專利名稱：Ⅱ期和Ⅲ期結(jié)腸癌的分子分期和預(yù)后的制作方法
M期和I I I期結(jié)腸癌的分子分期和預(yù)后
背景技術(shù)：
結(jié)腸癌的精確分期不但有利于疾病預(yù)后預(yù)測，還有利于患者的臨床管理和治療選 擇。在20世紀(jì)40年代引入了基于臨床和病理特征的 Μ系統(tǒng)，并逐漸演變發(fā)展，在20世 紀(jì)80年代后得到了廣泛的采用(Quirke等人(2007))。在這些指南中，充分的淋巴結(jié)評估 對結(jié)腸癌的正確分期至關(guān)重要。然而，由于患者、外科醫(yī)生、病理學(xué)者和腫瘤相關(guān)變量，63% 的結(jié)腸癌患者可能得不到充分的淋巴結(jié)評估。(Baxter等人(2005))?；蚪M學(xué)方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于癌癥分類和子分類的鑒定、疾病進(jìn)展預(yù)測以及治 療選擇和療效預(yù)測(Bhattacharjee 等人(2001) ；Khan 等人(2001) ；Sorlie 等人(2003)； Agrawal等人(2002)；和Wang等人(2005))。基因和表觀遺傳學(xué)信息為當(dāng)前癌癥診斷和預(yù) 后準(zhǔn)確性的改善提供了可能，并可與臨床和病理參數(shù)互為補充。通過使用微陣列分析，為II 期結(jié)腸癌患者開發(fā)了 23基因預(yù)后標(biāo)記(Wang等人(2004))。此標(biāo)記已經(jīng)從多個臨床試點的 獨立樣本中得到進(jìn)一步驗證(Jiang等人(2008))。然而，據(jù)信可以通過腫瘤的更精確分期 來提高基因標(biāo)記的預(yù)后價值。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個方面，診斷包括用于測定結(jié)腸癌是處于II期還是III期的7基因標(biāo)記。在本發(fā)明的另一方面，診斷包括用于檢測7基因表達(dá)的試劑，該7基因用于區(qū)分II 期與III期結(jié)腸癌。在本發(fā)明的另一方面，用于區(qū)分II期與III期結(jié)腸癌和/或提供結(jié)果預(yù)后的試劑 盒包括用于檢測7標(biāo)記基因的表達(dá)以及任選的一組組成型表達(dá)基因的表達(dá)的試劑。


圖1使用Affymetrix微陣列對137例II期與III期患者進(jìn)行的7基因標(biāo)記ROC 和Kaplan-Meier生存分析。A. 7基因標(biāo)記的ROC曲線。B.使用7基因標(biāo)記對137個冷凍 腫瘤樣本分析所得的Kaplan-Meier曲線以及時序檢驗。高風(fēng)險組和低風(fēng)險組差異顯著(P =0. 007)。圖2使用RTQ-PCR對123個FPE II期與III期樣本進(jìn)行7基因標(biāo)記的ROC和 Kaplan-Meier生存分析。A. 7基因標(biāo)記的ROC曲線。B.使用7基因標(biāo)記對123個FPE樣本分 析所得的Kaplan-Meier曲線以及時序檢驗。高風(fēng)險組和低風(fēng)險組差異顯著(P = 0. 0271)。圖3使用RTQ-PCR對來自4個不同臨床試點的180個獨立的FPE II期結(jié)腸癌樣 本進(jìn)行7基因標(biāo)記的Kaplan-Meier生存分析。
具體實施例方式淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是II期和III期結(jié)腸癌分期最重要的臨床因素之一，并且臨床指南建 議對于正確分期，必需檢查至少12個淋巴結(jié)。然而，不到40%的結(jié)腸癌患者接受了充分的淋巴結(jié)評估(Baxter等人(2005))。用于預(yù)測II期結(jié)腸癌的腫瘤復(fù)發(fā)的23基因預(yù)后標(biāo)記 以前便已涉及，例如美國專利公布20060063157，其全文以引用方式并入本文。隨后的文獻(xiàn) 中有報道，使用新鮮冷凍腫瘤標(biāo)本在123例II期結(jié)腸癌的獨立患者組中對該標(biāo)記進(jìn)行驗 證，并使用福爾馬林固定石蠟包埋樣本在110例II期患者的組中對該標(biāo)記進(jìn)行驗證(Jiang 等人(2008))。本發(fā)明涉及更精確的分期。生物標(biāo)記為核酸/蛋白質(zhì)指示標(biāo)記物的任何標(biāo)記。核酸可以為本領(lǐng)域中任何已知 的核酸，包括(但不限于)細(xì)胞核、線粒體(同質(zhì)性、異質(zhì)性)、病毒、細(xì)菌、真菌、支原體等 的核酸。該標(biāo)記可以為直接或間接的，并且可在給定生理參數(shù)條件下以及與內(nèi)參、安慰劑、 正常組織或另一惡性腫瘤進(jìn)行比較時，測量基因過表達(dá)或低表達(dá)。生物標(biāo)記包括(但不限 于)核酸和蛋白質(zhì)(均有過表達(dá)和低表達(dá)以及直接和間接之分)。使用核酸作為生物標(biāo)記 可包括本領(lǐng)域已知的任何方法，包括(但不限于)測量DNA擴(kuò)增、缺失、插入和復(fù)制；測量 RNA;測量微RNA(miRNA)；測量雜合性缺失(LOH)；直接測量或經(jīng)基因組擴(kuò)增后測量單核苷 酸多態(tài)性(SNPs，Brookes (1999))、拷貝數(shù)多態(tài)性(CNPs)；測量微衛(wèi)星DNA ；測量表觀遺傳改 變(例如DNA低甲基化或高甲基化)和FISH。使用蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)記的方法包括本領(lǐng)域 已知的任何方法，包括(但不限于)測量數(shù)量、活性、修飾(例如糖基化、磷酸化、ADP核糖 基化、泛素化等)或免疫組織化學(xué)(IHC)和代謝周轉(zhuǎn)。其他生物標(biāo)記包括成像、分子譜、細(xì) 胞計數(shù)和細(xì)胞凋亡標(biāo)記物。當(dāng)標(biāo)記基因含有Seq ID NO指定的序列時，其對應(yīng)于該序列。當(dāng)基因區(qū)段或片段含 有足以表明其為該基因序列的一部分參考序列或其互補序列時，其對應(yīng)于此基因序列。當(dāng) 基因表達(dá)產(chǎn)物中的RNA、mRNA或cDNA雜交到含有此序列(如探針)的組合物上時，其對應(yīng) 于此序列，或者對于肽或蛋白質(zhì)來說，其被該mRNA編碼。當(dāng)基因表達(dá)產(chǎn)物的區(qū)段或片段含 有足以區(qū)分出該基因序列或基因表達(dá)產(chǎn)物序列的一部分參考基因表達(dá)產(chǎn)物或其互補序列 時，基因表達(dá)產(chǎn)物的區(qū)段或片段對應(yīng)于此基因序列或基因表達(dá)產(chǎn)物序列。在本說明書中描述和受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明的方法、組合物、制品和試劑盒 包括一種或多種標(biāo)記基因。在整個本說明書中使用的“標(biāo)記物”或“標(biāo)記基因”是指對應(yīng)于如 下任何基因的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物所述基因的過表達(dá)或低表達(dá)與指示或組織類型相關(guān)。建立基因表達(dá)譜的優(yōu)選方法包括測定RNA的量，該RNA由能夠編碼蛋白質(zhì)或肽 的基因的生成。此測定通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、競爭性RT-PCR、實時RT-PCR、差異顯示 RT-PCR,Northern印跡分析和其他相關(guān)的測試實現(xiàn)。雖然可以采用單個PCR反應(yīng)來實施這 些技術(shù)，但最好擴(kuò)增由mRNA產(chǎn)生的互補DNA (cDNA)或互補RNA (cRNA)，并使用微陣列對其進(jìn) 行分析。多種不同的陣列構(gòu)型及其制備方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并在如下專利中 有所描述，例如 5445934、5532128、5556752、5242974、5384261、5405783、5412087、5424186、 5429807、5436327、5472672、5527681、5529756、5545531、5554501、5561071、5571639、 5593839、5599695、5624711、5658734 和 5700637。微陣列技術(shù)允許同時測量數(shù)千種基因的穩(wěn)態(tài)mRNA水平，從而提供了識別細(xì)胞增 殖失控的效應(yīng)(如啟動、阻滯或調(diào)控)的強(qiáng)大工具。目前廣泛使用的微陣列技術(shù)有兩種。 第一種是cDNA陣列，第二種是寡核苷酸陣列。雖然這些芯片的構(gòu)造存在差異，但是基本上 所有的下游數(shù)據(jù)分析和輸出都是相同的。這些分析的結(jié)果通常為接收自標(biāo)記探針的信號的 強(qiáng)度的測量值，該標(biāo)記探針用于檢測來自樣本的cDNA序列，該cDNA序列在微陣列的已知位置上與核酸序列雜交。信號強(qiáng)度通常與cDNA的量成比例，因此也與在樣本細(xì)胞中表達(dá)的 mRNA成比例。大量的此類技術(shù)是可得的并且可用的。用于確定基因表達(dá)的優(yōu)選方法可見于 6271002、6218122、6218114 和 6004755。通過比較此類信號強(qiáng)度可以分析表達(dá)水平。完成該比較最好的方式是生成試驗樣 本與對照樣本中基因表達(dá)強(qiáng)度的比率矩陣。例如，可將來自患病組織的基因表達(dá)強(qiáng)度與相 同類型的良性或正常組織產(chǎn)生的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行比較。這些表達(dá)強(qiáng)度的比值反映了試驗樣本 和對照樣本之間在基因表達(dá)上的倍數(shù)變化。選擇可以基于產(chǎn)生序列表的統(tǒng)計試驗，該序列表與腫瘤起源的原發(fā)部位相關(guān) 的因子之間的每個基因的差異表達(dá)的顯著性證據(jù)有關(guān)。此類試驗的例子包括ANOVA和 Kruskal-Wallis。列表中的名次可以作為模型中的權(quán)重，該模型設(shè)計用于將這種權(quán)重總和 (最多到截止值)解釋為有利于一類而不利于另一類的優(yōu)勢證據(jù)。文獻(xiàn)中所述的以前的證 據(jù)也可用于調(diào)整權(quán)重。優(yōu)選的實施例通過識別穩(wěn)定的對照組，并將此組換算成所有樣本之間的方差為 零，從而將每個測量值歸一化。將該對照組定義為受測定的系統(tǒng)誤差影響并且已知不會獨 立于該誤差而改變的任何單個內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物或內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物組。所有標(biāo)記物都通過產(chǎn)生零方差 的樣本特異性因子調(diào)整，以用于對照組的任何描述性統(tǒng)計量(如平均值或中值)或用于直 接測量。作為另外一種選擇，如果對照組方差只與系統(tǒng)誤差有關(guān)的假設(shè)不真，而進(jìn)行歸一化 時所得分類誤差較小，則對照組仍然按照規(guī)定使用。非內(nèi)源峰值對照也可能是有用的，但不 是優(yōu)選的?；虮磉_(dá)譜可以多種方式顯示。最常見的方式是將原始熒光強(qiáng)度或比率矩陣布置 到樹狀圖中，其中列表示試驗樣本，行表示基因。如此布置數(shù)據(jù)可以使有相似表達(dá)譜的基因 彼此相鄰。每個基因的表達(dá)比率用顏色來直觀表示。例如，小于1的比率(下調(diào))出現(xiàn)在圖 譜的藍(lán)色部分，而大于1的比率(上調(diào))出現(xiàn)在圖譜的紅色部分?？缮藤彨@得的計算機(jī)軟 件程序可用于顯示此類數(shù)據(jù)，這些計算機(jī)軟件程序包括“Genespring” (SiliconGenetics, Inc.)和 “Discovery” 以及 “Infer” (Partek, Inc.)就測量蛋白質(zhì)含量來確定基因表達(dá)而言，本領(lǐng)域任何已知的方法都是合適的，只 要其可導(dǎo)致足夠的特異性和靈敏度。例如，可通過使蛋白質(zhì)結(jié)合至該蛋白質(zhì)特異性的抗體 或抗體片段，并測量抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的量來測量蛋白質(zhì)含量。可用放射性熒光試劑或其 他可檢測試劑標(biāo)記抗體，以方便檢測。檢測方法包括(但不限于)酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)和免疫印跡技術(shù)。在本發(fā)明的方法中使用的調(diào)控基因在“實例”中有所描述。相對于不同起源惡性 腫瘤患者而言，差異表達(dá)的基因在特定起源惡性腫瘤患者中或者上調(diào)或者下調(diào)。上調(diào)和下 調(diào)是相對的術(shù)語，其意指基因表達(dá)量相對于某些基線存在可檢測差值(超出用來測量的系 統(tǒng)中的噪音的貢獻(xiàn))。在這種情況下，根據(jù)算法確定基線。使用相同的測量方法可測得患病 細(xì)胞中所關(guān)注的基因相對于基線水平或者上調(diào)或者下調(diào)。在上下文中，“患病的”是指由細(xì) 胞不可控制的增殖引起的阻斷或干擾或潛在干擾機(jī)體功能正常發(fā)揮的機(jī)體狀態(tài)變化。當(dāng)某 人的基因型或表型的某些方面與疾病的存在相符時，此人被診斷為患有此疾病。然而，進(jìn)行 診斷或預(yù)后的行為可以包括確定疾病/狀況事宜，例如確定復(fù)發(fā)可能性、治療類型和治療 監(jiān)控。在治療監(jiān)控中，通過比較基因表達(dá)隨時間的變化，確定是否基因表達(dá)譜已經(jīng)變化為或正變化為更符合正常組織的模式，從而就給定療程的效果做出臨床判斷。可以對基因進(jìn)行分組，以便獲得的關(guān)于在此組中基因集合的信息提供作出臨床相 關(guān)判斷(例如診斷、預(yù)后或治療選擇)的重要依據(jù)。這些基因集合構(gòu)成本發(fā)明的組合。對 于大部分診斷標(biāo)記物，通常希望使用足以作出正確醫(yī)療判斷的數(shù)量最少的標(biāo)記物。這樣可 以防止為等待進(jìn)一步分析而延誤治療，并防止無謂地浪費時間和資源。確定基因表達(dá)組合的一種方法是通過使用優(yōu)化算法，例如在確定股票投資組合時 廣泛使用的均值方差算法。該方法在20030194734中有詳細(xì)描述?；旧?，該方法需要確定 一組輸入值(金融應(yīng)用中的股票，此處則為用強(qiáng)度衡量的表達(dá))，該輸入值會優(yōu)化使用它所 獲得的收益(如產(chǎn)生的信號)，同時又使收益的不確定性最低。許多商業(yè)軟件程序可以進(jìn)行 這種運算。優(yōu)選使用本說明書中稱為“Wagner軟件”的“Wagner As sociatesMean-Variance Optimization Application" (Wagner Associates -力胃iftUiSffl禾呈。
使用"Wagner Associates Mean-VarianceOptimization Library，，(Wagner Associates 均值_方差優(yōu)化庫)中的函數(shù)確定有效邊界，優(yōu)選采用馬可維茨理論中的優(yōu)化投資組合 (Markowitz (1952) )0使用這類軟件需要轉(zhuǎn)化微陣列數(shù)據(jù)，以便以股票收益方式將該數(shù)據(jù)作 為輸入處理，并且在該軟件用于所需財務(wù)分析目的時，需要使用風(fēng)險測量值。選擇組合的方法也可以包括啟發(fā)式規(guī)則的使用。優(yōu)選地，在生物學(xué)基礎(chǔ)上和為得 出臨床結(jié)果而對該技術(shù)的理解的基礎(chǔ)上制定啟發(fā)式規(guī)則。更優(yōu)選地，將這些規(guī)則用于優(yōu)化 方法中的輸出。例如，可以將選擇組合的均值-方差方法應(yīng)用于在患有癌癥的受試者中差 異表達(dá)的多種基因的微陣列數(shù)據(jù)。該方法的輸出將為最優(yōu)基因集，該基因集可以包括表達(dá) 于周邊血液和患病組織的某些基因。如果試驗方法中使用的樣本采自周邊血液，并且差異 表達(dá)于癌癥病例中的某些基因，也可以差異表達(dá)于周邊血液，則可以應(yīng)用啟發(fā)式規(guī)則，其中 組合選自不包括差異表達(dá)于周邊血液的那些樣本的有效邊界。當(dāng)然，也可以在形成有效邊 界之前應(yīng)用該規(guī)則，例如，在數(shù)據(jù)預(yù)選過程中應(yīng)用該規(guī)則?？梢允褂梦幢嘏c所考慮的生物學(xué)相關(guān)的其他啟發(fā)式規(guī)則。例如，可以應(yīng)用這樣一 條規(guī)則，即只有指定百分比的組合可以由特定的基因或一組基因表示?？缮藤彨@得的軟件 (例如Wagner軟件)很適合這些類型的啟發(fā)式方法。例如，當(dāng)除了準(zhǔn)確度和精度之外的因 素(如預(yù)期許可費)對是否愿意包括一個或多個基因有影響時，這種方法是可用的。本發(fā)明的基因表達(dá)譜也可以結(jié)合在癌癥診斷、預(yù)后或治療監(jiān)控方面有用的其他非 基因診斷方法一起使用。例如，在一些情況下，將上述基于基因表達(dá)的方法的診斷作用與來 自諸如血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物(如癌癥抗原27.29 (“CA 27.29”))之類的常規(guī)標(biāo)記物的數(shù)據(jù)結(jié) 合具有有益效果。存在一系列此類標(biāo)記物，其中包括諸如CA 27. 29之類的被分析物。在一 種此類方法中，從接受治療的患者體內(nèi)定期采集血樣，然后對血樣進(jìn)行有關(guān)上述一種血清 標(biāo)記物的酶免疫分析。當(dāng)標(biāo)記物濃度顯示腫瘤復(fù)發(fā)或治療失敗，則采集適于基因表達(dá)分析 的樣本來源。當(dāng)存在可疑腫塊時，則通過細(xì)針穿刺術(shù)(FNA)采樣，然后再按上述方法分析從 腫塊中抽取的細(xì)胞的基因表達(dá)譜。作為另外一種選擇，可以從之前移除腫瘤的組織的鄰近 區(qū)域采集組織樣本。當(dāng)其他試驗會得到含混結(jié)果時，該方法尤其有用。分離核酸和蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見(例如)全文以引用方式并入本 文的US 6,992, 182以及在互聯(lián)網(wǎng)的萬維網(wǎng)上的Ambion網(wǎng)址和美國專利20070054287中有 關(guān)RNA分離的討論。
DNA分析可以為本領(lǐng)域已知的任何方法，包括(但不限于)甲基化、去甲基化、染 色體核型分析、倍體分析(非整倍體、多倍體)、DNA完整性分析(通過凝膠或分光光度測定 評價)、易位、突變、基因融合、活化-鈍化、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、拷貝數(shù)或用于檢測基因 構(gòu)成的全基因組擴(kuò)增。RNA分析包括本領(lǐng)域已知的任何方法，包括(但不限于)q-RT-PCR、 miRNA或轉(zhuǎn)錄后修飾。蛋白質(zhì)分析包括本領(lǐng)域已知的任何方法，包括(但不限于)抗體檢 測、翻譯后修飾或代謝周轉(zhuǎn)。蛋白質(zhì)可以為細(xì)胞表面標(biāo)記物，優(yōu)選地為上皮、內(nèi)皮、病毒或細(xì) 胞型。生物標(biāo)記可以與病毒/細(xì)菌感染、侵害或抗原表達(dá)有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明制備的試劑盒包括用于確定基因表達(dá)譜的格式化檢測分析法。這些試 劑盒可以包括進(jìn)行檢測分析所需的一些或全部材料，例如試劑和指令以及在其中進(jìn)行生物 標(biāo)記檢測分析的介質(zhì)。本發(fā)明的制品包括可用于治療、診斷、預(yù)后和以其他方式評估疾病的基因表達(dá)譜 的表現(xiàn)形式。這些基因表達(dá)譜的表現(xiàn)形式被壓縮到可以由設(shè)備自動讀取的介質(zhì)中，例如計 算機(jī)可讀介質(zhì)(磁性介質(zhì)、光學(xué)介質(zhì)等)。該制品也可以包括評估該介質(zhì)中的基因表達(dá)譜 的指令。例如，該制品可以包括CD ROM，該CD ROM具有比較上述基因組合的基因表達(dá)譜的 計算機(jī)指令。該制品也可以將基因表達(dá)譜以數(shù)字形式記錄在其中，以便將其與得自患者樣 本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。作為另外一種選擇，基因表達(dá)譜可以不同的表示格式進(jìn)行記 錄。圖像記錄是一種此類格式。聚類算法(例如上述得自Partek，InC.的“DISCOVERY”和 “INFER”軟件中所包括的)是可視化此類數(shù)據(jù)的最佳輔助工具。根據(jù)本發(fā)明的不同類型的制品為用來顯示基因表達(dá)譜的介質(zhì)或格式化檢測分析 法。這些制品可以包括(例如)微陣列，在微陣列中互補序列或探針固定到矩陣上，而表 征所關(guān)注基因的序列與固定有互補序列或探針的矩陣結(jié)合，從而形成對其存在性的可讀判 定。作為另外一種選擇，根據(jù)本發(fā)明的制品可以制成試劑盒，該試劑盒用于進(jìn)行雜交、擴(kuò)增 和產(chǎn)生表征所關(guān)注基因表達(dá)水平的信號，以檢測癌癥。提供了下面的實例以舉例說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實例1材料和方法患者樣本從78例編碼的II期和59例III期結(jié)腸癌患者中采集獲得冷凍腫瘤標(biāo)本。存檔 的原發(fā)性腫瘤樣本是在外科手術(shù)時收集的。在蘇木精-伊紅染色的組織切片上評估每個標(biāo) 本的組織病理學(xué)，以確定診斷和腫瘤含量。通過計數(shù)上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核來估計腫瘤的 百分比含量?；颊吆细駱?biāo)準(zhǔn)包括結(jié)腸原發(fā)性II期和III期腺癌，主要治療手段僅為外科 手術(shù)，不需輔助或新輔助治療，在組織樣本中至少有70%的腫瘤細(xì)胞，隨訪期至少3年，排 除此前便已發(fā)展成遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)的患者。按照結(jié)腸癌患者全科醫(yī)療對術(shù)后患者進(jìn)行監(jiān)測，包括 針對患者的體格檢查、血細(xì)胞計數(shù)、肝功能試驗、血清CEA和結(jié)腸鏡檢查。為所選患者進(jìn)行 腹部CT掃描和胸部X光檢查。如果疑似癌癥復(fù)發(fā)，則為患者進(jìn)行診斷檢查，包括針對所選 患者的結(jié)腸鏡檢查、胸部/腹部/骨盆CT和MRI。如果可行的話，則在所有患者中進(jìn)行診斷 性活組織檢查，以確定轉(zhuǎn)移病灶。復(fù)發(fā)時間或無病時間被定義為就復(fù)發(fā)患者而言，為從手 術(shù)日期到確認(rèn)腫瘤復(fù)發(fā)的日期；就無病患者而言，為從手術(shù)日期到最后隨訪日期。還從85例II期和38例III期結(jié)腸癌患者中采集獲得FPE腫瘤標(biāo)本。還有單獨采
7集的180例II期結(jié)腸癌FPE標(biāo)本。評估每個標(biāo)本的組織病理學(xué)，以確定診斷和腫瘤含量。 患者合格標(biāo)準(zhǔn)和隨訪程序與冷凍樣本選擇中的相同。微陣列分析處理所有冷凍腫瘤組織以進(jìn)行RNA提取(Baxter等人(2005))。使用公布的方 法(Affymetrix (Santa Clara, CA))制備生物素標(biāo)記的靶標(biāo)并將其雜交到Affymetrix U133a 基因芯片(Affymetrix U133a GeneChip)(Affymetrix(Santa Clara, CA))上。 使用標(biāo)準(zhǔn)的Affymetrix方案掃描陣列。每個探針組被認(rèn)為是一個單獨的基因。使用 Affymetrix GeneChiρ 分析軟件MAS 5. 0，并根據(jù)以前描述的分析方法計算每個基因 的表達(dá)值(Wang等人(2004))。從FPE樣本提取RNAFPE樣本是福爾馬林固定的(η = 45)或Hollandes固定的(η = 65)FPE組織。 在FPE組織樣本中的RNA提取是根據(jù)使用高純RNA石蠟試劑盒(High Pure RNA Paraffin Kit) (Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN))的改良方案進(jìn)行的。FPE 組織塊根據(jù) 塊的大小進(jìn)行切片(6_8mm = 6 X 10 μ m，≥8mm = 3 X 10 μ m)。按照制造商手冊中所描述的 方法將切片脫蠟。將組織切片在55°C下于烘箱中干燥10分鐘，并重懸于100 μ L組織裂解 緩沖液、16 μ L 10% SDS和80 μ L蛋白酶K中。樣本在恒溫混勻器中渦旋和溫育，恒溫混勻 器設(shè)定值為轉(zhuǎn)速400rpm、溫度55°C、時間3小時。按照試劑盒手冊進(jìn)行樣本處理的后續(xù) 步驟。使用分光光度計，通過讀取OD 260/280值來定量RNA樣本，然后將RNA樣本稀釋到 終濃度為50ng/uL。提取的RNA樣本在_80°C下儲存于無RNA酶純水中直至使用。RTQ-PCR 分析使用一步多重RTQ-PCR檢測分析對提取自FPE組織的RNA樣本進(jìn)行基因標(biāo)記和 看家對照基因的評估。為了最小化RTQ-PCR反應(yīng)的差異，使用三種看家對照基因(包括 β -肌動蛋白基因、HMBS和RPL13A)歸一化RNA的輸入量。為了防止擴(kuò)增樣本中任何污染 DNA，用于RTQ-PCR檢測分析的PCR引物或探針設(shè)計成跨越內(nèi)含子，以使該檢測分析不擴(kuò)增 任何殘留的基因組DNA。在一步RTQ-PCR反應(yīng)中使用100納克的總RNA。使用在TaqMan 一步 PCR 預(yù)混試劑盒(TaqMan one-Step PCR Master Mix reagents kit) (Applied Biosystems (Fresno, CA))中包含的40 XMultiscribe和RNA酶抑制劑混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。 然后將cDNA加入無尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)的2XMaster Mix。在ABI 7900HT序列檢測 系統(tǒng)(ABI 7900HT sequencedetection system) (Applied Biosystems (Frenso，CA))上使 用10 μ L反應(yīng)體積規(guī)格的384孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物和探針的濃度分別為4和2. 5 μ mol/ L。反應(yīng)混合液在48°C下溫育30分鐘以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再在95°C下10分鐘進(jìn)行Ampl i taq 酶活化步驟，然后進(jìn)行40個循環(huán)的95°C下變性15秒、60°C下退火和延伸1分鐘。生成從 IOOpg至IOOng起始材料范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)R2值為> 0. 99時，接受循環(huán)閾值(Ct)。另 外，按照制造商手冊將所有引物和探針優(yōu)化到具有相同的擴(kuò)增效率。用于擴(kuò)增7基因和3 看家對照基因的引物和探針序列如下，每條序列均從5’到3’方向書寫EP2MA 正向引物CATTATTCAAGGCCGAGTACAGATG ；EP2MA 反向引物CACGTACACGATGTGTCCCTTCT ；EP2MA 探針FAM-CAGGCGGTGTGCCTGCTGCAT_BHQ。
KLF5 正向引物CCTGAGGACTCACACTGGTGAA ；KLF5 反向引物CAGCTCATCCGATCGCG ；KLF5 探針FAM-CAAGTGTACCTGGGAAGGCTGCGACTG-BHQ。CAPG 正向引物CGCAGCTCTGTATAAGGTCTCTGA ；CAPG 反向引物GATATCAGCAGTTCAAGGGCAA ；CAPG 探針FAM-AACCTGACCAAGGTGGCTGACTCCAG-BHQ。LILRB 3 正向引物AGATGGACACTGAGGCTGCTG ；LILRB 3 反向引物CTTCCGTCTAAGGGTCAAGCTG ；LILRB 3 探針FAM-CCCAGGATGTGACCTACGCCCAG_BHQ。LAT 正向引物CTCCCACCGGACGCCATC ；LAT 反向引物CCTCGTTCTCGTAGCTCGCCA ；LAT 探針FAM-CGGGATTCTGATGGTGCCAACAGT-BHQ-1-TT。CHC1 正向引物TTTGTGGTGCCTATTTCACCTTT ；CHCl 反向引物CGGAGTTCCAAGCTGATGGTA ；CHCl 探針FAM-CCACGTGTACGGCTTCGGCCTC-BHQ。YffHAH 正向引物CCTGTCTCTTGGGAAGCAGTTT ；YffHAH 反向引物GCTCCTGTGGGCTCAAAG ；YWHAH 探針FAM-ATCATGGGCATTGCTGGACTGATGG_BHQ。β -肌動蛋白基因正向引物AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA ；β -肌動蛋白基因反向引物AATGCTATCACCTCCCCTGTGT ；β -肌動蛋白基因探針FAM-AGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTC-BHQ。HMBS 正向引物CCTGCCCACTGTGCTTCCT ；HMBS 反向引物GGTTTTCCCGCTTGCAGAT ；HMBS 探針FAM-CTGGCTTCACCATCG-BHQ。RPL13A 正向引物CGGAAGAAGAAACAGCTCATGA ；RPL13A 反向引物CCTCTGTGTATTTGTCAATTTTCTTCTC ；RPL13A 探針FAM-CGGAAACAGGCCGAGAA-BHQ。對于每個樣本，按照Δ Ct = Ct (靶基因)-Ct (4個對照基因的平均值)計算ACt。 Δ Ct歸一化已廣泛應(yīng)用于臨床RTQ-PCR檢測分析。統(tǒng)計方法t檢驗用于比較II期結(jié)腸癌患者和III期結(jié)腸癌患者之間每個基因的區(qū)別。對 作為訓(xùn)練集的CCF患者進(jìn)行邏輯回歸(Logistic regression)，以建立評估成為III期的 可能性的模型。由邏輯模型得出的每個患者成為III期的概率用于生成“接受者操作特 性”(ROC)曲線。從ROC曲線中選擇概率閾值以產(chǎn)生至少90%的特異性(正確鑒定90% 的II期患者)。由訓(xùn)練集構(gòu)建的模型用于計算其中一組測試集的患者成為III期的概率。 KaplanMeier生存曲線(Kaplan等人(1958))和從Cox比例風(fēng)險回歸計算所得的風(fēng)險率用 于評估在預(yù)測的II期和預(yù)測的III期患者之間的無復(fù)發(fā)生存的差異。使用S-Plus 6-1 軟件(Insightful (Fairfax Station, VA))進(jìn)行所有的統(tǒng)計分析。MM
患者和腫瘤特件在表1和表2中總結(jié)了患者及其腫瘤的臨床和病理特征。表1 -Cleveland臨床中心新鮮冷凍樣本和FPE樣本的患者和腫瘤特性
因素Cleveland臨床新鮮冷凍Cleveland 臨床 FPEII期III期II期III期#%#%#丨％%平均年齡(歲)70676965ii ±140 3851 4932 2754 4646 3954 4620 1853 47T期 Tl T2 T30 68 100 87 1310 35 1417 59 240 75 100 88 124 25 910 66 24等級 良好 中度 較差7 57 149 73 183 40 165 68 279 61 1510 72 181 26 113 68 29癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移 否7 719 9122 3737 6314 7116 8414 2437 63檢測的中值LN數(shù)28 (2-165)31 (2-333)29 (2-165)38 (8-333)表2 :180個驗證樣本(FPE組織)的患者和腫瘤特性
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權(quán)利要求
一種對結(jié)腸直腸癌狀態(tài)進(jìn)行分期的方法，包括鑒定基因組合中的差異調(diào)控，所述基因組合基本上由Seq ID NO 1、Seq ID NO 3、SeqID NO 5、Seq ID NO 7、Seq ID NO 9、Seq ID NO 11、和Seq IDNO 13組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中對II期和III期結(jié)腸直腸癌進(jìn)行區(qū)分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中表達(dá)模式的比較通過模式識別方法進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述模式識別方法包括使用Cox比例風(fēng)險分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法在原發(fā)性腫瘤樣本上進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中如果樣本的基因表達(dá)模式為在Cox比例風(fēng)險分析 中指示II期的模式，那么結(jié)腸直腸癌為II期結(jié)腸直腸癌，如果不是這樣，則為III期結(jié)腸 直腸癌。
7.一種用于對結(jié)腸直腸癌患者進(jìn)行分期的試劑盒，包括用于檢測以下物質(zhì)的材料包 含 Seq ID NO U Seq ID NO 3、Seq ID NO 5、SeqID NO 7、Seq ID NO 9、Seq ID NO 11和 Seq ID NO 13的基因組合的分離的核酸序列、它們的互補序列、或其部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中唯一的基因組合為SeqID NOU Seq ID NO 3、 Seq ID NO 5、Seq ID NO 7、Seq ID NO 9、SeqID NO 11 和 Seq ID NO 13 以及看家基因或 對照基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，還包括用于進(jìn)行微陣列分析的試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，還包括介質(zhì)，所述核酸序列、它們的互補序列，或其 部分通過所述介質(zhì)進(jìn)行分析。
11.用于評估結(jié)腸直腸癌狀態(tài)的制品，包括用于鑒定以下物質(zhì)的材料包含SeqID NO USeq ID NO 3,Seq ID NO 5,Seq ID NO 7,Seq ID NO 9,Seq ID NO 11 和 Seq ID NO 13 的基因組合的核酸序列、它們的互補序列、或其部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制品，其中唯一的基因組合為SeqID NOU Seq ID NO 3、 Seq ID NO 5、Seq ID NO 7、Seq ID NO 9、SeqID NO 11 和 Seq ID NO 13 以及看家基因或 對照基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制品，還包括用于進(jìn)行微陣列分析的試劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制品，還包括介質(zhì)，所述核酸序列、它們的互補序列、或其 部分通過所述介質(zhì)進(jìn)行分析。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制品，包括用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的試劑，其中所述試劑包括用 于檢測基本上由以下組成的基因的探針和引物Seq ID NO USeq ID NO 3,Seq ID NO 5,Seq ID NO 7,Seq IDNO 9,Seq ID NO 11 和 Seq ID NO 13以及看家基因或?qū)φ栈颉?br> 16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制品，還包括用于分析使用所述試劑盒所得的結(jié)果的指 令，以進(jìn)行結(jié)腸直腸癌分期。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的制品，其中所述指令為計算機(jī)指令。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制品，其中所述計算機(jī)指令包含在磁性介質(zhì)或光學(xué)介質(zhì)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及II期和III期結(jié)腸癌的分子分期和預(yù)后。本發(fā)明的試劑和制品包括用于進(jìn)行7基因檢測分析的試劑，以將結(jié)腸癌分期為II期或III期結(jié)腸癌。
文檔編號G06F19/00GK101960022SQ200980107672
公開日2011年1月26日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者Y·張, Y·王, Y·蔣 申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司