的早期防治將是戰(zhàn)勝心衰的關鍵。但如何在早期防治心衰還是個很新且尚未解決的醫(yī)學問題。以往針對心衰發(fā)生、發(fā)展分子病理機制的研究多集中在心衰發(fā)病的中晚期，即心臟組織結構明顯改變、心功能嚴重受損階段。近年來臨床研究提示，在心臟病變發(fā)生的早期 (即心功能受損尚不十分明顯的時期)進行診斷和干預，對于心血管疾病預后有著極其重要的影響。最近我們研究發(fā)現(xiàn)，在心衰發(fā)展的早期，當心臟泵血功能、心肌細胞收縮能力還沒有明顯異常的時候，細胞內分子水平的鈣信號耦聯(lián)已經(jīng)出現(xiàn)了顯著衰退。另一方面，傳統(tǒng)的心衰治療相關的研究策略集中在受體拮抗劑、炎癥因子抑制劑、蛋白激酶的拮抗劑等方面。而近年來許多研究者開始意識到心肌細胞結構蛋白的改變在心衰發(fā)展中至關重要，是心衰治療不容忽視的又一重要靶點。在細胞水平上，心肌興奮-收縮耦聯(lián)是鈣致鈣釋放的過程。具體而言，心肌細胞膜(包括橫管)分布著L-型鈣通道(LCC)，由LCC流入細胞的Ca2+觸發(fā)了雷尼丁受體 (ryanodine receptor,RyR)的開放，肌質網(wǎng)釋放更多Ca2+產(chǎn)生全細胞的鈣瞬變。多數(shù)研究認為，心肌肥厚及心衰過程中LCC活性基本不變，但在多數(shù)失代償性心肌肥厚(DHT)及心衰模型中，相同的LCC電流所觸發(fā)的鈣瞬變幅度降低、鈣釋放速度減緩，表明LCC電流觸發(fā)RyR 的效率降低。分子間耦聯(lián)衰退不會影響細胞興奮收縮耦聯(lián)能力，只有分子間耦聯(lián)衰退超出穩(wěn)定裕度，心衰才會發(fā)生。潛性的分子間耦聯(lián)衰退的發(fā)現(xiàn)對早期防治心衰有重要意義。Junctophi Iin蛋白家族是日本科學家hkeshima H等在2000年首次鑒定的，共有四種亞型，其中JP2在心肌和骨骼肌中特異性表達。近年來，對心肌細胞中JP2的研究主要集中在JP2與細胞興奮收縮耦聯(lián)的結構和功能上，尚處于起步階段。在JP2與心衰關系的研究中還有一個重要的尚未解決的科學問題即心衰過程中 JP2表達水平下調的分子調控機制是什么。這種分子機制的揭示可否為心衰的防治提供新的線索呢？目前國內外尚未見調控JP2表達的分子機制的報道。MicroRNA(miRNA)MicroRNAs (miRNA)是一類小的、非編碼蛋白的RNA (ncRNA)，它們大約為22個大小左右的核苷酸，在轉錄或轉錄后水平調控與其序列部分互補的靶mRNA的翻譯或表達。miRNA作為一類小分子，幾乎參與了人體一切生命活動的調節(jié)和所有疾病的發(fā)病過程。隨著對miRNA功能廣泛而深入的研究，miRNA在機體生理和病理過程中的重要作用，得到越來越多的認識。本文綜述近來發(fā)現(xiàn)的一個重要miRNA—miRNA-24(在本文中也稱為miR-M)的相關研究報道。在人類，miR-24-l和miR-M_2分別被位于九號染色體(9q2》和19號染色體 (19pl3)上的不同基因所編碼。miR-M-1和miR-M-2經(jīng)過Drosha和Dicer等內切酶加工為序列一致的成熟體miRNA。HIiR-M在進化過程中高度保守，不同種屬間同源性比較高，并且含量也是比較豐富的，特別在心臟和肺內高表達。根據(jù)目前已發(fā)表的研究結果，HIiR-M的作用如下1. miR-24促進骨骼肌細胞的分化。(Nucleic Acids Research. 2008. 36. 2690-2699.)2.在新生大鼠心肌細胞過表達miR-M，引起細胞肥大。 (PNAS. 2006. 103. 18255-18260.)3. miR-24 在缺血預適應中表達上調。(Circ. Re s. 2009 ； 104 ；572-575.)4. miR-M在二氫葉酸還原酶基因上作用位點的多態(tài)性與甲氨蝶呤耐藥的產(chǎn)生有關。(PNAS. 2007. 104. 13513-13518.)5. miR-24在定向造血干細胞終末分化過程中表達上調，使細胞停留在 Gl期與抑制DNA復制，從而抑制細胞的增殖，達到終止分化的效應。(Molecular Cell. 2009. 35. 610-625.)6.miR-M使其靶基因H2AX(其功能是修復斷裂的DNA雙鏈)的表達下調，這是不分裂細胞其修復斷裂DNA能力比較弱的原因之一。(NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY. 2009. 16. 492-498)7. miR-24與機體的抗病毒感染能力呈正相關。(BBA. 2008. 1779. 628-633)雖然已有文獻報道m(xù)iR-M在心衰時表達上調，但并未明確闡明其是否與JP2直接相關及可能調控機制。此外，由生物信息學分析獲得，JP2mRNA的3'非翻譯區(qū)(3‘ UTR)上可能存在miRNA的結合位點在心血管研究中尚未被提及。本課題首次提出心衰早期重要結構蛋白的變化受miRNA調控的假說具有重要的臨床意義；為心衰的早期檢測和防治提供線索和理論依據(jù)。從目前的研究結果看，關于miR-M功能在心血管方面的研究還處在比較淺顯的層面，病理情況下HliR-M上調的機理、作用靶點均未知曉。通過深入研究心血管系統(tǒng) HliR-M相關的病理機制，可能將有助于我們更加有效的診斷、預防或治療心血管疾病。

發(fā)明內容
本申請將我們的基于Jimctophi 1 in2 (也稱JP^的基因治療技術與現(xiàn)代腺病毒病毒載體靶向輸送技術結合起來，從心衰模型開始，研究JP2轉基因治療技術應用于治療心衰治療的可行性和關鍵技術方法。 我們最近的研究利用攜帶JP2基因的病毒感染心衰大鼠的心肌細胞，測定其細胞膜鈣通道與肌質網(wǎng)鈣釋放通道的分子耦聯(lián)效率，發(fā)現(xiàn)提高JP2的表達可以顯著改善心衰細胞分子鈣信號耦聯(lián)的效率；而當我們采用RNA干擾技術敲減正常大鼠心肌細胞JP2的水平時，細胞收縮功能明顯受到抑制。因此JP2的表達減少，必然導致細胞膜鈣通道與肌質網(wǎng)鈣釋放通道“脫耦聯(lián)”，從而導致心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)效率低下并最終發(fā)展為心衰。這些都提示JP2表達水平的下調可能導致心衰的發(fā)生。我們的研究還發(fā)現(xiàn)肌細胞特異性表達的結構蛋白Jimctophilin2(JP2)的水平與心衰的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系，并且在心衰的早期即有顯著的變化。本發(fā)明一方面涉及在心肌細胞中改變JP2蛋白表達的方法，其中所述改變包括上調或者下調，并且所改變的表達例如是至少提高10% JO^JO^i、優(yōu)選地是45%。所述方法包括步驟給心肌細胞(例如離體的、體內的)施用miR-M的抑制劑或者miR-M或其激動劑，或者將心肌細胞和miR-M的抑制劑或者miR-M或其激動劑接觸。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及在心肌細胞中上調(或者提高)JP2蛋白表達的方法，所述方法包括步驟給心肌細胞(例如離體的、體內的)施用HliR-M的抑制劑，或者將心肌細胞和HliR-M的抑制劑接觸。優(yōu)選，所述在心肌細胞中上調(或者提高)JP2蛋白表達的方法在有利于心肌細胞中JP2蛋白表達上調的時間和條件下進行。優(yōu)選，本發(fā)明方法還可以包括檢測JP2蛋白的表達。在本文中，所述心肌細胞可以是例如哺乳動物，例如大鼠或者人的心肌細胞。本文所述的心肌細胞可以是例如離體的、或者體內的(動物或人體內的)。在一個優(yōu)選實施方案中，本文所述的心肌細胞可以是心衰心肌細胞。在本文中，所述的miR-M的抑制劑可以是能夠抑制miR-M對靶基因(JP2基因) 的調控作用的任何物質。HiiR-M對靶基因(JP2基因)的調控作用包括抑制靶基因的表達， 例如miR-M對靶mRNA的降解或者抑制其翻譯。因此，miR-M的抑制劑可以是在心肌細胞中抑制miR-M表達的物質，也可以是與miRNA具有特異性相互作用，例如與miRNA特異性結合的物質。miR-M的抑制劑例如可以抑制miRNA與DICER或RISC的相互作用。miR-M 的抑制劑優(yōu)選可以是天然小分子物質，例如，鹽酸小檗堿、溴乙錠、氯化兩面針堿、或者去氫紫堇堿或者它們中的兩種或者多種的組合。miRNA由細胞核中轉運出來之后被特異性核酸酶DICER降解，并與 RISC(RNA-induced silencing complex)結合活化，然后引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯。如果往細胞中加入對miRNA具有特異性相互作用的天然化學小分子，那么小分子與 miRNA的結合將影響miRNA與DICER，RISC的相互作用，從而達到抑制miR-M對基因的調控作用。這些對miRNA有潛在抑制作用的小分子包括但不限于鹽酸小檗堿、溴乙錠、氯化兩面針堿、去氫紫堇堿，其中對miR-M序列雙鏈RNA的親合力順序為鹽酸小檗堿>溴乙錠> 氯化兩面針堿>去氫紫堇堿。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及核酸分子，其具有miR-M在JP基因上的靶點序列，選自SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :4在嚴緊條件下雜交的序列或與SEQ ID NO :4相比具有1-5個氨基酸的添加、缺失、插入和/或替代的序列。優(yōu)選地，所述核酸分子在嚴緊條件下雜交的核酸分子。另一方面，本發(fā)明提供了 miR-M的抑制劑在心肌細胞中上調JP2蛋白表達的用途。所述心肌細胞來自例如哺乳動物，例如大鼠，優(yōu)選地是人。
本發(fā)明還提供了 miR-M的抑制劑在制備用于在心肌細胞中上調JP2蛋白表達的制劑中的用途。本發(fā)明還提供了 miR-M的抑制劑，其用于在心肌細胞中上調JP2蛋白表達。本發(fā)明另一方面涉及所述的miR-M抑制劑在制備改善心肌細胞功能(例如提高心肌細胞的收縮能力或者提供或者改善心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)效率)，和/或預防或治療心衰的藥物中的用途。另一方面，本發(fā)明提供了上述miR-M抑制劑用于改善心肌細胞功能(例如提高心肌細胞的收縮能力或者提供或者改善心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)效率)，和/或預防和治療心衰的方法。本發(fā)明另一方提供了通過檢測miR-M的表達來診斷心衰或者患心衰傾向的方法，包括檢測受試者樣品中的HliR-M的量，并與正常無心血管相關疾病患者的HliR-M的量進行比較。其中，所述受試者樣品優(yōu)選血液。其中，所述受試者包括哺乳動物，優(yōu)選人。哺乳動物可以是Sprague-Dawley大鼠即SD大鼠。本文所述診斷優(yōu)選是早期診斷，所述“早期”是指在人心臟收縮功能(左心室射血分數(shù)，LVEF)處于正常數(shù)值范圍(LVEF>50%)，但診斷有運動耐力下降的臨床表現(xiàn)的時期； 對于大鼠，所述“早期”是左心室短軸縮短率> 40%，但是診斷出表現(xiàn)出明顯的向心性心臟重構的時期。本發(fā)明另一方面提供了用于診斷受試者是有心衰或者有心衰傾向的試劑盒，其包含檢測HliR-M豐度(或量)的試劑。在本發(fā)明的該方面中，所述試劑包括特異性結合 miRNAM的探針(核酸探針)，例如標記的探針。在該方面中，所述診斷優(yōu)選是早期診斷。其中，所述受試者包括哺乳動物，優(yōu)選人。另一方面，本發(fā)明提供了檢測miR-M豐度(或量，即所測樣本中miR-M多少)的試劑、檢測HliR-M表達水平或者檢測HliR-M表達變化水平的試劑在制備用于診斷，優(yōu)選早期診斷受試者是否患心衰的診斷劑中的用途。在本發(fā)明的該方面中，所述試劑包括能夠與 HiiR-M特異結合的核酸探針，特異性結合miRNAM的熒光標記探針。其中，所述受試者包括哺乳動物，優(yōu)選人。本發(fā)明另一方面涉及篩選用于預防或治療心衰的藥物的方法，其包括篩選能夠在心肌細胞、心臟成纖維細胞中抑制HliR-M表達的抑制劑。優(yōu)選地，包括將心肌細胞與候選物質(如化合物)接觸，檢測HliR-M表達，和選擇抑制HliR-M表達的物質。另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)上述方法篩選得到的物質，用于預防或治療心衰。本發(fā)明一方面涉及調控JP2表達的miRNA的篩選。提取miRNA數(shù)據(jù)庫miRbase中收集的人和大鼠已知miRNA序列和相應的JP2 3' UTR序列，利用miRanda、Targetscan等miRNA結合位點預測軟件，對JP2 3' UTR上可能存在的miRNA結合位點進行預測，初步提出可能參與調控JP2表達的miRNA，具體包括 miR-24, miRNA96和miRNA343等，并在心衰樣品中檢測這些miRNA的表達情況。本發(fā)明的技術路線參見圖1。在本發(fā)明的一個實施方式中，JP2基因3 ‘ UTR上miRNA的結合位點將通過軟件預測完成。選擇在JP2 3' UTR具有兩個或更多結合位點的miRNA進行下一步研究。在本發(fā)明的另一個實施方式中，檢測人和動物的心衰樣品(包括人心臟移植術后標本，SD大鼠心室肌標本等)中表達變化的miRNA。在本發(fā)明的另一個實施方式中，心衰時表達變化的miRNA 利用Northern blot等方法進行檢測。在本發(fā)明的另一個實施方式中，miRNA的篩選依據(jù)相關的評價指標(如預測 miRNA的總背景得分情況、合計Pct值等)結合心衰miRNA表達譜的變化初步篩選，設計體內外實驗進一步篩選。本發(fā)明另一方面涉及確立可能參與JP2負性調控的miRNA。我們前期的預實驗結果提示miR-M在JP2基因的3' UTR區(qū)存在2個結合位點， 提示HiiR-M可能參與JP2的表達調控。因此本課題將首先驗證和闡明HiiR-M對JP2表達的調控作用。研究方法實驗分為細胞實驗和動物實驗兩大部分。技術路線參見圖2。在本發(fā)明的一個實施方式中，采用升主動脈結扎技術建立壓力負荷誘導的心衰大鼠模型；在本發(fā)明的另一個實施方式中，利用Northern blot和real-timePCR等方法檢測 miR-24的表達情況；在本發(fā)明的另一個實施方式中，采用Wfestern blot和real-timePCR等方法檢測 JP2的表達情況；在本發(fā)明的另一個實施方式中，利用電鏡方法檢測心肌細胞亞細胞水平的超微結構變化；在本發(fā)明的另一個實施方式中，利用激光共聚焦顯微鏡和膜片鉗技術檢測心肌細胞功能；在本發(fā)明的另一個實施方式中，構建JP2 3' UTR熒光素酶報告基因質粒及與 miR-24共轉染于HEK-293細胞，檢測JP2 3 ‘ UTR是否存在miR-M的結合位點；在本發(fā)明的另一個實施方式中，干擾miR-M與作用靶點的結合和過表達miR-M 技術分別構建含有antisense miR-M和miR-M編碼基因的質粒，以病毒(腺病毒、慢病毒)為載體導入大鼠體內或者心肌細胞之中，確定JP2的表達情況。本發(fā)明另一方面涉及miR-M的變化規(guī)律在心衰檢測中的重要作用。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)分子水平興奮收縮耦聯(lián)的時間在心衰樣品中顯著延長， 因此可以利用它檢測心衰前期心臟的功能異常。但是鑒于JP2基因在心臟特異表達，取材和檢測有一定的困難，由此若能根據(jù)miRNA的變化規(guī)律檢測心衰的發(fā)展，將更具有臨床意義。我們將從已經(jīng)建立的臨床數(shù)據(jù)庫中，選取500例初診時具有心衰潛在危險因素(高血壓、高血脂、糖尿病、動脈粥樣硬化)，但是缺乏明確心衰癥狀的患者和無心血管相關疾病患者的資料，測定血漿中miRNA水平和心功能，并設計雙盲方法隨訪檢測上述數(shù)據(jù)的可靠性和隨病程變化上述數(shù)據(jù)的波動；通過對這些數(shù)據(jù)的深入分析，闡明miRNA的動態(tài)變化在心衰檢測中的重要意義。研究方法分析miR-M等待檢miNA的表達變化與心功能的聯(lián)系。技術路線參見圖3。在本發(fā)明的另一個實施方式中，利用高通量試劑盒結合PCR技術檢測血液中的 miRNA。
發(fā)明的有益效果本發(fā)明在生物信息學預測分析的基礎上，提出了 miR-M調控JP2的分子機制，確立了心衰中HiiR-M與JP2下調的直接關系，在分子水平闡明了新的參與心衰早期病理改變的重要機制，為心衰的早期特異性診斷和早期防治提供了新的線索。


圖1 顯示用于篩選調控JP2表達的miRNA的技術路線。圖2 顯示用于確立可能參與JP2負性調控的miRNA的技術路線。圖3 顯示用于miRNA變化與心功能關聯(lián)分析的技術路線。圖4 顯示心衰大鼠左心室肌內miR-M的Nothern Blot實驗。a. CHT為處于代償期心力衰竭大鼠左室肌的組織，與對照組(Control)相比，miR-M表達明顯上調，η = 7只， ***Ρ < 0. 001。b. DHT為處于是代償期心力衰竭大鼠左室肌的組織，與對照組相比，miR-M 表達亦上調，η = 5只，**Ρ < 0. 01。rRNA為內參。圖5 顯示心衰大鼠左心室肌內miR-M表達的Real-time PCR實驗。CHT為處于代償期心力衰竭大鼠左室肌的組織，DHT為處于是代償期心力衰竭大鼠左室肌的組織，與對照組(Control)相比，miR-24 表達上調，η = 4-6 只，***P < 0. 001，*P < 0. 05vs Control。圖6 顯示心衰患者左心室肌內miR-M表達的Nothern Blot實驗。正常(Normal) 組為非心源性腦卒中心臟捐助者的心肌組織，心衰(HF)組為心臟移植術后心衰心肌組織， HF組miR-M的表達較Normal組增高，例數(shù)=5例。圖7 顯示心衰患者左心室肌內miR-M表達的Real-time PCR實驗。正常 (Normal)組為非心源性腦卒中心臟捐助者的心肌組織，心衰(HF)組為心臟移植術后心衰心肌組織，HF組miR-24的表達較Normal組增高，**P < 0. 01，例數(shù)=4-6例。圖8 顯示心衰大鼠左心室肌內JP2表達分析。A 為westernblot方法檢測到在心衰大鼠(HF)左心室內JP2表達較對照組的正常大鼠(Normal)明顯減少。#*P<0.001，n =6。B 為Real-time PCR方法檢測到HF組JP2的mRNA表達亦下調。< 0. 01，n = 6圖9 顯示心衰患者心室肌內JP2表達分析。A 為westernblot方法檢測到在心衰患者(HF)左心室內JP2表達較對照組的正常人(Normal)明顯減少。*P < 0. 001，η = 5-7。B 為Real-time PCR方法檢測到HF組JP2的mRNA表達亦下調。< 0. 01, η = 5-7。圖10 顯示HEK-293細胞中miR-M對JP2調控的螢光素酶活性實驗。Control miRNA :miR-24的陰性對照序列；Iuci 含有JP 23’ UTR的熒光素酶報告基因質粒； luci-ml 將miR-M在JP2 3’ UTR第一個可能結合的靶序列突變后的熒光素酶報告基因質粒；luci-m2 將miR-M在JP2 3’ UTR第二個可能結合的靶序列突變后的熒光素酶報告基因質粒；luci-m3 將miR-M在JP2 3’ UTR可能結合的兩段靶序列同時突變后的熒光素酶報告基因質粒。將miR-M與Iuci共轉染于HEK-293細胞后，螢光素酶的活性較Control miRNA+luci組明顯受抑制，而將miR-M在JP2 3’ UTR上可能結合的兩段靶序列同時突變后，miR-M對螢光素酶的抑制作用消失了，說明JP2 3’UTR上的兩段靶序列是miR-M的結合序列。**P < 0. 01，##P < 0· 01。圖11 顯示過表達miR-M (慢病毒載體)下調新生大鼠心肌細胞的JP2水平。新生大鼠心肌細胞感染表達miR-M的慢病毒，MOI = 10，感染48h。A, a為病毒感染細胞情況，b為心肌細胞感染病毒后，通過real-time PCR方法，檢測到的miR-M過表達的倍數(shù)， *P<0. 05。B，a過表達miR-M后，通過Wfestern blot方法檢測到JP2蛋白表達下調，b通過 real-time PCR 方法檢測到 JP2 mRNA 表達下調，< 0. 01，*#P < 0. 001，例數(shù)=3。圖12 顯示攜帶JP 2的腺病毒感染心衰的大鼠心肌細胞后改善心肌細胞內的鈣致鈣釋放狀態(tài)。A，構建表達JP2基因的病毒。將攜帶JP2的腺病毒感染心衰的大鼠心肌細胞后，細胞內JP2的表達水平上調。耦聯(lián)潛伏期(Latency interval)是衡量L-型鈣通道分子(L-type calcium trannel)與蘭尼丁受體分子(Ryanoidin receptor)間耦聯(lián)效率 (calcium-induced calcium efficiency)的指標，這一腺病毒感染方法將改善心肌細胞內的鈣致鈣釋放狀態(tài)，恢復心肌細胞的正常功能。圖A和B的數(shù)據(jù)來自大鼠的心肌細胞，考慮到大鼠與人的基因相似性，此結果可能也適用于人類。圖B中，圖例上方顯示的是一個典型的鈣火花圖像(上)和時間曲線(下)。耦聯(lián)潛伏期(latency)指的是從鈣小星起始時間到觸發(fā)鈣火花發(fā)生之間的時間差。圖例下方測量耦聯(lián)潛伏期，JP-2組的潛伏期顯著短于 GFP 組(P < 0. 05)。圖13 小分子干擾miRNA示意圖，小分子(drug moleculars)與miRNA特異性結合后影響miRNA的成熟進而影響miRNA對靶基因的調控作用。
14 g miRBase MiM^ (http//microrna. sanger. ac. uk/)白勺 miR-24 白勺前體序列(pre-miRNAM)，以及我們研究選取的部分序列一rnoM-a(miR-24)序列和 rno24-a (miR-24)的質譜。圖15 :rn0M-a序列與小分子結合的質譜圖，分別為鹽酸小檗堿，綠化兩面針堿， 其中小分子與RNA的濃度比為4 1, m/z 1679. 5為雙鏈RNA峰。m/z 1713.4,1780.6, 1847. 0 為[d+P]5-，[d+2P]5-和[d+2P]5_，m/z 1747. 2，1813. 5 為[D+P]5_ 和[D+2P]5_。 對rn024-a序列雙鏈RNA，其親合力順序為鹽酸小檗堿>溴乙錠>氯化兩面針堿>去氫紫堇堿。圖16 壓力負荷模型大鼠左心室舒張期后壁厚度(PWD)以及短軸縮短率(FS % ) 的變化。與假手術組(Control)相比，代償性肥厚組(CHT)與失代償性肥厚組(DHT)的 PffD均增厚，F(xiàn)S%只在DHT期明顯下降，即收縮功能降低了。_P < 0. 001，< 0. Olvs Control, η = 4-11 只。圖17:在JP2 3' UTR上具有兩個或兩個以上預測結合位點的miRNA(以大鼠基因為例)。在JP2 3，UTR第583-589個堿基和第675-681個堿基，分別存在與miR-24第2-8 個堿基互補的堿基序列(白色標記部分)，這提示miR-M可能通過與JP2 3’UTR的這些互補堿基結合，從而使JP2的表達下調。圖18 顯示JP2基因轉染后，細胞的鈣瞬變幅度及耦聯(lián)效率。圖 19 螢光素酶報告基因質粒 pMIR-REPORT Luciferase (ABI，AM5795)。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例1
參與調控JP2表達的miRNA的生物信息學預測和分析利用miRanda、TargetScan等軟件對人和大鼠JP2基因的3'非翻譯區(qū)(3‘ UTR) 中可能存在的已知miRNA的結合位點進行了生物信息學預測，從中篩選出在JP2 3' UTR 上具有兩個或兩個以上預測結合位點的miRNA(以大鼠基因為例)，如圖17所示(來自 TargetScan軟件的預測)，白色區(qū)域表示miR-M與JP2 3' UTR可能的結合位點，rno表示來自于大鼠，下同)。實施例2心衰大鼠和人的心肌細胞中miR-M的表達分析(1)大鼠心衰模型的建立為闡明心衰狀態(tài)下miR-24的變化，我們通過對約50g重的雄性Sprauge Dawley(SD)大鼠進行升主動脈結扎手術，建立了壓力負荷的心衰動物模型，方法如下動物在麻醉狀態(tài)開胸，將內徑0. 9mm的銀夾置于主動脈根部2-3mm處；假手術組(sham)進行同樣的手術處理，但并不放置銀夾。術后7-11周，檢測大鼠心臟的血流動力學及超聲參數(shù)。 血流動力學指標的測定方法動物麻醉后(5%三溴乙醇腹腔注射，劑量250mg/kg體重)， 將其固定于恒溫加熱板上。取頸部右側旁正中切口，分離皮下組織及胸鎖乳突肌，暴露并分離右側頸總動脈。將一端與多導生理記錄儀(Biopac Systems)連接的2. OF Millar導管經(jīng)右側頸總動脈逆行插入左心室，穩(wěn)定后記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP) > 左 Jll、室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)、收縮期左心室壓力上升最大速率(maximum rate of rise of left ventricular pressure, +dp/dt max)禾口舒張期左^[>室壓；0下P華最大速率(maximum rate of degression of left ventricular, -dp/dt min)。計算以左室內壓校正的左室內壓力下降最大速度-dp/dt min/LVSP。然后將導管從左室退出到升主動脈，穩(wěn)定后記錄主動脈內收縮壓 (systolic blood pressure, SBP)、主動脈內舒張壓(dias tolic blood pressure,DBP)。超聲參數(shù)的檢測方法如下采用 Vevo770ultrasound system (Visual Sonics Inc，Toronto， Canada)小動物超聲儀，探頭頻率為17. 5MHz。探測深度2cm，掃描速度100mm/S大鼠吸入 4% 5%異氟烷(C3H2CIF50)基礎麻醉后刮去胸前體毛，仰臥位固定于恒溫加熱板上，持續(xù)吸入2. 5%異氟烷，四肢與心電圖電極相連用于監(jiān)測心率并記錄心電圖，各參數(shù)連續(xù)測量 5個心動周期，計算均值。結果提示心衰組的左心室顯著增厚但收縮指標(FS%)顯著降低 (圖16)。我們分別收取了 Sham(ControI)及心衰組(CHT 心衰代償期，DHT 心衰失代償期) 的心臟標本，進行 Northern blots 實驗，探針序列為 5，-AATTCTGAGTGTGTCTGAGCCT_3，(SEQ ID NO :1)，5，端進行32P標記和real-time PCR, real-time PCR使用ABI公司試劑盒，其中
舌 Taqman microRNA assays (^^· :4427975, miR-24 :4373072, u6 :4395470X1)，Taqman universal PCR master:4324018), Taqman microRNARTkit ( Mj^ :4366596),
反應條件依照試劑盒說明書進行。檢測到miR-M在CHT及DHT組大鼠較假手術組(即 control)表達增多(見圖4和圖5)。(2)心衰患者左心室肌中miR-M的表達分析根據(jù)上述(1)中的方法，在心衰患者左心室肌(細胞)中進行miR-M的表達分析。 檢測到HiiR-M在CHT及DHT組較正常組(即control)表達增多，結果見圖6，7實施例3
心衰大鼠和人的心室肌中JP2的表達分析。分別通過^festern blot和Real-time PCR方法檢測JP2在蛋白和基因水平的變化。Western blot 采用10%的聚丙烯酰胺分離膠，每個樣品50ug蛋白，電壓為80v，待溴酚蘭菊分離膠下緣1厘米，停止電泳。使用的是硝酸纖維素膜，轉膜時間條件為200mA，2小時。JP2抗體由北京奧維亞生物技術有限公司合成純化而成，抗體濃度為lug/ul，由2%的 BSA(牛血清白蛋白)稀釋而成。先用5%牛奶室溫封閉1小時，再用稀釋好的JP2抗體孵育硝酸纖維素膜，4攝氏度，過夜。第二天采用TBST洗膜，320轉，十分鐘換液一次，采用山羊抗兔的辣根過氧化物酶標記二抗(中杉金橋，ZB2301)，稀釋度1 5000，再次孵育1小時， 室溫，240轉。再次洗膜，條件同上。洗好膜后進行顯影，將膜置于300ul反應液(150ul A 液，150ul B液，Thermo，Supersignal West Pico，Prod#1862420，1862421.)室溫孵育 5min， 緩慢輕搖，將膜上液滴滴盡后封入保鮮膜，壓入X光片曝光(曝光時間視信號強弱而定)。 Real-time PCR :JP2 (大鼠)引物序列上游5，_AGGCGGGTGCCAAGAAGAAG_3，(SEQ ID NO 2)； 下游 5，-CGATGTTCAGCAGGATCA(SEQ ID NO :；3)。GAPDH(大鼠)5，_ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA_3 ‘(SEQ ID NO 4) ；5，-AAGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3' (SEQ ID NO :5)。反應條件為預變性 950C 5min，變性94°C 30s，退火62°C 30s，延伸72°C 30s，30個循環(huán)。JP2 (人)引物序列上游 5，-ATGGGCTGGGCATAGAGAC-3，(SEQ ID NO :6)，下游 5，-TTGAAGCCATGTGTCCACTC-3，(SEQ ID NO :7)。GAPDH (人)上游 5，-AGCTGAACGGGAAGCTCACT-3，(SEQ ID NO 8)，下游 5，-TAGG TCCACCACTGACACGTTG-3，(SEQ ID NO 9)。反應條件為預變性 95°C lOmin，變性 95°C 15s 退火、延伸 60°C lmin，40 個循環(huán)。采用的儀器為 Eppendorf-Mastercycler 印 realplex, Germany，檢測熒光信號，反應條件為預變性95°C 5min，變性94°C 30s，退火62°C 30s，延伸 72°C30s，30個循環(huán)。GAPDH作為內參進行校正。計算方法采用2_Δ 相對定量法對JP2的表達進行定量。結果見圖8和圖9，心衰患者心肌JP2表達下調。實施例4miR-24可能參與了 JP2的調控構建包含各個miR-M結合位點以及結合位點引入突變的JP23’ UTR構建螢光素酶報告基因質粒，所用質粒為PMI R-REP0RT Luc if erase (ABI, AM5795)(見圖19)，插入的片段(即 JP2 3’ UTR)序列為GAGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGTCATCCCCTAGGACCAGTAGTGGG GGAGACCTGAGCATCTGAGCCTTTGGCTGGGAAGCCACCTAAAGGGGTCTGGGGTGGGGTGGAGAAGGTTAGGCATG TTGGTGATGGCCCCTAATTCTGAGTGTGTCTGAGCCTGAGGCAGGAAGCTT(SEQ ID NO :10)，內切酶使用 HindIII (NEB公司，識別序列AAGCTT)和Mel (NEB公司，識別序列GAGCTC)，突變位點為劃線的堿基GAG，將其突變?yōu)镃TC。為觀察miR-M是否調控JP2的表達，構建螢光素酶報告基因質粒，進行熒光素酶報告基因試驗。具體過程如下以SD大鼠基因組DNA為模板，進行PCR，引物序列為sense 5，-AGAGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGT-3’ (SEQ ID NO :11)，antisense 5’ -TAAGCTTCCTGCC TCAGGCTCAGACAC-3，(SEQ ID NO : 12)，反應條件為預變性 94°C 5min，變性 94°C 30s，退火 58°C 30s，延伸72°C 30s，35個循環(huán)。產(chǎn)物為含有miR-M潛在作用靶序列的JP2 3，UTR(G AGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGTCATCCCCTAGGACCAGTAGTGGGGGAGACCTGAGCATCTGAGCCTTTGGCT GGGAAGCCACCTAAAGGGGTCTGGGGTGGGGTGGAGAAGGTTAGGCATGTTGGTGATGGCCCCTAATTCTGAGTGT GTCTGAGCCTGAGGCAGGAAGCTT)，之后切膠回收此目的片段，將其連接到T載體(GeneMar，T168-101，)，測序正確后將此片段從T載體切下，切膠回收后連接到pMIR-REPORT Luciferase載體上面，經(jīng)測序正確后，將其與化學合成的成熟miR-M共轉染到Human Embryonic Kidney-293 (HEK-293)細胞(上海滬峰化工有限公司，編號CRL-1573)，通過雙熒光素酶檢測儀(promega, Dual-Luciferase Reporter Assay System, cat#E1960),檢測發(fā)現(xiàn)miR-M能夠抑制熒光素酶活性。進一步將miR-M的潛在作用靶點進行突變(突變后的序列是GAGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGTCATCCCCTAGGACCAGTAGTGGGGGAGACCTGAGCATCT CTCCCTTTGGCTGGGAAGCCACCTAAAGGGGTCTGGGGTGGGGTGGAGAAGGTTAGGCATGTTGGTGATGGCCCCTA ATTCTGAGTGTGTCTCTCCCTGAGGCAGGAAGCTT) (SEQ ID NO :13)，可以發(fā)現(xiàn)將兩段靴序列同時突變時，miR-24抑制作用消失，這說明JP2很可能受miR-M直接調控。具體變化見圖10。實施例5過表達miR-M下調新生SD大鼠心肌細胞中JP2水平。將新生SD大鼠心肌細胞分離下來后，接種到6孔板中，每孔約1. 2x106個細胞及Iml培養(yǎng)液，3 后更換新鮮培養(yǎng)液一次，所述培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，然后加入表達pri-miRM(miR24的前體)的慢病毒(吉凱基因慢病毒載體系統(tǒng)由pGC_LV 載體、pHelper 1. 0載體和pHelper 2. 0載體三質粒組成。pGC-LV載體中含有HIV的基本元件5，LTR和3，LTR以及其他輔助元件，例如WRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根據(jù)不同的實驗目的針對 pGC-LV 載體改造以進行啟動子活性研究、基因表達研究、RNA干擾等研究。pHelper 1. 0載體中含有 HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結構蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因， 編碼調節(jié)gag和pol基因表達的調節(jié)因子。pHelper 2. 0載體中含有單純皰疹病毒來源的 VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。)，M0I = 10，繼續(xù)培養(yǎng)后，根據(jù)本領域已知的方法收集細胞并提取總蛋白和RNA。對所提取的總蛋白和RNA分別進行Western blot 實驗和real-time PCR實驗(請說明所用抗體、PCR引物等重要試劑和試劑盒名稱PCR試劑 ^ =TransGen Biotech, Code#AQ101_03， TranStart Green qPCR Supermix) 。 JP2 $ 蛋白水平和mRNA水平的變化，同時也檢測成熟miR-M的過表達情況。結果見圖11。結果顯示，過表達miR-M可以下調新生SD大鼠心肌細胞中JP2水平。實施例6miRNA對心衰心肌細胞超微結構的影響為闡明心衰狀態(tài)下興奮-收縮耦聯(lián)的微觀變化，我們通過主動脈結扎手術建立了壓力負荷的心衰動物模型(SD大鼠)。動物在麻醉狀態(tài)開胸，將內徑0.9mm的銀夾置于主動脈根部2-3mm處；假手術組進行同樣的手術處理，但并不放置銀夾。術后7_11周，檢測大鼠心臟的血流動力學及超聲參數(shù)(PLoS Biol. 2007，5:203-211.)。結果提示假手術組收縮參數(shù)指標(FS%=49.6±5. 75% )正常；心衰組的左心室顯著增厚(心衰組PWD = 2. 53士0. 14mm，假手術組 PWD = 1.99士0.32mm)但收縮指標(FS % = 30. 72士2. 10% )降低。為鑒定JP2基因轉染干預細胞興奮-收縮耦聯(lián)功能，即腺病毒載體(何種載體，來源)介導的大鼠JP2基因過表達對培養(yǎng)大鼠心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)功能的影響，我們通過酶解方法分離培養(yǎng)心室肌細胞，病毒轉染后用全細胞膜片鉗將細胞去極化到OmV并持續(xù) 300ms，結合激光共聚焦線掃描成像同步記錄LCC鈣電流及胞內鈣瞬變。在本實施例中，采用全細胞膜片鉗配合激光共聚焦顯微鏡鈣信號同步記錄的方法進行功能測定，將細胞鉗制在-70mV，并依次給予從_70mV至+70mV的階躍刺激，記錄此時細胞的鈣電流大小。同時， 結合激光共聚焦先掃描技術，我們以7. 68ms每道的速度采集細胞內鈣瞬變信號。最后將不同去極化電位下的電流和鈣熒光信號進行分析。在心衰細胞中，鈣電流密度沒有變化，鈣瞬變幅度顯著降低，因而興奮-收縮耦聯(lián)效率(鈣瞬變與鈣電流的比值)顯著降低。相比之下，JP2基因轉染組細胞的鈣瞬變幅度及耦聯(lián)效率都沒有變化。這說明，JP2基因轉染干預方法可以成功影響細胞的功能。具體數(shù)據(jù)參見圖18 對照組細胞和JP2過表達的心衰組細胞鈣瞬變幅度之間無顯著差異，而(沒有JP2處理的)心衰組細胞的鈣瞬變幅度大大降低。 由于鈣電流密度變化不大，因此其興奮收縮耦聯(lián)效率也是(沒有JP2處理的)心衰組細胞明顯低于對照組和JP2過表達組。心衰動物模型大鼠在體注射慢病毒和腺病毒載體攜帶的JP2基因我們擴增出大鼠JP2基因的編碼區(qū)共2079bp，并將其分別插入帶有熒光標記的腺病毒載體 pADeasy-CMV-CMV-GFP(來源)以及慢病毒載體 PII3· [CMV-IRES-tdTOMATA(來源)中， 并分別進行病毒包裝擴增和純化，最后鑒定滴度為腺病毒大于l*10~12pfU，慢病毒大于 l*10~9pfu，如上所述分離原代成年大鼠心肌細胞后測定心肌細胞的鈣信號，結果提示JP2 病毒轉染組，LCC-RyR分子耦聯(lián)效率顯著高于未轉染病毒的細胞和轉染GFP對照病毒的細胞。上述結果表明JP2的表達增強了心衰細胞LCC-RyR分子耦聯(lián)效率。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
權利要求
1.在心肌細胞中上調JP2蛋白表達(例如至少提高10%、20%、30%、優(yōu)選地45%、 60% )的方法，包括步驟給心肌細胞(例如離體的、或體內的)施用miR-M的抑制劑，或者將心肌細胞和miR-24的抑制劑接觸。
2.miR-24的抑制劑在心肌細胞中上調JP2蛋白表達的用途。
3.miR-24的抑制劑在制備用于在心肌細胞中上調JP2蛋白表達的制劑中的用途。
4.miR-24的抑制劑，用于在心肌細胞中上調JP2蛋白表達。
5.改善心肌細胞功能，和/或預防或治療心衰的方法，包括給心肌細胞(例如離體的、 或體內的)施用HliR-M的抑制劑，或者將心肌細胞和HliR-M的抑制劑接觸。
6.miR-24抑制劑在制備改善心肌細胞功能(例如提高心肌細胞的收縮能力或者提高， 或者改善心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)效率，或者改善心肌細胞內的鈣致鈣釋放狀態(tài))，和/或預防或治療心衰的藥物中的用途。
7.miR-24抑制劑用于改善心肌細胞功能，和/或預防或治療心衰的用途。
8.miR-24抑制劑，用于改善心肌細胞功能，和/或預防或治療心衰。
9 通過檢測miR-M的表達來診斷心衰或患心衰傾向的方法，包括檢測受試者樣品(優(yōu)選血液)中的HliR-M的量或豐度，并與正常無心血管相關疾病患者的HliR-M的量進行比較，所述診斷優(yōu)選是早期診斷。
10.用于(優(yōu)選早期)診斷受試者(包括哺乳動物，優(yōu)選人)是否患心衰或患心衰傾向的試劑盒，其包含檢測HliR-M豐度(或量)的試劑，所述試劑包括例如特異性結合 miRNA24的探針(核酸探針)，例如標記的(優(yōu)選熒光標記的)探針。
11.檢測miR-M豐度(或量)的試劑在制備用于(優(yōu)選早期)診斷受試者是否患心衰或者有患心衰傾向的診斷劑中的用途。
12.篩選用于預防或治療心衰的藥物的方法，其包括篩選能夠在(離體或者體內如實驗動物中的)心肌細胞、心臟成纖維細胞中抑制miR-M表達的抑制劑。優(yōu)選地，包括將心肌細胞與候選物質(如化合物)接觸，檢測miR-M表達，和選擇抑制miR-M表達的物質。
13.權利要求12篩選得到的物質，用于預防或治療心衰。
14.篩選用于預防和治療心衰的藥物的方法，其包括利用miRNA結合位點預測軟件，對 JP23' UTR上可能存在的miRNA結合位點進行預測，提出可能參與調控JP2表達的miRNA， 并在心衰樣品中檢測這些miRNA的表達情況，以及針對驗證得到的miRNA設計反義miRNA。
15.以上任何一項權利要求的主題，其中，所述的miR-M的抑制劑可以是能夠抑制 miR-M對靶基因(JP2基因)的調控作用的任何物質，可以是在心肌細胞中抑制miR-M表達的物質，也可以是與miRNA具有特異性相互作用，例如與miRNA特異性結合的物質，或者抑制miRNA與DICER或RISC的相互作用的物質，miR-24的抑制劑優(yōu)選可以是天然小分子物質，例如，鹽酸小檗堿、溴乙錠、氯化兩面針堿、或者去氫紫堇堿或者它們中的兩種或者多種的組合。
16.核酸分子，其包含或具有miR-M在JP基因上的靶點序列，或者由miR-M在JP基因上的靶點序列構成，所述靶點序列選自(a)SEQ ID NO 10、14、15 或；或(b)(a)的互補序列；或(c)(a)或(b)的對應RNA序列；或(d)與(a)、(b)或(c)在嚴緊條件下雜交的序列或與(a)、(b)或(c)相比具有1-5個 (例如1-3個，1-2個，或1個)氨基酸的添加、缺失、插入和/或替代的序列。
17.與權利要求16的核酸分子在嚴緊條件(優(yōu)選高嚴緊條件)下雜交的核酸分子(可以是DNA或者RNA)。
18.核酸，其序列選自或者其包含如下序列(a)SEQ ID NO :1-17 ；或(b)(a)的互補序列；或(c)(a)或(b)的對應RNA序列；或(d)與(a)、(b)或(c)在嚴緊條件下雜交的序列或與(a)、(b)或(c)相比具有1-5個 (例如1-3個，1-2個，或1個)氨基酸的添加、缺失、插入和/或替代的序列。
全文摘要
本發(fā)明基于JP2的基因治療技術與現(xiàn)代腺病毒病毒載體靶向輸送技術結合起來，從心衰模型開始，研究JP2轉基因治療技術應用于治療心衰治療的可行性和關鍵技術方法。本發(fā)明還提供了miR-24的抑制劑，及其在制備用于在心肌細胞中上調JP2蛋白表達、改善心肌細胞功能、和/或預防或治療心衰的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了用于診斷受試者是否患心衰的試劑盒，其包含檢測miR-24豐度(或量)的試劑。
文檔編號G06F19/16GK102242080SQ20111012958
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權日2010年5月13日
發(fā)明者徐 明, 李素芳, 王世強, 王猛, 王秀杰, 駱觀正 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所, 北京大學第三醫(yī)院