專利名稱：神經(jīng)發(fā)生的mri成像相關(guān)方法
神經(jīng)發(fā)生的MRI成像相關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明由美國(guó)政府的DARPA授權(quán)的NO. DAAD19-02-01-0267所支持，因而美國(guó)政 府在本發(fā)明具有一定的權(quán)益。
本發(fā)明參考了一些文獻(xiàn)。試驗(yàn)細(xì)節(jié)I-III所引用的文獻(xiàn)及其它相關(guān)參考文獻(xiàn)將在試驗(yàn) 細(xì)節(jié)III部分結(jié)尾列出。而試驗(yàn)細(xì)節(jié)IV引用的參考數(shù)據(jù)將在該部分結(jié)尾處列出。這里公開 的文獻(xiàn)被合并并作為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)，目的是為了更全面描述本發(fā)明的狀況，日期及提 出的要求。
背景技術(shù)：
過去六年里，神經(jīng)發(fā)生被認(rèn)為是CNS (中樞神經(jīng)系統(tǒng))基本的生理過程和疾病過程。 DrGage和其同事在人海馬齒狀腦回中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)發(fā)生，并證明神經(jīng)發(fā)生是可調(diào)節(jié)的，同 時(shí)還指出成人海馬的功能性神經(jīng)發(fā)生(Ray，Peterson等，1993; Palmer,Ray等，1995; Kempermann, Kuhn等，1997; Eriksson, Perfilieva等，1998; van Praag, Kempermann等， 1999; vanPraag,Schinder等，2002)。不同于傳統(tǒng)觀點(diǎn)，這些發(fā)現(xiàn)提出一個(gè)不可忽視的事 實(shí)，即人類在其一生中能夠生成新的神經(jīng)細(xì)胞。這項(xiàng)研究向人們展示了新的治療人類中樞 神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病和障礙的可能性。
許多研究認(rèn)為海馬神經(jīng)發(fā)生與運(yùn)動(dòng)有聯(lián)系。Kempermann等(1998)研究指出衰老小鼠 的齒狀腦回中繼續(xù)出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生，并且當(dāng)衰老小鼠生活在有群居相互接觸，探險(xiǎn)和運(yùn)動(dòng)的 環(huán)境中能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生(Kempermann, Kuhn等，1998)。雖然隨著年齡增加，神經(jīng)發(fā)生 減少，但是有研究表明復(fù)雜環(huán)境因素帶來的刺激能促進(jìn)神經(jīng)元的存活及分化。隨后van Pmag等(1999)研究指出，與其它因素相比，跑步能更有效的促進(jìn)成年大鼠神經(jīng)元的增 殖，存活及分化。這些其它因素被認(rèn)為包括水迷宮訓(xùn)練，yoke游泳試驗(yàn)，復(fù)雜環(huán)境和標(biāo) 準(zhǔn)居住場(chǎng)地。
神經(jīng)元可塑性的功能依賴性調(diào)節(jié)和自身修復(fù)是腦損傷物理治療的動(dòng)力因素 (Kempermann和Gage 2000)。在多種損傷和疾病中，由于病人的身體條件不允許，而不能 及早開始運(yùn)動(dòng)鍛煉或不允許進(jìn)行運(yùn)動(dòng)鍛煉。預(yù)測(cè)治療性干預(yù)的功能性療效較復(fù)雜，其依賴 大范圍的因素，包括特定的疾病/損傷，家庭和社會(huì)團(tuán)體資源，及診斷的準(zhǔn)確性。當(dāng)前治
療的輔助手段是在神經(jīng)疾病或損傷的早期階段誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，可以增強(qiáng)療效從而提高治療 效果，使得病人獲得更多的功能。
目前，尸體解剖分析是檢測(cè)一種化合物是否能誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的唯一方法。但在檢測(cè)一 種化合物是否能誘導(dǎo)人體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生時(shí)明顯受到限制。因此為了篩選，驗(yàn)證及優(yōu)化潛在的 誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生藥物，重要的研究方向是研究體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生標(biāo)識(shí)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種方法，用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，其患有海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生減少導(dǎo) 致的疾病，該方法包括給對(duì)象施用治療有效劑量的化合物，該化合物引起對(duì)象海馬齒狀腦 回腦血容量的增加，其增加量比其引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的增加量的百分比要高， 從而達(dá)到治療的目的。
本發(fā)明還提供一種方法，用于抑制哺乳動(dòng)物對(duì)象由于患有海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生減少導(dǎo) 致的疾病的發(fā)作，該方法包括給對(duì)象施用預(yù)防有效劑量的化合物，該化合物引起對(duì)象海馬 齒狀腦回腦血容量的增加，其增加量，比其引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的增加量的百 分比要高，從而達(dá)到抑制疾病發(fā)作的目的。
本發(fā)明還提供一種方法，用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，其患有海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生增加 而導(dǎo)致的疾病，該方法包括給對(duì)象施用一種治療有效劑量的化合物，該化合物引起對(duì)象海 馬齒狀回腦血容量的減少，其減少量比其引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的減少量的百分
比要高，從而達(dá)到治療的目的。
本發(fā)明提供一種方法，用于抑制哺乳動(dòng)物對(duì)象患有海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生增加而導(dǎo)致 的疾病的發(fā)作，該方法包括給對(duì)象施用預(yù)防有效劑量的化合物，該化合物引起對(duì)象海馬齒
狀腦回腦血容量的減少，其減少量比其引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的減少量的百分比 要高，從而達(dá)到抑制疾病發(fā)作的目的。
本發(fā)明還提供一種方法，用于測(cè)定一種藥物是否促進(jìn)哺乳動(dòng)物對(duì)象海馬齒狀腦回神經(jīng) 發(fā)生的增加，該方法包括(a)測(cè)定海馬齒狀腦回一定體積的組織的腦血容量，以及對(duì)象 海馬CA1區(qū)一定體積的組織的腦血容量；(b)給對(duì)象施用藥物，給藥方式為允許該藥物
進(jìn)入對(duì)象海馬齒狀腦回和海馬CA1區(qū)；(C)通過使用已知能引起這種增加的的藥物，在一
個(gè)足以產(chǎn)生可測(cè)定的對(duì)象海馬齒狀腦回的神經(jīng)發(fā)生增加的時(shí)間段以后，測(cè)定對(duì)象海馬齒狀
腦回該體積的組織的腦血容量和對(duì)象海馬CA1區(qū)該體積的組織的腦血容量；(d)比較步
驟(a)和步驟(c)檢測(cè)的腦血容量，從而測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生特有的
腦血容量增加，該增加表明了該藥物能促進(jìn)對(duì)象海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生的增加。
此外本發(fā)明提供一種方法，用于檢測(cè)一種藥物是否減少哺乳動(dòng)物對(duì)象海馬齒狀腦回神 經(jīng)發(fā)生，該方法包括(a)測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回一定體積的組織的腦血容量以及對(duì)象海 馬CA1區(qū)一定體積的組織的腦血容量；(b)給對(duì)象施用藥物，其施用方式為允許該藥物 進(jìn)入對(duì)象海馬齒狀腦回和海馬CA1區(qū)；(C)通過使用已知能引起這種減少作用的藥物，在 一個(gè)足以在對(duì)象中產(chǎn)生可檢測(cè)的海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生的減少的時(shí)間段后，測(cè)定對(duì)象海馬 齒狀腦回該體積的組織腦血容量以及對(duì)象海馬CA1區(qū)該體積的組織腦血容量；(d)比較
步驟(a)和步驟(c)檢測(cè)的腦血容量，從而確定對(duì)象的海馬齒狀腦回是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生特
有的腦血容量減少，該減少表明該藥物能減少對(duì)象海馬齒狀腦回的神經(jīng)發(fā)生。


圖1:人的運(yùn)動(dòng)和CBV。圖像最高的圖像是造影前的MRI，用解剖學(xué)標(biāo)志來識(shí)別 四個(gè)海馬亞區(qū)的結(jié)構(gòu)范圍(ROIs)。中間的圖像表示四個(gè)海馬亞區(qū)的結(jié)構(gòu)范圍(ROIs)。 值得注意的是這些結(jié)構(gòu)范圍不包括亞區(qū)之間的緣帶，這些緣帶不能確切的被MRI顯影。 曲線圖左上角曲線圖中表示自我匯報(bào)的運(yùn)動(dòng)程度僅與齒狀腦回CBV相關(guān)。
圖2:圖表曲線表示隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加腦血容量(CBV)的改變。
圖3:試驗(yàn)設(shè)計(jì)顯示神經(jīng)發(fā)生可以用MRI非損傷性地顯影。
圖4:試驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)試系列化合物，檢測(cè)當(dāng)結(jié)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)誘導(dǎo)最多神經(jīng)發(fā)生的化合物。 圖5:神經(jīng)發(fā)生與血管發(fā)生的關(guān)系。神經(jīng)前體細(xì)胞釋放多種生長(zhǎng)因子如腦源性神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子(BDNF),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，這些因子 刺激必需的血管化作用從而促使神經(jīng)元成熟。(見綜述(Newtonand Duman2004))。
圖6:神經(jīng)干細(xì)胞分化的不同階段示意圖及操控成人祌經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)的標(biāo)識(shí)分子示意圖。
圖7:人的運(yùn)動(dòng)和CBV。圖像最高的圖像是造影前的MRI，用解剖學(xué)界標(biāo)識(shí)別四 個(gè)海馬亞區(qū)的結(jié)構(gòu)范圍(ROI)。中間的圖像表示四個(gè)海馬亞區(qū)的結(jié)構(gòu)范圍(ROIs)。值得 注意的是這些結(jié)構(gòu)范圍不包括亞區(qū)之間的緣帶，這些緣帶不能確切的被MRI顯影。最低 的圖像是CBV圖，由前所述的方法獲得(Small, Chawla等，2004)。曲線圖左上角曲 線圖中表示自我匯報(bào)的運(yùn)動(dòng)程度與齒狀腦回(非其它海馬亞區(qū))CBV的關(guān)系。 圖8:設(shè)計(jì)試驗(yàn)驗(yàn)證僅由于神經(jīng)發(fā)生導(dǎo)致的齒狀腦回CBV改變的原理。 圖9:依賴嚴(yán)格的解剖學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用非損傷性高分辨MRI分析CBV，鑒定小鼠海馬
亞區(qū)。高處(左)組織化學(xué)鑒定海馬區(qū)(右)與左同，包括覆蓋指示特有的被研究的區(qū) 域。底部(左)高處左邊表示的同一區(qū)域的高分辨MRI;(右)與底部左圖同，包括顯 示檢測(cè)了CBV的特有區(qū)域。
圖10:對(duì)比小鼠對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組的海馬亞區(qū)的CBV差別分值。
圖11:齒狀腦回CBV測(cè)量到的差數(shù)(CBV diff)與新生神經(jīng)元(BrdU)數(shù)之間的關(guān)聯(lián)， 沒有校正對(duì)CBV的非神經(jīng)源性影響(左，相關(guān)系數(shù)=0.34; p=0.49)，以及校正對(duì)CBV的 非神經(jīng)源性影響后(右，相關(guān)系數(shù)=0.81; p=0.012)。在進(jìn)行最后一次掃描后，從單個(gè)動(dòng) 物測(cè)定的每一個(gè)點(diǎn)代表齒狀腦回中CBV差別分值和BrDU陽(yáng)性細(xì)胞的總數(shù)。
圖12:在運(yùn)動(dòng)小鼠中觀察到的齒狀腦回CBV的選擇性增加。(a)根據(jù)神經(jīng)發(fā)生(藍(lán) 線)與延遲的新生血管形成(紅線)之間的偶聯(lián)關(guān)系設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)原型。讓小鼠運(yùn)動(dòng)兩周，在 第二周每日注射BrdU(垂直箭頭)。再喂養(yǎng)小鼠四周，隨后進(jìn)行處理以便尸檢。在基線(0 周)以及其后每?jī)芍苡肕RI測(cè)量海馬腦血容量(CBV)。 (b)運(yùn)動(dòng)對(duì)齒狀腦回CBV有選 擇性影響。經(jīng)過為期六周的研究，每個(gè)海馬亞區(qū)的CBV平均相對(duì)值(rCBV)如柱狀圖所示， 其中黑色柱代表運(yùn)動(dòng)組，白色柱代表非運(yùn)動(dòng)組。齒狀腦回是唯一的能顯示顯著的運(yùn)動(dòng)效果 的海馬亞區(qū)，在第4周CBV達(dá)峰值(左上圖)，而內(nèi)嗅皮質(zhì)顯示CBV的非顯著增加。(c) 是個(gè)別實(shí)例，左平面部分表示高分辨MRI切片，可以看見海馬結(jié)構(gòu)的外部形態(tài)和內(nèi)部構(gòu) 造，中間平面圖表示海馬亞區(qū)的分布圖(綠色部分代表內(nèi)嗅皮質(zhì)，紅色部分代表齒狀腦回， 深藍(lán)色代表CA3子域，淺藍(lán)色代表CA1子域)，右平面圖表示海馬CBV圖像(更亮色部 分代表更高的CBV)。
圖13:運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的齒狀腦回CBV增加與神經(jīng)發(fā)生的關(guān)聯(lián)。(a)對(duì)比非運(yùn)動(dòng)組小鼠， 研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組小鼠具有更多的BrdU標(biāo)記物(左柱狀圖)。共聚焦顯微檢査法發(fā)現(xiàn)，新 生細(xì)胞大部分為神經(jīng)核內(nèi)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(紅色標(biāo)記為BrdU標(biāo)識(shí)物，綠色標(biāo)記為神經(jīng)核內(nèi) 蛋白(NeuN)， BrdU/NeuN雙標(biāo)識(shí)物為黃色)。(b)在齒狀腦回CBV和BrdU標(biāo)記物之 間具有顯著的線性關(guān)系(左圖)。二次關(guān)系能更好地適合這些數(shù)據(jù)(右圖)。在每幅圖中的 垂直點(diǎn)線將X軸分開為CBV變化CBV降低(線的左邊)對(duì)比運(yùn)動(dòng)后CBV增加(線的 右邊)。
圖14:觀察到的運(yùn)動(dòng)中的人齒狀腦回的CBV選擇性增加。(a)運(yùn)動(dòng)對(duì)齒狀腦回CBV 有選擇性影響。每個(gè)海馬亞區(qū)的CBV平均相對(duì)值(rCBV)如柱狀圖所示，其中白色柱形代 表運(yùn)動(dòng)前，黑色柱形代表運(yùn)動(dòng)后。如小鼠一樣，齒狀腦回是唯一的能顯示顯著運(yùn)動(dòng)效果的 海馬亞區(qū)，而內(nèi)嗅皮質(zhì)顯示CBV非顯著增加。(b)個(gè)別實(shí)例，左平面圖表示高分辨MRI
切片，使海馬結(jié)構(gòu)的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)可見，中間平面圖表示海馬亞區(qū)的分布圖(綠色 代表內(nèi)嗅皮質(zhì)，紅色代表齒狀回，藍(lán)色代表CA1子域，黃色代表下托)，右平面圖表示海 馬CBV圖像(更亮色部分代表更高的CBV)。
圖15:運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的齒狀腦回CBV增加與有氧適應(yīng)性及認(rèn)知能力關(guān)聯(lián)。(a)最大氧耗 量(V02max)是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的有氧適應(yīng)性的黃金標(biāo)準(zhǔn)量度，其在運(yùn)動(dòng)后增加(左柱形 圖)。在認(rèn)知能力方面，運(yùn)動(dòng)在首次試驗(yàn)學(xué)習(xí)新的陳述性記憶時(shí)有最可靠的影響(右柱形 圖)。(b)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)V02maX的變化與齒狀腦回(DG) CBV變化相關(guān)，但與非其它海馬 亞區(qū)，包括內(nèi)嗅皮質(zhì)(EC)(左散點(diǎn)圖)不相關(guān)，證實(shí)了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的影響具有選擇性。運(yùn)動(dòng) 誘導(dǎo)V02maX的變化與運(yùn)動(dòng)后試驗(yàn)1學(xué)習(xí)相關(guān)，但與非其它認(rèn)知任務(wù)，包括延遲認(rèn)知能力 (中間散點(diǎn)圖)不相關(guān)。運(yùn)動(dòng)后試驗(yàn)1學(xué)習(xí)與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的齒狀腦回CBV的變化(DG CBV) 相關(guān)，但與其他海馬亞區(qū)的變化，包括內(nèi)嗅皮質(zhì)(ECCBV)(右散點(diǎn)圖)不相關(guān)。
發(fā)明詳述
定義
除非另外定義，本發(fā)明所應(yīng)用的每個(gè)名詞術(shù)語(yǔ)將解釋如下。
如這里所應(yīng)用的，"給藥"可以使用任何一種本領(lǐng)域己知成熟技術(shù)的方法和遞藥系統(tǒng) 實(shí)行。給藥可以通過多種途徑，如靜脈注射，腹腔注射，腦脊液給藥，口服，鼻腔給藥， 植入，粘膜給藥，經(jīng)皮給藥，肌內(nèi)注射，及皮下注射。
以下傳遞系統(tǒng)采用多種常規(guī)使用的藥物載體，僅僅是展望許多實(shí)施方案施用本發(fā)明化 合物組分的代表。
注射用藥遞藥系統(tǒng)包括溶液，懸浮液，凝膠劑，微球，和多聚體注射劑，組成的輔料 包括改變?nèi)芙庑缘娜苊?如，乙醇，丙二醇，蔗糖)和聚合物(如聚辛酸內(nèi)酯，聚乳酸/ 乙醇酸共聚物)。植入遞藥系統(tǒng)包括棒型和圓盤型，其中輔料包括聚乳酸/乙醇酸共聚物， 聚辛酸內(nèi)酯。
口服給藥系統(tǒng)包括片劑和膠囊。這些給藥系統(tǒng)包含的輔料包括粘合劑(如羥丙基甲基 纖維素，聚乙烯吡咯垸酮，其它纖維素材料和淀粉)，稀釋劑(如乳糖及其它糖，淀粉， 磷酸氫鈣，纖維素材料)，崩解劑(如淀粉多聚物和纖維素材料)，潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鹽， 滑石粉)。
粘膜給藥系統(tǒng)包括貼劑，片劑，栓劑，陰道栓劑，凝膠劑和乳膏，組成的輔料包括助 溶劑和強(qiáng)化劑(如丙二醇，膽汁酸鹽，氨基酸)和其它輔料(如聚乙二醇，脂肪酸酯及衍
生物，親水聚合物如羥丙基甲基纖維素及透明質(zhì)酸)。
經(jīng)皮給藥系統(tǒng)包括含水凝膠劑，非水凝膠劑，乳膏，復(fù)合型乳劑，微乳劑，脂質(zhì)體， 軟膏劑，含水溶液，非水溶液，洗劑，氣霧劑，碳?xì)浠衔锘|(zhì)，粉劑，組成的輔料包括 助溶劑，滲透促進(jìn)劑(如脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇及氨基酸)，親水聚合物(如聚卡波 非，聚乙烯吡咯烷酮，)。在一種實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體是脂質(zhì)體，透皮增強(qiáng)劑。
可重組的給藥系統(tǒng)使用的溶液，懸浮液，粉劑，包括介質(zhì)如懸浮劑(如樹膠，黃原膠， 纖維素，糖)，潤(rùn)濕劑(如山梨糖醇)，助溶劑(如乙醇，水，聚乙二醇及丙二醇)，表面 活性劑(如月桂基硫酸鈉，司盤，吐溫及十六烷基吡啶)，防腐劑和抗氧化劑(如對(duì)羥基 苯甲酸酯類，維生素E,維生素C,抗壞血酸)，抗結(jié)塊劑，包衣衣料，螯合劑(如乙二胺 四乙酸)。
如這里所應(yīng)用的,"藥物"表示任一種化學(xué)實(shí)體，包括但不限于蛋白質(zhì)，抗體，核酸， 小分子和它的任何組合。 '
如這里所應(yīng)用的,"腦血容量"表示(i)在一定體積腦組織中存在的血容積，或(ii)定 量的值(如lpm3),與一定體積腦組織中存在的血容積相關(guān)，和/或與該體積腦組織的代
謝活性相關(guān)。
如這里所應(yīng)用的，"造影劑"表示，在用于腦部成像時(shí)，可給予對(duì)象的能導(dǎo)致血管內(nèi)增 強(qiáng)的任何物質(zhì)。造影劑的實(shí)例包括用于磁共振成像的順磁性物質(zhì)(如去氧血紅蛋白或禮)。
如這里所應(yīng)用的，"有效預(yù)防量"表示足夠的量，其可抑制與對(duì)象海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā) 生改變相關(guān)的疾病的發(fā)作。
如這里所應(yīng)用的，"對(duì)象"表示任一種動(dòng)物，例如人，非人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物，小鼠，大鼠， 豚鼠或兔子。
如這里所應(yīng)用的，"有效治療量"表示能治療對(duì)象患有與海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生改變相 關(guān)的疾病的足夠的量。 如這里所應(yīng)用的，"治療"是指減緩，抑制或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)程。
發(fā)明具體實(shí)施例
本發(fā)明提供一種方法，用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，其患有海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生減少導(dǎo) 致的疾病，該種方法包含向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康幕衔铮摶衔镆饘?duì)象海馬齒狀腦
回腦血容量增加，其增加量比該化合物引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的增加量的百分比 要高，從而達(dá)到治療的目的。
在一種實(shí)施方案中，受試者是人。在另一種實(shí)施方案中，疾病選自疾病組包括阿爾茨 海默氏病，創(chuàng)傷后心理壓力緊張綜合癥，衰老性記憶力喪失或抑郁癥。在一種實(shí)施方案中， 疾病是衰老性記憶力喪失，對(duì)象年齡高于65歲。在另一種實(shí)施方案中，化合物是一種5-羥色胺選擇性吸收抑制劑。
本發(fā)明提供一種方法，用于抑制哺乳動(dòng)物對(duì)象疾病的發(fā)作，該疾病由海馬齒狀腦回神 經(jīng)發(fā)生減少所導(dǎo)致，該方法包括給對(duì)象施用預(yù)防有效劑量的化合物，該化合物引起對(duì)象海 馬齒狀腦回腦血容量的增加，其增加量比該化合物引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的增加 量的百分比要高，從而達(dá)到抑制疾病發(fā)作的目的。
在一種實(shí)施方案中，對(duì)象是人。在另一種實(shí)施方案中，疾病選自疾病組包括阿爾茨海 默氏病，創(chuàng)傷后心理壓力緊張綜合癥，衰老性記憶力喪失或抑郁癥。在一種實(shí)施方案中， 疾病是衰老性記憶力喪失，對(duì)象年齡高于65歲。在另一種實(shí)施方案中，化合物是一種5-羥色胺選擇性吸收抑制劑。
本發(fā)明還提供一種方法，用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，其患有海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生增加 所導(dǎo)致的疾病，該方法包括給予對(duì)象治療有效量的化合物，該化合物引起對(duì)象海馬齒狀腦 回腦血容量的降低，其降低量比該化合物引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的降低量的百分 比要高，從而達(dá)到治療的目的。在一種實(shí)施方案中，對(duì)象是人。在另一種實(shí)施方案中，疾 病是癲癇。
本發(fā)明還提供一種方法，用于抑制哺乳動(dòng)物對(duì)象的疾病的發(fā)作，該疾病由海馬齒狀腦 回神經(jīng)發(fā)生增加所導(dǎo)致，該方法包括給予對(duì)象治療有效量的化合物，該化合物引起對(duì)象海 馬齒狀腦回腦血容量的減少，其減少量比該化合物引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的減少 量的百分比要高，從而達(dá)到抑制疾病發(fā)作的目的。在一種實(shí)施方案中，對(duì)象是人。在另一 種實(shí)施方案中，疾病是癲癇。
本發(fā)明提供一種方法，用于測(cè)定一種藥物是否增加哺乳動(dòng)物對(duì)象海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā) 生，該方法包括(a)測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回一定體積組織的腦血容量，和對(duì)象海馬CA1 區(qū)一定體積組織的腦血容量；(b)給對(duì)象施用該藥物，施用的方式應(yīng)允許其進(jìn)入對(duì)象的海 馬齒狀腦回和海馬CA1區(qū)；(c)通過使用已知有促進(jìn)該增加作用的藥物，在足以在對(duì)象的 海馬齒狀腦回產(chǎn)生可檢測(cè)的神經(jīng)發(fā)生增加的一個(gè)時(shí)間段后，測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回該體積 組織內(nèi)腦血容量以及對(duì)象海馬CA1區(qū)該體積組織內(nèi)腦血容量；(d)對(duì)比步驟(a)和步驟 (c)檢測(cè)的腦血容量，從而確定在對(duì)象海馬齒狀腦回是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生特有的腦血容量增 加，該增加表明該藥物增加了對(duì)象海馬齒狀腦的回神經(jīng)發(fā)生。在一種實(shí)施方案中，使用磁
共振成象檢測(cè)腦血容量。在另一種實(shí)施方案中，測(cè)定關(guān)于一定體積(等于或少于lmm3) 組織的腦血容量，測(cè)定腦血容量包括步驟(a)獲得體內(nèi)該體積組織的最初影像；(b) 給予該體積組織造影劑；(c)獲得體內(nèi)該體積組織的第二次影像，其中二次影像是在給予 造影劑后至少四分鐘獲得；(d)根據(jù)最初影像和第二次影像測(cè)定該體積組織的腦血容量。 在一種實(shí)施方案中，造影劑包含釓。
在另一種實(shí)施方案中，測(cè)定一定體積組織腦血容量，其方法包含以下步驟(a)獲得 體內(nèi)該體積組織的最初磁共振成像圖；(b)給對(duì)象腹腔內(nèi)施用含釓造影劑，其施用量高于 lmg/千克體重但低于20mg/千克體重；(c)獲得體內(nèi)該體積組織的第二次磁共振成像圖，
第二次成像在服用造影劑后至少15分鐘獲得，但不得多于兩小時(shí)；(d)根據(jù)最初成像圖
及第二次成像圖測(cè)定腦血容量數(shù)值。在一種實(shí)施方案中，造影劑為軋噴替酸(gadolinium pentate)。在另一種實(shí)施方案中，對(duì)象是小鼠或大鼠。還在另一種實(shí)施方案中，藥物是一 種5-羥色胺選擇性吸收抑制劑。
本發(fā)明還提供一種方法，用于測(cè)定一種藥物是否減少哺乳動(dòng)物對(duì)象海馬齒狀腦回的神 經(jīng)發(fā)生，該方法包括(a)測(cè)定受試者海馬齒狀腦回一定體積組織的腦血容量，和對(duì)象海馬 CA1區(qū)一定體積組織的腦血容量；(b)給對(duì)象施用藥物，其給藥方式應(yīng)允許該藥物進(jìn)入對(duì) 象海馬齒狀腦回和海馬CA1區(qū)；(c)通過使用已知有減少作用的藥物，在足以在對(duì)象海馬 齒狀腦回產(chǎn)生可檢測(cè)的神經(jīng)發(fā)生的一個(gè)時(shí)間段后，測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回該體積組織的腦 血容量和對(duì)象海馬CA1區(qū)該體積組織的腦血容量；(d)對(duì)比步驟(a)和步驟(c)檢測(cè)的腦血容 量，從而確定對(duì)象海馬齒狀腦回是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生特有的腦血容量減少，該減少表明藥物 降低了對(duì)象海馬齒狀腦回的神經(jīng)發(fā)生。在一種實(shí)施方案中，測(cè)定腦血容量可用磁共振成像 檢測(cè)。
在另一種實(shí)施方案中，測(cè)定關(guān)于一定體積(等于或少于lmm3)的組織腦血容量，測(cè) 定腦血容量包括步驟(a)獲得體內(nèi)該體積組織的最初影像；(b)給該體積組織施用造 影劑；(c)獲得體內(nèi)該體積組織的第二次影像，其中第二次影像是在服用造影劑后至少四 分鐘后獲得；(d)根據(jù)最初影像和第二影像測(cè)定該體積組織腦血容量。在一種實(shí)施方案中， 造影劑包含釓。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定一定體積組織的腦血容量，測(cè)定方法包含有以下步驟(a) 獲得體內(nèi)該體積組織的最初磁共振成像圖；(b)給對(duì)象腹腔內(nèi)施用含軋?jiān)煊皠?，其施用?高于lmg/千克體重但低于20mg/千克體重；(c)獲得體內(nèi)該體積組織的二次磁共振成像 圖，第二次成像在服用造影劑后至少15分鐘獲得，但不得多于兩小時(shí)；(d)依據(jù)初次成 像及二次成像圖測(cè)定腦血容量數(shù)值。在一種實(shí)施方案中，造影劑是指釓噴替酸(gadolinium pentate)。在另一種實(shí)施方案中，對(duì)象是小鼠或大鼠。
實(shí)施方案補(bǔ)充
以下實(shí)施方案涉及前面所述的以釓為基礎(chǔ)的MRI方法。
此外在一種實(shí)施方案中，含釓造影劑的施用量為約10mg/千克體重。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，第二次磁共振成像圖是在施用含釓造影劑45分鐘后獲得。
本發(fā)明還提供上面描述的方法，該方法還包括給對(duì)象腹腔注射生理鹽水，然后進(jìn)行(c) 步驟或(d)步驟。
在一種實(shí)施方案中，對(duì)象是小鼠，且施用至少4ml生理鹽水。在另一種實(shí)施方案中， 對(duì)象是小鼠，且施用約5ml生理鹽水。在另一種實(shí)施方案中，對(duì)象還可以是人類神經(jīng)疾 病的動(dòng)物模型。
本發(fā)明提供一種方法，用于測(cè)定預(yù)定時(shí)期內(nèi)哺乳動(dòng)物對(duì)象一定體積腦組織中血量的變 化，包括在預(yù)定時(shí)期內(nèi)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腦血容量測(cè)定，比較測(cè)得的腦血容量，從而測(cè)得 預(yù)定時(shí)期內(nèi)腦血容量的變化，其中在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)腦血容量的方法是根據(jù)以上所述 的方法進(jìn)行，條件是在預(yù)定時(shí)期內(nèi)每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(除最后的時(shí)間外)，給對(duì)象施用生理鹽 水，然后進(jìn)行(c)步驟或(d)步驟。
在一種實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)期是指一個(gè)月或更長(zhǎng)。在另一種實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)期是 指六個(gè)月或更長(zhǎng)。還在另一種實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)期是指一年或更長(zhǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，預(yù)定時(shí)期是指兩年或更長(zhǎng)。
在一種實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)期內(nèi)的多數(shù)時(shí)間點(diǎn)為3次或更多。在另一種實(shí)施方案中， 預(yù)定時(shí)期內(nèi)的多數(shù)時(shí)間點(diǎn)為5次或更多。
還在另一種實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)期內(nèi)的多數(shù)時(shí)間點(diǎn)為IO次或更多。在進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，預(yù)定時(shí)期內(nèi)的多數(shù)時(shí)間點(diǎn)為20次或更多。
本發(fā)明在以下實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)部分進(jìn)行舉例說明。本部分闡明是為了幫助更好的理解本發(fā) 明，而不能被解釋為以任一種方式限定本發(fā)明，因?yàn)榇撕蟮臋?quán)利要求書將會(huì)作說明。
實(shí)驗(yàn)詳述I
背景及意義
齒狀腦回是獨(dú)特的腦部區(qū)域，它在整個(gè)生命過程中維持著神經(jīng)發(fā)生能力。由于齒狀腦
回涉及認(rèn)知功能，因而刺激神經(jīng)發(fā)生的能力可被利用作為預(yù)防由于缺乏睡眠而導(dǎo)致的認(rèn)知 能力下降的途徑。對(duì)嚙齒類的研究表明，體育鍛煉是對(duì)齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生的有效刺激。目 前，記錄神經(jīng)發(fā)生需要處死動(dòng)物，并對(duì)腦組織切片進(jìn)行尸檢分析。此種要求對(duì)人類是明顯 禁止的，這就解釋了為何對(duì)體育鍛煉是否刺激人類齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生仍是未知。為要突破 這種限制，最近根據(jù)神經(jīng)發(fā)生和血管發(fā)生之間的緊密空間及時(shí)空耦合，人們發(fā)展出了一種 MRI方法。血管發(fā)生導(dǎo)致腦血容量(CBV)增加，這是一個(gè)可被MRI檢測(cè)的參數(shù)，即使 在齒狀腦回的細(xì)小空間也可檢測(cè)。， 初步研究
作為大范圍的流行病學(xué)研究的一部分，對(duì)66名受試者進(jìn)行體育鍛煉問巻調(diào)查，對(duì)以 下問題"在上個(gè)月你是否曾經(jīng)外出散步？"和"在上個(gè)月你是否為了身體素質(zhì)而進(jìn)行體育 鍛煉？"回答"是"或"否"。每個(gè)肯定的回答得到+1分，受試者總得分范圍是0-2。所有受 試者接受MRI診斷記錄成像，用于評(píng)價(jià)四個(gè)海馬亞區(qū)的CBV，其中四個(gè)海馬亞區(qū)是內(nèi)嗅 皮質(zhì)，齒狀腦回，CA1區(qū)，和下托(如圖l所示)。相關(guān)分析表明，只有齒狀腦回檢測(cè)的 CBV與自我報(bào)告的體育鍛煉有關(guān)(如圖l所示)。
盡管研究結(jié)果支持了體育鍛煉與齒狀腦回CBV之間的關(guān)系，但是該研究仍有許多明 顯的限制。首先，研究問題的范圍受到限制。其次，問巻大體上伴隨有許多由自我報(bào)告產(chǎn) 生的主觀不準(zhǔn)確性。第三，在單一時(shí)間點(diǎn)測(cè)量CBV，這存在有許多其它因素，這些因素 與自我報(bào)告的體育鍛煉可能有相關(guān)協(xié)變，因此它不能推斷運(yùn)動(dòng)本身能解釋說明齒狀腦回 CBV。這些關(guān)切可以通過一個(gè)月內(nèi)實(shí)際定量運(yùn)動(dòng)的數(shù)量，并通過尋找CBV在運(yùn)動(dòng)前后的 變化差異而得到很好的論述。 研究方法及設(shè)計(jì) 受試者
20位受試者，年齡在20-45歲，從哥倫比亞大學(xué)/紐約長(zhǎng)老會(huì)醫(yī)院校區(qū)募集。受試者 都習(xí)慣坐著并習(xí)慣不運(yùn)動(dòng)，且具備低于美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)標(biāo)準(zhǔn)的平均適合度(男性 V02max<43，女性V02max <37)。所有受試者均為非吸煙者。受試者通過在哥倫比亞-長(zhǎng) 老會(huì)醫(yī)療中心張貼傳單募集。通過電話挑選合格者后,受試者在腳踏車測(cè)力計(jì)上進(jìn)行增加 式鍛煉的測(cè)試。 試驗(yàn)組
第l組強(qiáng)度適中的鍛煉受試者允許從一系列有氧運(yùn)動(dòng)中選擇鍛煉方式，如固定的
測(cè)力計(jì)騎車，在跑步機(jī)上跑步，在扶梯式健身器材上攀登或使用一種橢圓訓(xùn)練機(jī)。
根據(jù)受試者的最適合評(píng)定選擇運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目。典型的，受試者在心率相當(dāng)于在V02max 測(cè)試中測(cè)得的最大心率的55-65%時(shí)，開始他們的初始鍛煉。受試者在此強(qiáng)度下鍛煉兩周， 然后在最大心率的65%時(shí)在12周訓(xùn)練計(jì)劃的余下的時(shí)間保持此鍛煉強(qiáng)度。該中等強(qiáng)度的 訓(xùn)練誘導(dǎo)V02max增加將近8-10% 。
第2組高強(qiáng)度訓(xùn)練受試者允許從一系列有氧運(yùn)動(dòng)中選擇鍛煉方式，在12周項(xiàng)目 的第1周和第2周，在最大心率的55-65%時(shí)開始他們的初始鍛煉。在第3周和第4周時(shí) 運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加到最大心率的65-75% 。在5-12周運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加到最大心率的75%。此高 強(qiáng)度的訓(xùn)練誘導(dǎo)V02max增加將近15% 。
兩組訓(xùn)練都是12周。每一個(gè)受試者得到一個(gè)訓(xùn)練機(jī)，以確保在適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度水平進(jìn)行 該鍛煉。對(duì)訓(xùn)練計(jì)劃的堅(jiān)持度通過每周記錄鍛煉情況，并數(shù)字化記錄在裝置的出勤日志上， 及在每個(gè)運(yùn)動(dòng)期間從心率檢測(cè)儀上記錄數(shù)據(jù)。研究者每周聯(lián)系受試者，監(jiān)測(cè)他們的進(jìn)展。
運(yùn)動(dòng)計(jì)劃完成后，受試者返回做隨訪V02max和RRV測(cè)試。采集數(shù)據(jù)的研究者對(duì)運(yùn) 動(dòng)組的分配情況不了解。兩個(gè)條件下的所有運(yùn)動(dòng)時(shí)段都有包括10-15分鐘熱身時(shí)間和平靜 下來的時(shí)間，及30-40分鐘劇烈運(yùn)動(dòng)。每周有4天進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目在哥倫比亞醫(yī)學(xué)院 校園的Plusone Fitness中心進(jìn)行。在以往的研究中與Plusone Fitness的員工有著極好的合 作。
為了確保質(zhì)量控制和堅(jiān)持度，受試者在每個(gè)運(yùn)動(dòng)時(shí)段要完成他們活動(dòng)的詳細(xì)記錄。這 些記錄包含的信息有日期，運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間和每個(gè)運(yùn)動(dòng)時(shí)段的活動(dòng)。在所有的運(yùn)動(dòng)時(shí)段，受 試者都佩戴極化心率檢測(cè)儀記錄整個(gè)時(shí)段的心率。每個(gè)時(shí)段結(jié)束后下載這些數(shù)據(jù)，并以一 周為基礎(chǔ)進(jìn)行評(píng)價(jià)。這將有助于受試者堅(jiān)持運(yùn)動(dòng)，并提供精確的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度水平記錄。 心血管指標(biāo)
有氧代謝能力最大吸氧量(V02max)，通過在Ergoline 800s電子制動(dòng)循環(huán)測(cè)力計(jì) (SensorMedicsCorp.,Anaheim，CA)進(jìn)行分等級(jí)的運(yùn)動(dòng)測(cè)試而測(cè)得。每個(gè)受試者開始在30 瓦(W)運(yùn)動(dòng)2分鐘，然后功率持續(xù)每2分鐘提高30W直到達(dá)到V02max標(biāo)準(zhǔn)(RQ等 于或大于l.l，換氣量增加而V02不隨之增加，達(dá)到年齡預(yù)告的最大心率或意志力疲勞)。 通過使用連接FLO-l體積傳感器模塊(PHYSIO-DYNE Instrument Corp.，Quogue，NY)的 呼吸調(diào)速器測(cè)量每分鐘換氣量。使用連接有計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(MAX-l，PHYSIO-DYNE InstrumentCorp.,Quogue，NY)的順磁性氧氣(02)和紅外二氧化碳(C02)分析儀測(cè)量呼 出的氧氣和二氧化碳百分比。這些分析儀經(jīng)已知的醫(yī)用級(jí)別氣體校正。在等級(jí)訓(xùn)練測(cè)試中 得到的最高V02的值可認(rèn)為是V02maX。在訓(xùn)練節(jié)目結(jié)束時(shí)進(jìn)行相同的測(cè)試程序以測(cè)定V02max的變化。
心臟自主調(diào)節(jié)功能在10分鐘靜止期間持續(xù)測(cè)量并記錄坐姿及仰躺時(shí)的心電圖
(ECG)，血壓，和呼吸。心電圖電極安放在右肩，左腋前線與第IO肋間交點(diǎn)處和右下腹 部處。模擬的心電圖信號(hào)在500Hz通過國(guó)產(chǎn)儀器16位A/D轉(zhuǎn)換板數(shù)字化并傳送到微型計(jì) 算機(jī)。心電圖波形傳送到定制的檢測(cè)軟件實(shí)現(xiàn)R-波常規(guī)檢測(cè)，得到R-R間期序列。在標(biāo) 記R-波形時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)誤可被交互的校正。
計(jì)算仰躺10分鐘及坐姿10分鐘靜止期間的平均RRI值和以下RRV指標(biāo)RR間期 的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SDRR)，均方根繼差(rMSSD)，位于低頻帶(0.04-0.15Hz (LF))及高頻 帶(0.15-0.50(HF))的光譜功率。使用一種類似于由DeBoer， Kar咖aker，和Strackee(deBoer， 1984)描述的區(qū)間方法，計(jì)算300秒時(shí)間段的系列波譜，進(jìn)行傅立葉變換。計(jì)算傅立葉變 換前，先從系列的每個(gè)值中減去RR間期系列平均值，然后加漢寧窗濾過篩選RR間期系 列，并計(jì)算超過LF低頻和HF高頻帶的光譜功率即方差(平方毫秒)總和。對(duì)光譜功率 估算值進(jìn)行校正，解釋濾過產(chǎn)生的衰減。 呼吸
使用呼吸監(jiān)測(cè)儀采集胸式呼吸和腹式呼吸信號(hào)。將信號(hào)傳送至一種專門編寫的呼吸計(jì) 分程序，該程序連續(xù)產(chǎn)生每分鐘呼吸頻率均值。 MRI
所有受試者均接受兩次MRI檢査， 一次是運(yùn)動(dòng)前的基礎(chǔ)檢査，第二次是運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí) 檢査。
MRI產(chǎn)生的CBV影像圖
第IV組服用標(biāo)準(zhǔn)劑量的歐乃影(Omniscan)前獲得第一組影像，服用標(biāo)準(zhǔn)劑量 (0.1mmol/kg)的歐乃影(Omniscan) 4分鐘后獲得第二組影像，共獲得兩組3DT1加權(quán) 斜冠狀位成像(脈沖重復(fù)間隔時(shí)間(TR) =20ms;回波時(shí)間(TE) =6ms;翻轉(zhuǎn)角=25度； 平面分辨率-0.86mmx0.86mm;層厚4mm)。由Tl-加權(quán)檢査矢狀位系列，辨別定向垂直 于海馬長(zhǎng)軸的切片。為了不使相位偏移，要求受試者在兩次影像采集之間小心不要移動(dòng)。 獲得的影像交給Dr.Small的實(shí)驗(yàn)室，通過使用影像顯示和分析軟件包(MEDx Sensor Systems)在雙處理器(2.4GHz Xeon) linux (RedHat7.3)工作站進(jìn)行運(yùn)算。由不了解受 試者分組情況的研究者完成所有影像處理。用AIR程序配準(zhǔn)這些影像。運(yùn)行時(shí)短的采集 時(shí)間可增加運(yùn)算法則擬合優(yōu)度。使用兩種方法評(píng)價(jià)運(yùn)行校正的擬合優(yōu)度，并作為接受或拒 絕各個(gè)研究的標(biāo)準(zhǔn)首先，校正后由Gnu plot進(jìn)行作圖。如果在掃描時(shí)間里在空間里任
何方向有高于1像素尺寸的位移，則可以否決該研究。其次，兩個(gè)運(yùn)動(dòng)校正的圖像互減。 如果在剩余的圖像中檢測(cè)出大的信號(hào)，可以否決該研究。完成的初步研究中僅有一個(gè)研究 因?yàn)椴环线@些擬合優(yōu)度標(biāo)準(zhǔn)而被否決。
造影后圖像減去造影前圖像，記錄矢狀竇的差異。然后根據(jù)矢狀竇的差異劃分減去的 圖像，圖像乘以100得到絕對(duì)的CBV圖。 辨別齒狀腦回和其他海馬亞區(qū)
在斜冠狀位影像系列中，始終發(fā)現(xiàn)在外側(cè)膝狀核前部及鉤后方的切片提供海馬形態(tài)和 內(nèi)部結(jié)構(gòu)的最佳顯影。這種切片是所有研究的標(biāo)準(zhǔn)切片。如圖1所示，繪制了海馬的外部 形態(tài)，沿著海馬溝和內(nèi)部白質(zhì)束進(jìn)行單次的內(nèi)部形態(tài)繪制。然后根據(jù)以下解剖學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，鑒 別四個(gè)海馬結(jié)構(gòu)亞區(qū)的結(jié)構(gòu)范圍(ROIS): a)內(nèi)嗅皮質(zhì)一側(cè)下邊緣沿著同側(cè)腦溝；內(nèi)緣 是顳葉的內(nèi)側(cè)面；上緣是海馬溝和下托和內(nèi)嗅皮質(zhì)之間的灰/白區(qū)分，b)下托—內(nèi)緣是海 馬溝內(nèi)側(cè)范圍，和/或海馬水平內(nèi)曲；下緣是下側(cè)海馬旁回白質(zhì)；上緣是海馬溝側(cè)邊緣 是處在內(nèi)向海馬垂直內(nèi)曲幾個(gè)像點(diǎn)，c)CAl亞區(qū)一內(nèi)緣是處在側(cè)向下托結(jié)構(gòu)范圍外側(cè)2-3 像點(diǎn)，大約是在海馬垂直內(nèi)曲的開始位置，是海馬溝/白質(zhì)束的外延；下緣是下側(cè)海馬旁 回白質(zhì)；上緣是海馬結(jié)構(gòu)頂部，d)齒狀腦回一內(nèi)緣是顳葉內(nèi)側(cè)范圍；下/外側(cè)緣是海馬溝 /白質(zhì)束；上緣是海馬結(jié)構(gòu)頂部，在此通常能識(shí)別海馬槽。可用標(biāo)準(zhǔn)圖譜辨別這些解剖結(jié) 構(gòu)的標(biāo)志。 數(shù)據(jù)分析
記錄一系列參數(shù)，許多這些參數(shù)可用作運(yùn)動(dòng)中個(gè)體差異的指標(biāo)。為了統(tǒng)計(jì)的簡(jiǎn)約，首 先使用V02max，因?yàn)樗徽J(rèn)為是該領(lǐng)域的'黃金標(biāo)準(zhǔn)，之一。從首次測(cè)量的每個(gè)海馬亞區(qū) CBV減去最后測(cè)量的每個(gè)海馬亞區(qū)CBV，推導(dǎo)出'CBV差異分值'。由于所有海馬亞區(qū)互 相連接作為整體生理回路的一部分，因此進(jìn)行了多元分步線性回歸分析，其中V02max 作為從屬因變量，四個(gè)CBV差值(來自每個(gè)海馬亞區(qū))作為獨(dú)立因變量。根據(jù)需求，在 此模型中也包含人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量。盡管一些亞區(qū)可能已顯示出與訓(xùn)練有關(guān)的CBV增加， 但是齒狀腦回CBV的增加可能與運(yùn)動(dòng)指標(biāo)有最大相關(guān)。同時(shí)也探討一系列其它參數(shù)，作 為鍛煉中個(gè)體差異的指標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)詳述II:對(duì)活人齒狀腦回中的神經(jīng)發(fā)生造影
背景及意義
不同于以往的科學(xué)定理，現(xiàn)在有明顯的證據(jù)證明在整個(gè)生命過程中在選擇的腦部區(qū)
域，最顯著的是齒狀腦回(海馬回路的主要亞區(qū))中， 一直存在神經(jīng)發(fā)生。而且，已鑒明 了能可靠地誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的操作，如運(yùn)動(dòng)或5-羥色胺再攝取抑制劑。接下來重要的步驟 是測(cè)定神經(jīng)發(fā)生是否影響認(rèn)知能力及怎樣影響。目前，神經(jīng)發(fā)生僅能在尸體解剖組織器官 中檢測(cè)到，由此神經(jīng)發(fā)生與認(rèn)知能力之間的相關(guān)性研究也僅能在非人類動(dòng)物上進(jìn)行。本課 題的目的是研發(fā)出一種成像技術(shù)，其能檢測(cè)甚至定量活人齒狀腦回中的神經(jīng)發(fā)生。
在所有影像技術(shù)中，包括CT，PET,SPECT,MRI，僅有MRI (磁共振成像)有足夠的 空間分辨率對(duì)齒狀腦回進(jìn)行顯影。依賴細(xì)胞內(nèi)造影劑對(duì)新生神經(jīng)元標(biāo)記顯影的MRI技術(shù) 正在開發(fā)中。盡管適用于動(dòng)物模型，但依賴細(xì)胞內(nèi)造影劑需要侵入性給藥并可能擾亂神經(jīng) 元功能，因此并非用于檢測(cè)活人神經(jīng)發(fā)生的選擇。
神經(jīng)發(fā)生與血管發(fā)生密切相關(guān)，因此誘導(dǎo)齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生會(huì)增加局部腦血容量 (CBV)。有研究顯示，MRI可用于檢測(cè)和定量人類，猴子，小鼠的齒狀腦回CBV變化， 且可完全安全地進(jìn)行。因此本研究課題的主要目的是確定MRI測(cè)量的CBV變化是否可以 檢測(cè)神經(jīng)發(fā)生。
CBV并非選擇性地與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)，且存在不依賴于神經(jīng)發(fā)生的其他因素如心輸出 量和突觸活動(dòng)也會(huì)影響局部CBV。因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)被認(rèn)為也能調(diào)節(jié)這些其他的因素，所以仍存 在一個(gè)問題，即我們?nèi)绾未_信檢測(cè)的CBV變化能反映神經(jīng)發(fā)生。答案在于CBV改變的 時(shí)空分布如圖2上平面所示，影響CBV的非神經(jīng)發(fā)生因素較早達(dá)到峰值，并在運(yùn)動(dòng)結(jié) 束時(shí)迅速消失，相反，神經(jīng)發(fā)生對(duì)CBV的影響較遲達(dá)到峰值，且保持較長(zhǎng)時(shí)間的增高。
此外，非神經(jīng)發(fā)生因素可望在齒狀腦回以及在海馬結(jié)構(gòu)的其他亞區(qū)如內(nèi)嗅皮質(zhì)，CA3 和CA1子域，及下托出現(xiàn)。因此，如圖2中平面所示，齒狀腦回CBV曲線既反映非神經(jīng) 發(fā)生因素也反映神經(jīng)發(fā)生因素，而其他海馬亞區(qū)CBV曲線僅反映神經(jīng)發(fā)生因素。通過從 前一個(gè)CBV曲線減去后一個(gè)CBV曲線，可望得到一個(gè)僅反映神經(jīng)發(fā)生的CBV曲線，如 圖2下平面所示。 神經(jīng)發(fā)生可用MRI無(wú)損傷地成像
如圖3所示，對(duì)四組小鼠進(jìn)行成像。在0時(shí)給所有小鼠注射BRDU，并進(jìn)行初始MRI 作為基線。每一組接受四種實(shí)驗(yàn)方案的一種服藥并運(yùn)動(dòng)，服藥并假裝運(yùn)動(dòng)，服安慰劑并 運(yùn)動(dòng)，服安慰劑并假裝運(yùn)動(dòng)量。制作齒狀腦回以及其他海馬亞區(qū)如CA3和CA子域，下 托，及內(nèi)嗅皮質(zhì)的CBV曲線。從齒狀腦回CBV曲線減去其他海馬亞區(qū)的CBV平均曲線。 測(cè)試系列不同的化合物，檢測(cè)當(dāng)聯(lián)合運(yùn)動(dòng)時(shí)哪種化合物導(dǎo)致最大的神經(jīng)發(fā)生
按照以上討論的相同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)四組小鼠成像。使用MANOVA模型對(duì)四組所得的結(jié) 果進(jìn)行比較，確定哪種化合物導(dǎo)致最大的神經(jīng)發(fā)生。 測(cè)試誘導(dǎo)健康人產(chǎn)生最大神經(jīng)發(fā)生的藥物
以40位健康人作為受試者，重復(fù)進(jìn)行同上設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)分組和實(shí)驗(yàn)方案(每組10位受 試者)。
實(shí)驗(yàn)詳述III
概要
齒狀腦回是獨(dú)特的腦區(qū)，在生命期內(nèi)保持著神經(jīng)發(fā)生的能力。促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的藥物， 在應(yīng)用于治療多種疾病，如阿爾茨海默氏病，創(chuàng)傷性腦損傷，進(jìn)展性障礙及中風(fēng)，有很好 的前景。需要用成像技術(shù)安全地顯現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生關(guān)聯(lián)的能力來篩選并確認(rèn)潛在的誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā) 生的藥物。為此目的，需要研究MRI方法以便顯示與齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)。此方法 基于神經(jīng)發(fā)生與血管發(fā)生之間緊密的空間和時(shí)間聯(lián)系。血管發(fā)生導(dǎo)致CBV的增加，而CBV 是一個(gè)參數(shù)，已被成功的用MRI對(duì)人類，猴子及嚙齒動(dòng)物的齒狀腦回成像。初步數(shù)據(jù)顯 示人類和小鼠齒狀腦回CBV與運(yùn)動(dòng)(已知的神經(jīng)發(fā)生行為調(diào)節(jié)因素)是選擇性相關(guān)的。 本課題目的是通過對(duì)大鼠施用誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生藥物后驗(yàn)證MRI的方法。通過對(duì)藥物對(duì)齒狀 腦回及鄰近的沒有神經(jīng)發(fā)生的海馬亞區(qū)的作用系統(tǒng)成像，將提取到一種對(duì)神經(jīng)發(fā)生靈敏、 特定的MRI變化圖象。 一旦對(duì)大鼠驗(yàn)證有效，該MRI方法可轉(zhuǎn)換用于人類，用于篩選， 驗(yàn)證誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的藥物。
最近的科研發(fā)現(xiàn)表明，新腦神經(jīng)元的產(chǎn)生，增殖和生長(zhǎng)的過程可以在人類生命期內(nèi)所 有階段持續(xù)。本研究目的是研究一種測(cè)試方法，用于發(fā)現(xiàn)能刺激該過程的新藥物。這些藥 物將提供一種新的治療策略，用于治療患有神經(jīng)障礙和神經(jīng)疾病的患者，包括中風(fēng)，創(chuàng)傷 性腦損傷，腦腫瘤，進(jìn)展性障礙，阿爾茨海默氏癥。
直到最近，腦部疾病和腦部損傷被認(rèn)為致使神經(jīng)元永久性損失伴隨細(xì)胞不能再生?，F(xiàn) 在有大量研究證據(jù)顯示，在嚙齒動(dòng)物，非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類的成年期，某些腦區(qū)仍保 留有產(chǎn)生新神經(jīng)元的能力。這些研究結(jié)果提出了新的治療方法，即內(nèi)生性神經(jīng)發(fā)生的藥理 誘導(dǎo)。該治療方法與神經(jīng)疾病和神經(jīng)損傷有關(guān)聯(lián)性，包括中風(fēng)/局部缺血，創(chuàng)傷性腦損傷， 腦腫瘤，進(jìn)展性障礙，和阿爾茨海默氏癥。 背景及意義
在過去六年里，神經(jīng)發(fā)生已作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理學(xué)和疾病的基礎(chǔ)過程而出現(xiàn)。Dr Gage和其同事己在人海馬齒狀腦回發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)發(fā)生，并證明神經(jīng)發(fā)生是可調(diào)節(jié)的，同時(shí)
還指出成人海馬的功能性神經(jīng)發(fā)生(Ray, Peterson等，1993;Palmer, Ray等， 1995;Kemperma叫Kuhn等，1997; Eriksson, Perfilieva等，1998; van Praag, Kempermann 等，1999; van Praag， Schinder等，2002)。不同于傳統(tǒng)觀點(diǎn)，這些發(fā)現(xiàn)指出人類一生中都 能夠生成新的神經(jīng)細(xì)胞。這項(xiàng)研究向人們展示了新的治療人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系 統(tǒng)疾病和障礙的可能性。
許多研究已將海馬神經(jīng)發(fā)生與運(yùn)動(dòng)相聯(lián)系。Kempermann等(1998)研究指出，衰老小 鼠能繼續(xù)在齒狀腦回中產(chǎn)生神經(jīng)發(fā)生，并且當(dāng)衰老小鼠生活在有群居相互接觸，探險(xiǎn)和運(yùn) 動(dòng)的豐富環(huán)境中時(shí)能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生(Kempermann, Kuhn等，1998)。雖然隨著年齡增加， 神經(jīng)發(fā)生減弱，但是有研究表明豐富環(huán)境因素帶來的刺激能促進(jìn)神經(jīng)元的存活及分化。隨 后vanPraag等(1999)的研究指出，與其它因素相比，跑步能更有效的促進(jìn)成年小鼠神 經(jīng)元的增殖，存活及分化。其它因素包括水迷宮訓(xùn)練，yoke游泳試驗(yàn)，豐富的環(huán)境和標(biāo) 準(zhǔn)居住。
神經(jīng)元可塑性和自身修復(fù)的活動(dòng)依賴性調(diào)節(jié)是腦損傷物理治療的動(dòng)力因素 (Kempermann and Gage 2000)。在多種損傷和疾病中，由于病人的身體條件不允許，不 能及早開始運(yùn)動(dòng)或根本不能進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。預(yù)測(cè)治療性干預(yù)的功能性療效較復(fù)雜，其依賴大范 圍的因素，包括特定的疾病或損傷，家庭和社會(huì)團(tuán)體資源，及診斷的準(zhǔn)確性。當(dāng)前治療的 輔助手段是在神經(jīng)疾病或損傷的早期階段誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，可以增強(qiáng)療效從而使病人恢復(fù)更 多的功能。
目前，尸體解剖分析是檢測(cè)一種化合物是否誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的唯一方法。但在檢測(cè)人體 內(nèi)化合物是否誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生時(shí)該方法明顯受到限制。因此為了篩選，驗(yàn)證及優(yōu)化潛在的誘 導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的藥物，重要的研究方向是研究體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生標(biāo)識(shí)物。在此目標(biāo)引導(dǎo)下，在過 去幾年里，Dr Scott Small的實(shí)驗(yàn)室研究了不同的對(duì)活體對(duì)象神經(jīng)發(fā)生可視的成像方法。
一種方法是使用MRI敏感的報(bào)告分子(類似于BrdU)，這些分子注射后被整合入新 的分裂細(xì)胞中。雖然原則上這些報(bào)告分子可以進(jìn)行開發(fā)，但是初步的分析提出了許多關(guān)于 該方法的安全性的關(guān)切。首先，這種報(bào)告分子需要穿透兩層天然屏障，既血腦屏障和細(xì)胞 膜。即使第一個(gè)關(guān)切解決了，第二個(gè)關(guān)切是報(bào)告分子需要盡可能的蓄積高濃度，以得到有 利的信/噪比，這可能會(huì)對(duì)神經(jīng)功能產(chǎn)生有害影響。因此，雖然MRI敏感的神經(jīng)發(fā)生報(bào)告 分子可成功應(yīng)用在動(dòng)物模型中，但已有結(jié)論表明這種方法在應(yīng)用于人體時(shí)存在有安全性問 題。盡管如此，這些使神經(jīng)發(fā)生成像的MRI敏感報(bào)告分子仍在繼續(xù)探索。
盡管如此，同時(shí)也對(duì)第二種使神經(jīng)發(fā)生可視化的方法進(jìn)行探索，如果證明是有效的將容易轉(zhuǎn)而應(yīng)用于人體檢測(cè)研究。該方法基于圖5(Palmer, Willhoite et al.2000;Louissaint, Rao etal.2002)總結(jié)的神經(jīng)發(fā)生與血管發(fā)生之間緊密的空間和時(shí)間聯(lián)系。血管發(fā)生導(dǎo)致局部的 CBV相對(duì)增加，而CBV是一種參數(shù)，可以通過MRI測(cè)量得到(Gonzalez, Fischman et a1.1995)。許多研究表明，MRI測(cè)量的CBV可以檢出活體嚙齒動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)生(Lin， Sun etal.2002; Dunn, Roche etal.2003;Dunn， Roche et al.2004;Jiang,Zhang et al.2005)，且實(shí)際 上許多研究表明，MRI檢測(cè)的CBV可以獲得與海馬功能障礙有關(guān)的變化，及與腦損傷整 體測(cè)量有關(guān)的變化。在過去的幾年，已經(jīng)研制出基于MRI的實(shí)驗(yàn)原型，可以安全的檢測(cè) 人類，猴子和小鼠的海馬亞區(qū)的CBV，包括齒狀腦回的CBV (Small,Wuetal.2000; Small, Tsaietal. 2002)。
如在 (Belliveau， Rosen et al.l990;Kuppusamy, Lin et al.1996; van zijl, Eleff et al. 1998;Wu Wong etal.2003)正式討論的，用MRI評(píng)估局部腦血容量(CBV),典型釆取 的方法是改變血管內(nèi)的造影劑濃度。根據(jù)它們的性質(zhì)，造影劑將影響Tl加權(quán)的或影響T2 加權(quán)的信號(hào)強(qiáng)度。通過推注釓，跟蹤12*加權(quán)信號(hào)的隨時(shí)間變化而產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化， Belliveau和同事們提出了第一個(gè)測(cè)量CBV的MRI方法(Belliveau, Rosen et a1.1990)。通 過將信號(hào)幅度對(duì)時(shí)間作圖，第一波造影劑(即造影劑經(jīng)過特定腦區(qū)的首個(gè)最大的流量)的 "曲線下面積"，可以用于計(jì)算局部CBV。由于需要高時(shí)態(tài)分辨率以獲得瞬間首波，動(dòng)態(tài) 易感的MRI造影劑(DSC)通常用平面回聲成像來進(jìn)行。這個(gè)時(shí)空要求降低了空間分辨 率，因而目前DSC不能使單個(gè)海馬亞區(qū)顯現(xiàn)。
Haake, Lin和同事們提出了另一種以釓為基礎(chǔ)的方法，可以高空間分辨地繪制CBV 圖(Kuppusamy， Lin et al.l996;Lin, Paczynski et al.l997;Lin, Celik et aI.1999)。代替用快速 成像追蹤造影劑的首波，從造影劑誘導(dǎo)的穩(wěn)態(tài)Tl加權(quán)變化中產(chǎn)生CBV的測(cè)量。對(duì)比動(dòng) 態(tài)檢測(cè)方法，穩(wěn)態(tài)檢測(cè)法能得到更高空間分辨率的CBV圖。事實(shí)上穩(wěn)態(tài)CBV方法可以 得到所需的亞毫米分辨率，因此能使人類和猴子的單個(gè)海馬亞區(qū)得到顯現(xiàn)(Small, Chawla etal.2004)。
釓與鐵氧化物微粒都被用于嚙齒類動(dòng)物的CBV成像，通常依賴于信號(hào)強(qiáng)度的T2加 權(quán)變化(van Bruggen， Busch et al.l998;Mandeville， Jenkins et al.2001;Dunn, Roche et al.2003;Dunn, Roche et al.2004;Jiang, Zhang et al.2005 )。近來提出了一種以釓為基礎(chǔ)的方法 的變種。主要的新穎之處是釓?fù)ㄟ^腹膜內(nèi)注射引入，而不是通過靜脈注射引入，腹膜內(nèi)注 射引入釓的方法更少的引起損傷，且能提高其能力，即CBV變化能重復(fù)的安全地在同一 動(dòng)物上繪圖。除了這種實(shí)踐上的差異外，理論上此方法幾乎與前面的方法等同。研究發(fā)現(xiàn)
腹膜內(nèi)注射方法產(chǎn)生的CBV評(píng)估，在定量上與靜脈注射釓或鐵氧化物微粒相似。在相關(guān) 的研究中，Jiang等(Jiang, Zhang etal.,2005)依賴對(duì)于釓的T2加權(quán)信號(hào)改變響應(yīng)進(jìn)行了 CBV繪圖(因此與上所引證的方法非常相似)。他們表明，該CBV圖確實(shí)可以測(cè)定由注 射神經(jīng)元祖代細(xì)胞誘導(dǎo)的與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)聯(lián)的血管發(fā)生。
下一部分將綜述初步數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)提出運(yùn)動(dòng)(已證實(shí)的神經(jīng)發(fā)生誘導(dǎo)物)可以解釋 從齒狀腦回選擇性測(cè)量的CBV變化，并表明可以用體外組織學(xué)測(cè)試來鑒定神經(jīng)發(fā)生的化 合物。然而，還缺少關(guān)于通過運(yùn)動(dòng)或使用藥理學(xué)藥物作為神經(jīng)發(fā)生刺激物，由MRI測(cè)量 的CBV直接與體外測(cè)量的神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的系統(tǒng)分析。
本發(fā)明的總體目標(biāo)在于提供進(jìn)一步的證據(jù)，證明MRI測(cè)量的CBV與神經(jīng)發(fā)生有靈敏 的相關(guān)性。盡管作為體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生指示物的其它方法還在研發(fā)中，但是CBV方法的顯著 優(yōu)勢(shì)是它可以便利地轉(zhuǎn)換應(yīng)用于人類。已研發(fā)的繪制嚙齒類動(dòng)物CBV圖的方法與目前應(yīng) 用于人類的方法幾乎是相同的。研究表明此方法可以繪制人海馬的單個(gè)海馬亞區(qū)，包括齒 狀腦回。使用此方法，CBV繪圖是安全的，不僅對(duì)單一時(shí)間點(diǎn)測(cè)量安全，也對(duì)隨時(shí)間推 移進(jìn)行的重復(fù)測(cè)量安全。因此，通過藥物傳遞前和藥物傳遞后成像，可以完成縱向?qū)嶒?yàn)， 而藥物傳遞前后每個(gè)個(gè)體自主控制行動(dòng)，這是評(píng)價(jià)藥物有效性的潛在的有力的方法。 初步研究
鑒別神經(jīng)發(fā)生的化合物
許多實(shí)驗(yàn)室先前的研究已經(jīng)鑒定了成人海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)和調(diào)節(jié)它存活及決定 死亡選擇的因素。這些研究表明外源性因素可以調(diào)節(jié)體外神經(jīng)發(fā)生的過程。神經(jīng)干細(xì)胞分 化的各階段和支配每個(gè)階段的因素在圖6中進(jìn)行了總結(jié)。
人工培育的rNSCs已由Gage等培養(yǎng)出來，基于他們的繁殖能力作為腦神經(jīng)發(fā)生體外 模型，同時(shí)維持干細(xì)胞特性(Palmer,RayetaU995)。這些特性包括，自我更新并分化為 所有的神經(jīng)細(xì)胞譜系的能力，神經(jīng)譜系包括神經(jīng)元，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，和星形膠質(zhì)細(xì) 胞。通過體內(nèi)移植人工培育的rNSCs確證了體外結(jié)果，并證實(shí)他們?nèi)员Ａ羲械纳窠?jīng)發(fā) 生特性(Ray, Peterson et al.1993; Song, Stevens et al.2002; van Praag, Schinder et al.2002; Hsieh， Aimone et al.2004)。
BrainCells公司的研究焦點(diǎn)是發(fā)展新的基于神經(jīng)發(fā)生治療學(xué)，以Dr.Gage (公司的一 位共同創(chuàng)立者)研發(fā)的授權(quán)技術(shù)為基礎(chǔ)。這些技術(shù)和工具為神經(jīng)發(fā)生平臺(tái)構(gòu)成基礎(chǔ)，使能 夠掃描，并選擇候選藥物來提高內(nèi)生性神經(jīng)發(fā)生，從而治療CNS障礙。
CBV和神經(jīng)發(fā)生 人類的CBV和運(yùn)動(dòng)的關(guān)系
作為大范圍的流行病學(xué)研究的一部分，66名受試者接受了運(yùn)動(dòng)調(diào)查問巻，對(duì)以下問
題回答"是"或"否""在上個(gè)月你是否曾經(jīng)外出散步？"和"在上個(gè)月你是否為了身體素
質(zhì)而進(jìn)行體育鍛煉？"肯定的回答得到+l分，受試者總得分范圍是0-2。所有受試者都接 受從四個(gè)海馬亞區(qū)估測(cè)CBV的MRI試驗(yàn)原型成像，這四個(gè)海馬亞區(qū)是內(nèi)嗅皮質(zhì)，齒狀腦 回，CA1區(qū)，下托(如圖7所示)。該試驗(yàn)原型是首先由Lin和Haacke發(fā)明的對(duì)TI加權(quán) 技術(shù)的改良(Lin, Paczynski et aU997; Lin, Celik et a1.1999)。由靜脈注射釓，再根據(jù)Tl 加權(quán)信號(hào)的穩(wěn)態(tài)變化估測(cè)CBV。對(duì)該技術(shù)的改良主要是優(yōu)化海馬亞區(qū)的可視化技術(shù)。該 方法己被應(yīng)用于非人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物的成像(Small, Chawlaeta1.2004)。
一種相關(guān)分析表明，在對(duì)海馬亞區(qū)的檢測(cè)中，只有齒狀腦回檢測(cè)的CBV與自我報(bào)告 的運(yùn)動(dòng)鍛煉相關(guān)(如圖7所示)。盡管這些結(jié)果支持運(yùn)動(dòng)與齒狀腦回CBV的關(guān)聯(lián)，但是 該研究仍有許多明顯的限制。首先，問題受限于其范圍和不準(zhǔn)確性。其次，問巻大體上伴 隨有許多由自我報(bào)告產(chǎn)生的主觀不準(zhǔn)確性。第三，在單一時(shí)間點(diǎn)測(cè)量CBV，存在有許多 其它因素，這些因素與自我報(bào)告的體育鍛煉可能有相關(guān)協(xié)變，因此它不能推斷運(yùn)動(dòng)本身能 解釋說明齒狀腦回CBV。這些關(guān)切可以通過一個(gè)月內(nèi)實(shí)際定量運(yùn)動(dòng)的數(shù)量，并通過尋找 CBV在運(yùn)動(dòng)前后的變化差異而得到很好的解決。激勵(lì)小鼠實(shí)驗(yàn)的目的將在下節(jié)進(jìn)行描述。 小鼠局部CBV和祌經(jīng)發(fā)生的關(guān)聯(lián)性
-在初步研究中，已經(jīng)對(duì)測(cè)量的個(gè)別海馬亞區(qū)CBV變化(由MRI體內(nèi)測(cè)量)和小鼠神 經(jīng)發(fā)生(組織學(xué)體外檢測(cè))間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性在圖8中圖解闡明。
如前所述，由于神經(jīng)發(fā)生與血管發(fā)生相關(guān)聯(lián)，而血管發(fā)生與CBV相關(guān)聯(lián)，可以設(shè)想 CBV可成為神經(jīng)發(fā)生的靈敏標(biāo)識(shí)。然而，由于CBV受其它非神經(jīng)發(fā)生因素影響，因此不 能假定直接測(cè)量的齒狀腦回CBV變化可以作為神經(jīng)發(fā)生的特有性質(zhì)。
己在一組初步的實(shí)驗(yàn)中研究賦予CBV測(cè)量特異性的方法。神經(jīng)發(fā)生的誘導(dǎo)物(如運(yùn) 動(dòng))將通過神經(jīng)發(fā)生和非神經(jīng)發(fā)生機(jī)制影響齒狀腦回的CBV。因此，如果研究者打算測(cè) 量運(yùn)動(dòng)前后的CBV變化，觀察到的變化將是由神經(jīng)發(fā)生和非神經(jīng)發(fā)生因素共同影響的結(jié) 果。因此，要解決的問題是如何從觀察到的CBV提取僅僅由神經(jīng)發(fā)生作出的貢獻(xiàn)。
初步研究已對(duì)以下設(shè)想進(jìn)行驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)對(duì)CBV的非神經(jīng)性影響顯示在沒有祌經(jīng)發(fā)生 能力的鄰近的海馬亞區(qū)。如果該設(shè)想是正確的，即，對(duì)其它區(qū)和對(duì)齒狀腦回的非神經(jīng)發(fā)生 影響是相等的，則可以從觀察到的CBV減去這些影響，以評(píng)估在齒狀腦回中僅由神經(jīng)發(fā)
生引起的CBV影響。
很明顯，這種設(shè)想可能是不正確的，而且，它不能預(yù)示，多個(gè)海馬亞區(qū)的哪一個(gè)在該 方法中是最有效的。因此，為了驗(yàn)證這個(gè)設(shè)想，設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，使用T2加權(quán)方法測(cè)量多 個(gè)海馬亞區(qū)的CBV(圖9) (Moreno, Huaetal. 2005)(作為附錄附上)；并使用多重線性回 歸分析(MLRA)測(cè)定哪個(gè)區(qū)得到最好的結(jié)果。
同時(shí)對(duì)測(cè)試組和對(duì)照組測(cè)量最初的CBV。測(cè)試組接受一個(gè)月的運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)后，重復(fù)測(cè) 定兩個(gè)組的CBV。此時(shí)，處死所有小鼠，使用BrdU標(biāo)記量化海馬神經(jīng)發(fā)生。
從運(yùn)動(dòng)一個(gè)月或未運(yùn)動(dòng)一個(gè)月后測(cè)量的局部CBV中減去開始時(shí)局部CBV測(cè)量值， 得到CBV差值。圖IO顯示了部分結(jié)果。在顯示的三個(gè)海馬亞區(qū)中，值得注意的是運(yùn)動(dòng) 的小鼠比起那些沒有運(yùn)動(dòng)的小鼠，CBV分?jǐn)?shù)值有所增加。盡管對(duì)照組CBV分?jǐn)?shù)有所下降， 但這種下降與零沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用多元的ANOVA，可以僅在齒狀腦回發(fā)現(xiàn)有各組之 間的差異。
為了驗(yàn)證開始的假設(shè)，即可能用齒狀腦回以外的一個(gè)海馬亞區(qū)提取CBV改變的神經(jīng) 發(fā)生特有成分，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行多重線性回歸分析(MLRA)。然而，事先并不知道哪一 個(gè)海馬亞區(qū)是最有用的(如果真有的話)，MLRA可以用來探索各種選擇。結(jié)果顯示，將 CA1區(qū)的CBV差數(shù)分值包括在分析中作為一個(gè)協(xié)變量，產(chǎn)生齒狀腦回CBV與BrdU標(biāo)記 之間的顯著相關(guān)(如圖11右側(cè)區(qū))。
圖11的左曲線圖表示齒狀腦回CBV差值(CBV運(yùn)動(dòng)減去CBV對(duì)照)和BrdU標(biāo)記的 神經(jīng)發(fā)生測(cè)量交叉相關(guān)。這種交叉相關(guān)不考慮由運(yùn)動(dòng)引起的但不是由神經(jīng)發(fā)生引起的 CBV變化。值得注意的是，可以觀察到正趨勢(shì)，卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。右側(cè)曲線圖表明同 樣的相關(guān)性，但是齒狀腦回CBV差值己通過減去CA1亞區(qū)的CBV差值得到校正。校正 后得到的齒狀腦回CBV變化和神經(jīng)發(fā)生間有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性。
這些初步的結(jié)果1)證實(shí)了有可能將特異性賦予CBV作為與神經(jīng)發(fā)生的一種關(guān)聯(lián) 的假設(shè)，2)鑒別了哪個(gè)海馬亞區(qū)能提供關(guān)于非神經(jīng)發(fā)生的運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)CBV變化的最佳評(píng) 估。
研究設(shè)計(jì)及方法 特定的目的為-
1、 確定大鼠齒狀腦回中運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生及MRI測(cè)量的CBV變化之間的關(guān)聯(lián)性。
2、 確定已知具有體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生活性的化合物(丙戊酸和氟西汀)是否可以增加CBV。
為了這兩個(gè)目的，實(shí)驗(yàn)方法與初始結(jié)論所描述的方法相類似。使用MRI測(cè)量大鼠對(duì)
照組和測(cè)試組海馬亞區(qū)的CBV。測(cè)試組神經(jīng)發(fā)生通過運(yùn)動(dòng)或通過用丙戊酸，氟西汀處理 來刺激。使用多重線性回歸分析法確定最好的方法，以便使神經(jīng)發(fā)生誘導(dǎo)的齒狀腦回CBV 變化與組織學(xué)檢測(cè)的神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行關(guān)聯(lián)。試驗(yàn)方法技術(shù)細(xì)節(jié)將在下節(jié)進(jìn)行描述。 用MRI檢測(cè)CBV 嚙齒動(dòng)物MRI實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)室擁有一臺(tái)Bruker AVANCE 400WB核磁共振儀(Bruker NMR， Inc., Bilerica， MA)，裝備有89mm 口徑9.4特斯拉垂直的Bruker磁鐵(Oxford Instruments Ltd., UK)， 使用圓拱形RF探頭和高達(dá)100G/cm的屏蔽梯度系統(tǒng)?？椎闹睆胶吞厮估瓘?qiáng)度提供具有最 佳信噪比的穩(wěn)定高分辨率圖像。中心也設(shè)有一間手術(shù)室，裝配解剖顯微鏡，手術(shù)器械，麻 醉藥和其它器材。 生理監(jiān)控
許多生理過程會(huì)影響腦部的MRI信號(hào)，尤其是在測(cè)量靜止信號(hào)時(shí)。因此實(shí)驗(yàn)室裝備 有一系列的生理監(jiān)控設(shè)備，當(dāng)對(duì)大鼠成像時(shí)，可以嚴(yán)密監(jiān)控一系列生理措施。使用微二氧 化碳監(jiān)測(cè)器可連續(xù)的監(jiān)控02和C02;心率和脈搏可通過脈搏血氧計(jì)持續(xù)監(jiān)控。而溫度由 熱敏電阻器連續(xù)監(jiān)控。如果需要的話，可以通過裝置在磁鐵的設(shè)備記錄EKG和呼吸強(qiáng)度。 麻醉
雖然大鼠的頭部已被機(jī)械固定在位，但仍要用麻醉使得頭部移動(dòng)最小化；并且，麻醉 可以降低由掃描儀引起的恐懼和焦慮。原則上任何麻醉都會(huì)影響大腦生理活動(dòng)，因此所有 的麻醉藥都會(huì)影響MRI信號(hào)；因此需要小心的選擇適當(dāng)?shù)乃幬?。采用異氟醚氣體(誘導(dǎo) 階段為經(jīng)過頭錐體的通氣量lL/min的3volX，保持階段為1.5vol% )。異氟醚比其它麻醉 藥具有最大的優(yōu)勢(shì)是異氟醚不引起或只引起最小的腦血液動(dòng)力學(xué)改變。CBV依賴的血液
動(dòng)力學(xué)偶聯(lián)一氧代謝和腦血流量間的生物物理學(xué)關(guān)系。結(jié)果表明幾個(gè)麻醉劑產(chǎn)生解耦聯(lián)， 這對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生破壞性影響?？紤]到這個(gè)關(guān)鍵的事項(xiàng)，已就多種麻醉劑對(duì)T2加權(quán)信號(hào)的影 響進(jìn)行探討。最終決定采用異氟醚，盡管其它麻醉劑如氯胺酮/賽拉嗪與異氟醚有相似的 性質(zhì)。 數(shù)據(jù)采集
首先獲得三個(gè)試驗(yàn)性掃描，以便沿著標(biāo)準(zhǔn)的解剖學(xué)方向以可再現(xiàn)的方式對(duì)后續(xù)的T2 加權(quán)成像進(jìn)行定位。用橫斷位多層快速自旋回波(FSE)序列獲得T2加權(quán)軸向影像，回 復(fù)/回波時(shí)間TR/TEef=2000/80ms，帶有馳豫增強(qiáng)的快速采集因子(RARE) =16, FOV=26mm，采集矩陣-256x256，層厚0.6mm，層距二0.1mm， 28NEX。平面分辨率為100pm。此序列重復(fù)4次，總的成像時(shí)間為60分鐘。首個(gè)15分鐘對(duì)應(yīng)于釓前成像，過后 延遲l-2分鐘，腹膜內(nèi)注射釓，同時(shí)對(duì)小鼠成像。注射持續(xù)30秒。利用相同的動(dòng)態(tài)范圍 獲得所有的影像，因此不存在有重新調(diào)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)。 造影劑給藥
施用血管內(nèi)造影劑獲得腦部CBV圖像。對(duì)嚙齒目動(dòng)物施用了不同的造影劑獲得CBV 圖像。迄今為止，大部分研究的造應(yīng)影劑給藥方式采用靜脈注射。由于對(duì)嚙齒目動(dòng)物實(shí)施 靜脈注射給藥通常存在問題，伴隨有頻繁的發(fā)病甚至偶見出現(xiàn)死亡，因此不是理想的適用 于縱向研究長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)對(duì)嚙齒目動(dòng)物成像。受此問題的驅(qū)動(dòng)，對(duì)一種釓作為造影劑的腹膜 注射實(shí)驗(yàn)原型進(jìn)行了優(yōu)化。該實(shí)驗(yàn)原型最近已被送去發(fā)表，并作為本發(fā)明的附件(Moreno, Huaetal.2005)。
濃度為287-mg/ml， pH為5.5-7.0的釓雙胺無(wú)菌水溶液未稀釋，經(jīng)由OD為0.6mm的 導(dǎo)管注射，它在成像前已置于腹腔內(nèi)。導(dǎo)管用6.0絲縫合材料固定。 一旦獲得一次初始影 像(施用造影劑前)，腹膜注射釓雙胺，給藥劑量為10mMol/Kg。成像階段完成后，大鼠 仍然處于麻醉狀態(tài)，緩慢腹腔注射2ml生理食鹽水。如附錄中所示，研究發(fā)現(xiàn)這是清除 殘留的釓所需要的；根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，由于沒有此步驟，動(dòng)物再次顯影時(shí)產(chǎn)生低對(duì)比度/噪音比。
對(duì)幾組釓腹腔注射給藥劑量進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)超過lOmMol時(shí)出現(xiàn)毒性反應(yīng)(主要為暫時(shí) 性不穩(wěn)定步態(tài)，或是眩暈)，當(dāng)?shù)陀?mMol時(shí)Delta R2值過低。時(shí)間進(jìn)程曲線可以提供 辨別注射釓和顯影劑造影后(45分鐘)間適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間距。 圖像加工
數(shù)據(jù)重構(gòu)后，輸送原始圖像到裝載有MEDx圖像分析軟件包(高級(jí)系統(tǒng))的Linux工 作站。由對(duì)受試組不了解的研究者處理所有圖像。
得到的CBV圖像按照由Li等首次發(fā)明的方法產(chǎn)生。第一，施用釓前的圖像與施用 釓后的圖像被配準(zhǔn)。第二，從施用釓前的圖像中減去施用釓后的圖像。第三，在含有100 %血液的區(qū)域測(cè)得'信號(hào)改變分?jǐn)?shù)，。盡管對(duì)于人使用矢狀竇進(jìn)行此測(cè)定，但是對(duì)于大鼠， 頸靜脈更容易顯現(xiàn)，因此用于此測(cè)定中。第四，被減的圖像由頸靜脈中改變的分?jǐn)?shù)進(jìn)行劃 分，得到CBV圖像(Lin, Paczynski et aU997)。
從5個(gè)海馬亞區(qū)的解剖圖像鑒別感興趣的區(qū)域(ROI)，這5個(gè)海馬亞區(qū)包括內(nèi)嗅皮質(zhì)， 齒狀回，CA1禾HCA3子域，和下托。要注意的是在各亞區(qū)間辨別精確的緣帶需要特殊的 組織學(xué)染色，而在體內(nèi)成像時(shí)該操作是不可用的。由于缺少辨別各亞區(qū)間的精確的緣帶的 解剖學(xué)界標(biāo)，妨礙了各亞區(qū)的容量分析；然而，如在組織切片電生理學(xué)一樣，依賴可視化
的解剖學(xué)界標(biāo)鑒別每個(gè)亞區(qū)的大概位置是可能的。對(duì)海馬結(jié)構(gòu)分段時(shí)需要兩個(gè)界標(biāo)一它的 外部形態(tài)和海馬裂的鑒定。海馬結(jié)構(gòu)的外部形態(tài)可以在同時(shí)T2和丁2*加權(quán)的圖像中方便 的顯現(xiàn)。在成熟活體動(dòng)物中海馬裂通常是關(guān)閉的；幸運(yùn)的是，海馬內(nèi)長(zhǎng)靜脈循沿著海馬裂 的路徑，而靜脈在T2和T2^卩權(quán)像中可方便顯現(xiàn)。這些圖像用于辨別海馬裂。在系列獲 得的軸向切片中，可以成功鑒別一個(gè)很容易顯現(xiàn)這些解剖學(xué)界標(biāo)的"單個(gè)最好的切片"。這 種切片通常在海馬結(jié)構(gòu)的中體中獲得(如圖9所示)。 一旦鑒定了解剖學(xué)界標(biāo)，可以用標(biāo) 準(zhǔn)的小鼠腦圖片集來繪制每個(gè)海馬亞區(qū)的ROIs。 ROI被繪制在每個(gè)亞區(qū)的質(zhì)心，目的是 遠(yuǎn)離緣帶。同時(shí)從左和右海馬亞區(qū)繪制ROIs。先前的研究發(fā)現(xiàn)，這些ROIs各組間交叉的 尺寸近似相等。然而，如果觀察到系統(tǒng)差別時(shí)，ROI的尺寸可被檢測(cè)和校正。
測(cè)定每個(gè)海馬ROI的平均CBV。最后，通過從運(yùn)動(dòng)后掃描測(cè)得的CBV中減去神經(jīng) 形成刺激前掃描測(cè)得的CBV，可以計(jì)算得到"CBV差值"。這些CBV差值用作為在以下"數(shù) 據(jù)分析"部分介紹的相關(guān)分析的主要變量。 神經(jīng)形成刺激實(shí)驗(yàn)方案介紹
獨(dú)居詞養(yǎng)體重為150—250克的雄性F344大鼠6—8周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成對(duì)照組和測(cè)試 組。對(duì)照組圈養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)籠子里。兩年中共有三組測(cè)試組。每組最少12只動(dòng)物，而實(shí)驗(yàn)組 的目標(biāo)數(shù)量一般為每組14只。所有大鼠在處理的第一天開始(第1天)，連續(xù)7天每天接 受腹腔注射100mg/kg BrdU。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受MRI分析測(cè)定第1天和第28天的CBV。 當(dāng)完成對(duì)第28天MRI成像后，用4%多聚甲醛經(jīng)心灌注處死麻醉動(dòng)物。如"尸檢分析"所 描述的，分離動(dòng)物腦部用作尸檢，神經(jīng)元增殖，存活和分化的分析。 運(yùn)動(dòng)測(cè)試組(測(cè)試組1)
第一組測(cè)試組圈養(yǎng)在裝有活動(dòng)輪子的活動(dòng)籠子里，由電腦監(jiān)控輪子的使用狀態(tài)。 施用藥物的測(cè)試組2和測(cè)試組3
第二和第三測(cè)試組飼養(yǎng)在與對(duì)照組相同條件的籠子中，但在MRI分析期間用已知的 神經(jīng)發(fā)生化合物處理28天。如"尸檢分析"所描述的，在MRI研究完成后，對(duì)動(dòng)物施以安 樂死，分離灌注固定的腦部，送至BrainCells公司分析。本實(shí)驗(yàn)建議施用兩種化合物丙 戊酸和氟西汀。
丙戊酸(VPA;2-丙基戊酸)是已知用于長(zhǎng)期治療癲癇的藥物。最近的研究表明VPA 在體內(nèi)間接的，至少部分的通過神經(jīng)形成轉(zhuǎn)錄因子NeuroD，誘導(dǎo)成人海馬神經(jīng)前體細(xì)胞 大部分分化成神經(jīng)元(Hao, Creson et al. 20(H; Hsieh, Nakashima et al. 2004)。
氟西汀是一種抗抑郁藥，其作用機(jī)制依賴于海馬神經(jīng)發(fā)生(Santarelli， Saxe et al. 2003)
VPA治療組(測(cè)試組2):成年雄性Fisher 344大鼠實(shí)施每天2次腹腔注射300mg/kg VPA(試驗(yàn)組)或生理鹽水(對(duì)照組)，為時(shí)28天。測(cè)試組的飲用水中也加入VPA (12g/L)。 如上所述方法用MRI對(duì)動(dòng)物成像。
氟西汀治療組(測(cè)試組3):成年雄性Fisher 344大鼠實(shí)施每天口腔強(qiáng)飼法注射氟西 汀10mg/kg (試驗(yàn)組)或生理鹽水(對(duì)照組)，為時(shí)28天。如上所述方法用MRI對(duì)動(dòng)物 成像。 尸檢分析
為了評(píng)價(jià)神經(jīng)發(fā)生(神經(jīng)元增殖，分化和存活)，使用熒光標(biāo)記細(xì)胞作特殊標(biāo)記物的 定量分析，對(duì)測(cè)試組和對(duì)照組的動(dòng)物腦部組織進(jìn)行分析(van Praag， Kempermann et a1.1999)。
動(dòng)物處死后，使用已經(jīng)成熟的試驗(yàn)方法，通過組織學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，用一半 的腦部作分化和細(xì)胞存活評(píng)價(jià)。根據(jù)BminCdls所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法，應(yīng)用以體視學(xué)為 基礎(chǔ)的計(jì)數(shù)法處理分析數(shù)據(jù)。
對(duì)剩余的一半腦部進(jìn)行解剖，進(jìn)一步分離海馬。使用細(xì)胞漉過器使組織破碎，小心 地用冷的4%多聚甲醛洗滌。然后應(yīng)用細(xì)胞計(jì)量術(shù)，以Ki67或Phospho H3 SerlO作為標(biāo) 記，評(píng)測(cè)增殖。
通過對(duì)一半腦部進(jìn)行分化和存活評(píng)價(jià)，對(duì)另一半進(jìn)行增殖研究，可以減少研究所需 的動(dòng)物數(shù)量，大為減少費(fèi)用(包括動(dòng)物費(fèi)用和化合物費(fèi)用)。 FACS分析試驗(yàn)方法
分離海馬組織，放置在一根50mlfalcon管中，并置于預(yù)濕的細(xì)胞漉過器中，溫和切 碎。用一根3cc注射器柱塞分散細(xì)胞；沖洗過濾層，得到所有的細(xì)胞。離心細(xì)胞，在10ml FACS緩沖液中重懸浮，計(jì)數(shù)，移出一份等份試樣(l-2xl(^細(xì)胞)放入一根5mlFACS管。 用冰冷卻的FACS緩沖液稀釋到5 ml體積，離心，去除上清液，在5ml冰冷卻的FACS 緩沖液懸浮，重復(fù)離心，最后在總體積為lml的FACS緩沖液中重懸浮，因此得到細(xì)胞 濃度為1-2" 06/100|^1。給每個(gè)反應(yīng)添加總體積為30^1的抗體或碘化丙錠(PI)(通常l嗎 Ab/—百萬(wàn)細(xì)胞)。用一根含有未標(biāo)記細(xì)胞的管子和帶有僅一個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)的管子，設(shè)置 FACS儀器。在冰上放置30分鐘。加入2ml冰冷卻的FACS緩沖液。離心，小心去除上 清液，然后在400^1 FACS緩沖液中重懸浮。立即用作分析。將PhosphoH3Serl0抗體或 Ki67抗體，在存在或不存在PI的條件下用作增殖測(cè)試。 組織學(xué)測(cè)試試驗(yàn)
腦組織固定后過夜，然后在30%蔗糖磷酸緩沖溶液中平衡。在冷凍切片機(jī)上收集游 離的40nm部分，并加入冷凍保護(hù)劑儲(chǔ)存。按照下一部分介紹的免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行試 驗(yàn)。
免疫組織化學(xué)方法試驗(yàn)
冷凍保護(hù)的、凍結(jié)的腦組織的一半為冠狀縫切面。BrdU抗體和感興趣的蛋白質(zhì)如 NeuN，神經(jīng)元和GFAP，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)識(shí)物也用于檢測(cè)細(xì)胞分化。簡(jiǎn)言之，對(duì)組織進(jìn) 行洗滌(0.01MPBS)，用1%11202封閉內(nèi)源性過氧化物酶，在PBS(O.Ol M,pH7.4, 10% 正常山羊血清,0.5% Triton X-100)中室溫培養(yǎng)2小時(shí)。然后組織用基本抗體在4QC培養(yǎng)過 夜。PBS漂洗，然后與生物素化的次級(jí)抗體一起培養(yǎng)(l小時(shí)，室溫)。組織進(jìn)一步用PBS 漂洗，在抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物法試劑盒溶液中室溫培養(yǎng)1小時(shí)。將各種的熒光發(fā) 色基團(tuán)結(jié)合的抗生物素蛋白鏈菌素用于顯影。PBS洗滌組織，簡(jiǎn)單的用dH20沖洗，連續(xù) 脫水，封蓋片。 細(xì)胞計(jì)數(shù)與無(wú)偏體視學(xué)試驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)限于海馬顆粒細(xì)胞層本身，及一個(gè)包含神經(jīng)發(fā)生亞顆粒細(xì)胞區(qū)，沿門邊寬50 pm的邊緣。在共聚焦顯微鏡下，通過細(xì)胞表型標(biāo)記物與BrdU的共區(qū)域化，對(duì)顯示家族 特異性表型的BrdU細(xì)胞的比例進(jìn)行測(cè)定。將分離平面和z軸分析應(yīng)用于所有的計(jì)數(shù)。使 用帶有40倍物鏡，2號(hào)電子可變焦距鏡頭的多通道構(gòu)型進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果允許的話，計(jì)數(shù) 每個(gè)動(dòng)物的每個(gè)標(biāo)記物的100個(gè)或更多的BrdU-陽(yáng)性細(xì)胞。在每個(gè)細(xì)胞"z"方向手動(dòng)檢測(cè)， 僅有那些細(xì)胞核明確地連接有家族特異性標(biāo)記物的細(xì)胞被計(jì)為陽(yáng)性。使用組織染色測(cè)定每 個(gè)海馬顆粒細(xì)胞層和亞顆粒細(xì)胞的每個(gè)特異家族(少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，神 經(jīng)元，其它)的BrdU-標(biāo)記的細(xì)胞的總數(shù)。用Abercrombie方法校正在40iam部分內(nèi)對(duì)經(jīng) 驗(yàn)測(cè)定的13nm平均直徑的細(xì)胞核的過高評(píng)估。 數(shù)據(jù)分析
一旦按照題為"用MRI獲得CBV"的CBV節(jié)和題為"尸檢分析"的組織學(xué)及FACS節(jié)所 描述的方法獲得數(shù)據(jù)，可通過組內(nèi)分析和組間分析法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以便確定，在神 經(jīng)發(fā)生和CBV之間是否存在有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。具體地說，將用無(wú)偏體視學(xué)和FACS 產(chǎn)生的細(xì)胞計(jì)數(shù)與用MRI產(chǎn)生的信號(hào)變化分值交叉相關(guān)。在組間的交叉相關(guān)中的分析包 括CBV改變(信號(hào)變化值作為共變量)，增殖，和BrdU標(biāo)記細(xì)胞的家族特異分化[如， 增殖細(xì)胞的總數(shù)，BrdU標(biāo)記細(xì)胞的總數(shù)，雙標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞的總數(shù)(神經(jīng)發(fā)生)，雙標(biāo)記
成少突膠質(zhì)細(xì)胞的總數(shù)，雙標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞的總數(shù)]的各個(gè)相關(guān)。根據(jù)初步結(jié)果，對(duì)海
馬其它區(qū)域的評(píng)價(jià)可被擴(kuò)大以解釋由于非神經(jīng)性原因?qū)Ρ壬窠?jīng)性原因的CBV改變。盡管
運(yùn)動(dòng)得到的結(jié)果顯示，CA1區(qū)能被用于提取特定的關(guān)于神經(jīng)發(fā)生誘導(dǎo)的CBV變化的信息，
但是并不能肯定該區(qū)域適用于藥物誘導(dǎo)的作為神經(jīng)發(fā)生的結(jié)果的CBV增加。數(shù)據(jù)分析用
于鑒別最適的海馬區(qū)，使用該海馬區(qū)分析非神經(jīng)發(fā)生對(duì)比神經(jīng)發(fā)生誘導(dǎo)的CBV變化。
脊椎動(dòng)物
說明
試驗(yàn)中使用將近100只成年雄性Fisher大鼠。根據(jù)研究設(shè)計(jì)和方法部分的介紹，對(duì) 動(dòng)物進(jìn)行不同的試驗(yàn)處理(對(duì)照組，任意運(yùn)動(dòng)組，丙戊酸處理組，或氟西汀處理組)。在 處理的開始和結(jié)束時(shí)，用MRI分析動(dòng)物；MRI分析結(jié)束后處死動(dòng)物。采用流式細(xì)胞計(jì)量 術(shù)，組織學(xué)，組織化學(xué)方法評(píng)價(jià)動(dòng)物腦部的神經(jīng)發(fā)生。 判斷
選用大鼠是因?yàn)樗呛Y選作用CNS的藥物的優(yōu)選物種。檢索Medline，證實(shí)如同本 發(fā)明所描述的，目前沒有其它哺乳動(dòng)物適用于遺傳學(xué)和神經(jīng)科學(xué)行為學(xué)基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)。此外， 多種研究表明大鼠是研究人類疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常導(dǎo)致的人類疾病的良好模型。 選擇動(dòng)物的數(shù)量，得到足夠的變量，來解釋CBV和神經(jīng)發(fā)生之間系列復(fù)雜的關(guān)系。 動(dòng)物福利
所有動(dòng)物試驗(yàn)均在哥倫比亞大學(xué)進(jìn)行，由負(fù)責(zé)試驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施管理的Dr Dennis Kohn, D. V. M., Ph.D.主持監(jiān)督。動(dòng)物的飲水，喂食和居所均按照NIH認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，在一個(gè)溫度和 光度控制的環(huán)境，具備有12/12小時(shí)光亮/黑暗循環(huán)，并隨意地提供食物和水。動(dòng)物飼養(yǎng) 員每日檢査動(dòng)物，查找動(dòng)物的任何征兆或癥狀或不安。如果動(dòng)物開始出現(xiàn)體重下降或不穩(wěn) 定的癥狀，將由試驗(yàn)動(dòng)物臨床獸醫(yī)對(duì)他們進(jìn)行檢查。依照NIH的標(biāo)準(zhǔn)定期檢查實(shí)驗(yàn)室設(shè) 備。
試驗(yàn)操作
給大鼠施用異氟垸，以減少活動(dòng)和心理焦慮，同時(shí)進(jìn)行成像。注意在動(dòng)物接受成像時(shí)， 保持大鼠的健康和舒適。這同時(shí)符合人道主義和科研目標(biāo)。許多生理活動(dòng)會(huì)影響腦部的 MRI信號(hào)，尤其在檢測(cè)靜止信號(hào)時(shí)。因此購(gòu)買了一系列的生理學(xué)監(jiān)測(cè)設(shè)備，時(shí)刻監(jiān)測(cè)在 大鼠接受成像時(shí)大部分的生理學(xué)活動(dòng)。使用微二氧化碳監(jiān)測(cè)儀(Columbus Instruments) 連續(xù)的監(jiān)測(cè)02和C02，脈搏血氧定量?jī)x連續(xù)監(jiān)測(cè)心率和脈搏率(Model V33304, SergiVet)。 熱敏電阻(YSI Precision Thermometer 4000A)持續(xù)監(jiān)測(cè)溫度。如果需要的話，使用安裝在磁
鐵中的設(shè)備記錄EKG和呼吸頻率。 安樂死
給大鼠施用過量的苯巴比妥處以安樂死。該方法符合美國(guó)獸醫(yī)醫(yī)藥協(xié)會(huì)的安樂死專門 小組的建議。
Belliveau, J. W.， B. R. Rosen， et-afrft990). "Functional cerebral imaging by susceptibility-contrast NMR." Magn Reson Med 14 (3): 538-46.
Dunn, J. F., M. A. Roche, et al. (2004). "Monitoring angiogenesis in brain using steady-state quantification of DeltaR2 with MION infusion." Magn Reson Med 51(1): 55-61.
Dunn, J. F.， M. A. Roche, et al. (2003). "Steady-state MR imaging with MION for quantification of angiogenesis in normal brain and in brain tumors." Adv Exp Med Biol 540:
Eriksson, P. S., E. Perfilieva, et al. (1998》"Neurogenesis in the adult human hippocampus." Nat Med 4(11): 1313-7.
Gold, S.， B. Christian, et al. (1998). "Functional MRI statistical software packages: a comparative analysis." Hum Brain Mapp 6(2): 73-84.
Gonzalez, R. G.， A. J. Fischman, et al. (1995). "Functional MR in the evaluation of dementia: correlation of abnormal dynamic cerebral blood volume measurements with changes in cerebral metabolism on positron emission tomography with fludeoxyglucose F 18." AJNR Am J Neuroradiol 16(9): 1763-70.
Hao, Y., T. Creson, et al. (2004). "Mood stabilizer valproate promotes ERK pathway-dependent cortical neuronal growth and neurogenesis." J Neurosci 24(29): 6590-9.
Hsieh， J., J. B. Aimone， et al. (2004). "IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes." J Cell Biol 164(1): 111-22.
發(fā)明和試驗(yàn)實(shí)施細(xì)節(jié)i-m的背景參考文獻(xiàn)
221-6.
Hsieh， J.， K. Nakashima， et al. (2004). "Histone deacetylase inhibition-mediated neuronal differentiation of multipotent adult neural progenitor cells." Proc Natl Acad Sci U S A 101 (47): 16659-64.
Jiang, Q,, Z. G. Zhang， et al, (2005). "Investigation of neural progenitor cell induced angiogenesis after embolic stroke in rat using MRI." Neuroimage.
Kempermann， G. and F. H. Gage (2000). "Neurogenesis in the adult hippocampus." Novartis Found Symp 231: 220-35; discussion 235-41， 302-6,
Kempermann, G.， H. G. Kuhn， et al. (1997). "More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment." Nature 386(6624): 493-5.
Kempermann, G., H. G. Kuhn， et al. (1998). "Experience-induced neurogenesis in the senescent dentate gyrus." JNe咖sci 18 (9): 3206-12.
Kola， I. and J. Landis (2004), "Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates " Nat Rev Drug Discov 3: 711.
Kuppusamy, K., W. Lin, et al. (1996). "In vivo regional cerebral blood volume: quantitative assessment with 3D Tl誦weighted pre- and postcontrast MR imaging." Radiology 201(1):
Lin， T. N.， S. W. Sun， et al, (2002). "Dynamic changes in cerebral blood flow and angiogenesis after transient focal cerebral ischemia in rats. Evaluation with serial magnetic resonance imaging." Stroke 33(12): 2985-91.
Lin， W.， A, Celik， et al. (1999). "Regional cerebral blood volume: a comparison of the dynamic imaging and the steady state methods." J Magn Reson Imaging 9(1): 44-52,
Lin， W., R. P. Paczynski, et al. (1997). "Quantitative measurements of regional cerebral blood volume using MRI in rats: effects of arterial carbon dioxide tension and mannitol." Magn Reson Med 38(3): 420-8.
106-12.Louissaint, A., Jr.， S. Rao, et al. (2002). "Coordinated interaction of neurogenesis and angiogenesis in the adult songbird brain." Neuron 34(6》945-60.
Mandeville, J. B.， B, G. Jenkins， et al. (2001). "Regional sensitivity and coupling of BOLD and CBV changes duringstimulation of rat brain." Magn Reson Med 45(3): 443-7.
Morcuende, S., C. A. Gadd, et aJ. (2003》"Increased neurogenesis and brain-derived neurotrophic factor in neurokinin-1 receptor gene knockout mice." Eur J Neurosci 18 (7): 1828-36.
Moreno, H.， F. Hua, et al. (2005). "Longitudinal mapping of mouse cerebral blood volume with MR!" NMR in Biomedicine.
Newton， S. S. and R. S. Duman (2004). "Regulation of neurogenesis and angiogenesis in depression." Curr Neurovasc Res 1(3): 261-7.
Palmer, T. D.,丄Ray， et al. (1995). "FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain." Mol Cell Neurosci 6(5): 474-86.
Palmer, T. D,， A. R. Willhoite， et ar (2000). "Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis." J Comp Neurol 425(4》479- 94 .
Ray， J.， D. A. Peterson, et al. (1993). "Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons." Proc Natl Acad Sci U S A 90(8): 3602-6.
Santarelli， L., M. Saxe， et al. (2003). "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants." Science 301(5634): 805-9.
Small， S. A.， M. K. Chawla， et al. (2004), "Imaging correlates of brain function in monkeys and rats isolates a hippocampal subregion differentially vulnerable to aging." Proc Natl Acad Sci U S A 101(18) :7181-6.
Small, S. A., W. Y. Tsai, et al. (2002), "Imaging hippocampal ftinction across the human life span: is memory decline normal or not " Ann Neurol 51(3》290-5. Small, S. A., E. X. Wu, et al. (2000). "Imaging physiologic dysfunction of individual hippocampal subregions in humans and genetically modified mice." Neuron 28(3): 653-64.
Song, H. J., C. F. Stevens, et al. (2002). "Neural stem cells from adult hippocampus develop essential properties of functional CNS neurons." NatNeurosci 5(5): 438-45.
van Bruggen, N.， E. Busch, et al. (1998). "High-resolution functional magnetic resonance imaging of the rat brain: mapping changes in cerebral blood volume using iron oxide contrast media." J Cereb Blood Flow Metab 18(11): 1178-83.
van Praag, H.， G. Kempermann, et al. (1999). "Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus." Nat Neurosci 2(3): 266-70.
van Praag, H., A. F. Schinder, et al. (2002). "Functional neurogenesis in the adult hippocampus." Nature 415(6875): 1030-4.
van Zijl, P. C， S. M. Eleff, et al. (1998). "Quantitative assessment of blood flow, blood volume and blood oxygenation effects in functional magnetic resonance imaging." Nat Med 4 (2): 159-67.
Wu, E. X.， K. K. Wong, et al. (2003). "High-resolution in vivo CBV mapping with MRI in wild-type mice." Magn Reson Med 49(4): 765-70.
實(shí)施細(xì)節(jié)IV
海馬結(jié)構(gòu)是一種回路，由獨(dú)立的卻互相連接的海馬亞區(qū)組成(1)。在構(gòu)成海馬結(jié)構(gòu)的 多個(gè)亞區(qū)中，齒狀腦回(DG)是唯一支持成年大腦的神經(jīng)發(fā)生的一個(gè)亞區(qū)(2—5)。許多 研究證明，體育鍛煉可以刺激嚙齒類動(dòng)物海馬的神經(jīng)發(fā)生(6,7)和增強(qiáng)依賴海馬的認(rèn)知 能力(8，9)。此外，運(yùn)動(dòng)已顯示了能改善衰老性記憶力下降(7， 10-12)，這是一種與齒狀腦 回功能障礙相關(guān)的過程(13， 14)。然而，運(yùn)動(dòng)是否刺激人類的神經(jīng)發(fā)生仍然未知。
考慮到這個(gè)問題，己研究了不同的成像方法，試圖提供一種神經(jīng)發(fā)生的體內(nèi)關(guān)聯(lián)。盡 管設(shè)計(jì)了成像放射性配體來與新生分裂細(xì)胞結(jié)合是很吸引人的方法，但PET (正電子發(fā)
射體層掃描術(shù))成像由于本身固有的低分辨率，而不能使齒狀回顯現(xiàn)。另外，放射性標(biāo) 記的新生細(xì)胞也存在有潛在的安全關(guān)切。因此優(yōu)選使用MRI (磁共振成像)技術(shù)。關(guān)于 這一點(diǎn)，神經(jīng)發(fā)生和血管發(fā)生(15,16)的緊密聯(lián)系，及血管發(fā)生逐漸的促進(jìn)新生血管生 成(17， 18)，最終引起局部腦血容量(CBV)的增加(19-21)的事實(shí)是顯著可見的。由于CBV 可以用MRI檢領(lǐng)IJ，因此假設(shè)海馬CBV區(qū)域選擇增加可能提供一種神經(jīng)發(fā)生成像的關(guān)聯(lián)。 該假說已被首次在運(yùn)動(dòng)小鼠中試驗(yàn)，并可以對(duì)它們平行進(jìn)行體內(nèi)和體外研究?？紤]到 跟蹤C(jī)BV縱向變化的重要性，對(duì)新的MRI方法(22)進(jìn)行優(yōu)化，使得可以重復(fù)地并安全 地長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)獲得海馬圖像。 一旦在小鼠上證實(shí)了該假說，就可以在運(yùn)動(dòng)人類上進(jìn)行試驗(yàn)， 檢測(cè)是否能觀察到神經(jīng)發(fā)生的體內(nèi)相關(guān)，優(yōu)化MRI方法(23,24)先前顯示能夠在非人類 靈長(zhǎng)目動(dòng)物上獲得海馬CBV圖像(13)。 試驗(yàn)方法 運(yùn)動(dòng)
小鼠采用46只7周大C57BL/6小鼠23只運(yùn)動(dòng)，23只不運(yùn)動(dòng)。試驗(yàn)小鼠圈養(yǎng)在 帶有活動(dòng)輪子的籠里(Lafayette Instrument Company)。小鼠自發(fā)的跑2周。在以下時(shí)間點(diǎn) 獲得MRI影像第0周(基線)，第2周(運(yùn)動(dòng)停止時(shí))，第4周和第6周。在試驗(yàn)的第 二周連續(xù)7天腹膜內(nèi)注射胸腺嘧啶脫氧核苷類似物溴代脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記物(60 mg/kg/ 天)。在第6周麻醉動(dòng)物，并根據(jù)制度規(guī)定處死動(dòng)物。
人類招募達(dá)到低于平均有氧適能(V02max〈43男性，<37女性)(39)的AHA(美國(guó)心 臟病協(xié)會(huì))標(biāo)準(zhǔn)的受試者。11名登記的受試者在哥倫比亞大學(xué)健身中心進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練試驗(yàn)， 為期12周，每周四次。每次訓(xùn)練持續(xù)l小時(shí)在跑步機(jī)或固定式自行車上進(jìn)行5分鐘的 低強(qiáng)度熱身運(yùn)動(dòng)；5分鐘的伸展活動(dòng)；40分鐘有氧訓(xùn)練；10分鐘緩和和伸展活動(dòng)。在該 40分鐘的有氧訓(xùn)練中，受試者允許選擇在固定的測(cè)功計(jì)上騎腳踏車，在跑步機(jī)上跑步， 在樓梯機(jī)上攀登，或使用橢圓訓(xùn)練機(jī)。
在Ergoline 800S電子制動(dòng)自行車測(cè)力計(jì)(SensorMedics Corp. ， Anaheim, CA)上進(jìn)行等 級(jí)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)，檢測(cè)V02max (最大耗氧量)。每個(gè)受試者開始在30瓦特(W)運(yùn)動(dòng)2分鐘， 每2分鐘持續(xù)增加功率30瓦直到達(dá)到V02max標(biāo)準(zhǔn)(RQ of 1.1 or >,通氣量增加未伴隨著 V02增加，達(dá)到最大年齡預(yù)測(cè)的心率或意志力疲勞)。由連接FLO-I體積傳感器模型的呼 吸調(diào)速器檢測(cè)每分種換氣量(PHYSIO-DYNE Instrument Co卬.，Quogue， NY)。由順磁的02 和紅外的C02分析儀，連接電腦系統(tǒng)(MAX-I, PHYSIO-DYNE Instrument Corp., Quogue, NY)，測(cè)量呼氣的氧氣(02)和二氧化碳(C02)比例。這些分析一起都用已知的醫(yī)學(xué)登記的氣
體校正過。在等級(jí)運(yùn)動(dòng)測(cè)試中獲得最高的V02值被認(rèn)為是V02max。 體內(nèi)成像
小鼠根據(jù)先前介紹的試驗(yàn)設(shè)計(jì)由9.4特斯拉Bruker掃描儀(AVANCBV400WB分 光儀，BrukerNMR,Inc.,Billerica,MA)對(duì)小鼠成像(22)。簡(jiǎn)要地，軸向T2加權(quán)影像在下 列條件下最滿意地獲得快速序列(TR/TEeflN 2000ms/70ms; 30mm-i.d. birdcage RF探頭； 屏蔽梯度系統(tǒng)=100G/cm;以馳豫增強(qiáng)(RARE)因子=16快速采集；FOV=19.6mm;采集 矩陣=256 x 256; 8層；層厚-0.6mm，層距=0. Imm; NEX=28)。連續(xù)獲得五組圖像，每 組獲得時(shí)間需要16分鐘。第一批的兩組圖像在施用造影劑前獲得。然后通過成像前插入 腹膜內(nèi)的導(dǎo)管，腹膜注射注射釓雙胺(13 mmol/kg)。剩余三組圖像對(duì)應(yīng)造影后圖像。為 了阻止頭部移動(dòng)和減少焦慮，動(dòng)物通過鼻錐施用異氟垸氣體(保持lL/min通氣量的1.5 vol %)。選擇異氟烷是因?yàn)槠湟鹱钚〉哪X血液動(dòng)力學(xué)變化(40)。在整個(gè)過程中，監(jiān)測(cè)心 率，呼吸率和Sa02。相對(duì)CBV被繪圖為被造影劑誘導(dǎo)的橫向馳豫率(AR2)的改變。當(dāng)造 影劑達(dá)到均勻分布時(shí)，可從穩(wěn)態(tài)T2加權(quán)成像將CBV圖像測(cè)量為CBV a) AR2 = In (Spre/Spost)/TE;其中TE二有效回波時(shí)間；Spre二施用造影劑前信號(hào)；Spost^造影劑達(dá) 到穩(wěn)態(tài)時(shí)的信號(hào)。為了控制造影劑施用水平的差異，心輸出量，和總體血流量，衍生的圖 像被歸一化為后腦靜脈的最大4個(gè)像素信號(hào)值。顯現(xiàn)的解剖學(xué)界標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)圖譜一起用來鑒 別四個(gè)海馬亞區(qū)的位置齒狀回，CA3子域，CA1子域和內(nèi)嗅皮質(zhì)(41)。由每個(gè)亞區(qū)歸 一化的CBV測(cè)量結(jié)果用于組數(shù)據(jù)分析。
人類受試者用1.5特斯拉掃描儀Philips Intera掃描儀成像。如前所述(13)，在靜 脈注射造影劑釓(O.hnmol/kg)前及注射后4分鐘，定向垂直于海馬長(zhǎng)軸位獲得斜冠位Tl 加權(quán)圖像(重復(fù)時(shí)間，20ms;回波時(shí)間，(3ms;脈沖角，25度；面內(nèi)分辨率，0.86mmx86 mm;層厚,4mm)。造影前與造影后圖像的差值用于評(píng)價(jià)局部CBV圖像。為了控制造影劑 施用水平的差異，心輸出量，總體血流量(global blood flow)，衍生的信號(hào)強(qiáng)度差異被 歸一化為矢狀竇的最大個(gè)4像素信號(hào)值(24)。每個(gè)受試者，應(yīng)用造影前掃描來鑒定具有最 佳可視化的海馬結(jié)構(gòu)的外部形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造的層面。可視化的解剖學(xué)界標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)圖譜一起 用來鑒定四個(gè)海馬亞區(qū)的大體位置齒狀回，CA1子域，下托和內(nèi)嗅皮質(zhì)(13)。從每個(gè) 亞區(qū)得到的歸一化的CBV測(cè)量用作組數(shù)據(jù)分析。 顯微鏡
免疫組織化學(xué)使用自由浮動(dòng)的40卞m冠狀切面測(cè)定BrdU標(biāo)記。在2N HCI中37。C 培養(yǎng)1小時(shí)，進(jìn)行DNA變性，然后在硼緩沖液(pH8.5)中沖洗。沖洗后，在10°/。^02
中培養(yǎng)切片30分鐘，去除內(nèi)源性過氧化物酶。在0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 中的3%正常驢血清中封閉切片后，加入單克隆抗BrdU (1:600; Roche)在^C培養(yǎng)過夜。 然后用次級(jí)抗體(生物素化的驢抗一小鼠；Jackson Immuno Research Lab)室溫(RT)下 培養(yǎng)切片1小時(shí)，接著用抗生物素蛋白一生物素復(fù)合物(Vector Laboratories)擴(kuò)增，用 DAB(Sigma)顯影。為了進(jìn)行雙重免疫學(xué)標(biāo)記，首先在不同物種中提取的基本抗體，抗-BrdU (1:600; Roche)和抗-NeuN (1:500; Chemicon)的混合物中培養(yǎng)自由浮動(dòng)切片過夜。為了進(jìn) 行可視化，在山羊中提取的Alexa Fluor-綴合的適合的次級(jí)抗體(1:300; Molecular Probes) 室溫下顯影1小時(shí)。將封閉血漿和基本抗體和次級(jí)抗體添加到0.2% Triton X-100 (聚乙二 醇辛基苯基醚)的PBS中。將用于熒光顯微鏡的切片裝載在Vectashield (Vector Lab)中的 載玻片上。為了控制免疫標(biāo)記的特異性，省略去基本抗體，用適當(dāng)?shù)恼Ｑ迦〈９步?顯微鏡(Nikon E800， BioRad 2000)觀察切片。呈現(xiàn)的圖像是6 —16個(gè)光學(xué)切面(階梯1mm)， 它們?cè)缦缺桓鱾€(gè)收集(在綠色和紅色通道)或者同時(shí)收集(但要小心避免引起通道之間的串 擾)。用Adobe Photoshop 7.0處理圖像，拆分的圖像中不存在對(duì)比和亮度改變。
BrdU標(biāo)記的定量化加工貫穿海馬的每第6個(gè)切片用于BrdU免疫組織化學(xué)。每個(gè) 動(dòng)物使用10個(gè)切片。不知道研究代碼的實(shí)驗(yàn)員在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)齒狀腦回中(顆粒細(xì) 胞層和距離它小于60pm處)所有BrdU-標(biāo)記的細(xì)胞。測(cè)定每個(gè)切片的BrdU-標(biāo)記細(xì)胞總 數(shù)，再乘以每個(gè)動(dòng)物的切片數(shù)目，得到每個(gè)齒狀腦回的細(xì)胞總數(shù)。 認(rèn)知測(cè)試
用Rey Auditory Verbal Learning Test (29)的修正版本(該修正提高了記憶效果的可變 化性)在健康年輕成人中檢測(cè)陳述性記憶。在三個(gè)學(xué)習(xí)試驗(yàn)中呈現(xiàn)20個(gè)非語(yǔ)義或語(yǔ)音相 關(guān)的單詞，在試驗(yàn)中管理員讀單詞表，受試者自由回憶盡可能多的單詞。三個(gè)學(xué)習(xí)試驗(yàn)之 后立即進(jìn)行一次分散注意力列表的學(xué)習(xí)試驗(yàn)，接著進(jìn)行對(duì)初始列表的短期延遲的自由回 憶。在延遲90分鐘后，要求受試者自由回憶初始列表的單詞，接著自由回憶分散注意力 列表的各個(gè)項(xiàng)目。延遲24小時(shí)后，電話聯(lián)系受試者，要求自由回憶初始列表的內(nèi)容，接 著自由回憶分散注意力列表的內(nèi)容。然后受試者接受必修的認(rèn)知試驗(yàn)，要求受試者在初始 學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的語(yǔ)義和語(yǔ)音關(guān)聯(lián)的單詞以及從分散注意力試驗(yàn)中辨別出20個(gè)單詞。最后，開 展源頭記憶試驗(yàn)，受試者閱讀一張列表，只包含來自初始學(xué)習(xí)列表和分散注意力列表的單 詞，接著要求受試者辨別每個(gè)單詞來自哪個(gè)列表。設(shè)立語(yǔ)言學(xué)習(xí)測(cè)試的兩種形式，并平衡 給予的次序。如在先前的研究那樣(42)，測(cè)量初始學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的第一次試驗(yàn)中受試者正確 回憶出的單詞，在三個(gè)學(xué)習(xí)試驗(yàn)回憶的單詞的平均數(shù)，在短暫延遲后(<5min)正確回憶
出的初始學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的單詞數(shù)，延遲卯分鐘后正確回憶出的初始學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的單詞數(shù)，認(rèn)知
試驗(yàn)中正確辨別的條款數(shù)，以及源頭記憶試驗(yàn)中辨別的條款正確數(shù)。
結(jié)果
齒狀腦回CBV選擇性增加提供了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生的體內(nèi)相關(guān)
根據(jù)不同階段觀察的血管發(fā)生誘導(dǎo)血管增殖，隨著時(shí)間逐漸形成(18)來知道實(shí)驗(yàn)的 設(shè)計(jì)(圖12a)。因此，小鼠接受運(yùn)動(dòng)2周，此時(shí)為神經(jīng)發(fā)生達(dá)到其最大增加的時(shí)期，，在第 二周每日注射一種新生細(xì)胞的標(biāo)記物，BrdU(溴代脫氧尿苷)。為了獲得預(yù)期的CBV延遲 效應(yīng)，讓小鼠再存活4周，然后處死，并加工用于BrdU標(biāo)記。在6-周試驗(yàn)中得到四次海 馬CBV圖像運(yùn)動(dòng)前基線時(shí)，第2周時(shí)，第4周時(shí)和第6周時(shí)。同時(shí)對(duì)對(duì)造組平行成像， 按照相同的試驗(yàn)方法但不運(yùn)動(dòng)。海馬結(jié)構(gòu)由多個(gè)互相連接的亞區(qū)組成，包括內(nèi)嗅皮質(zhì)，齒 狀回，CA1和CA3子域，及下托。從所有海馬亞區(qū)(除下托外)可靠地提取CBV測(cè)量 結(jié)果(圖12c)。
重復(fù)測(cè)量的ANOVA用于分析成像數(shù)據(jù)集組。發(fā)現(xiàn)組X時(shí)間相互作用只適合于齒狀 腦回，顯示了運(yùn)動(dòng)與齒狀腦回CBV的選擇性增加有關(guān)(F-5.0, p=0.034)。如簡(jiǎn)單的對(duì) 比所示，運(yùn)動(dòng)停止后2周，從2周到4周出現(xiàn)最大的增加推動(dòng)了該效應(yīng)(F-5.9,p二0.021)(圖 12b)。內(nèi)嗅皮質(zhì)是唯一的其它海馬亞區(qū)，可感覺到其CBV隨時(shí)間增加，盡管沒有達(dá)到統(tǒng) 計(jì)顯著性(圖12b)。雖然運(yùn)動(dòng)可能通過促進(jìn)新陳代謝和增加腦血流量潛在地影響CBV，但 先前的研究(25， 26)已表明運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的新陳代謝變化應(yīng)該在運(yùn)動(dòng)期間內(nèi)而不是之后出現(xiàn)。 因此CBV呈現(xiàn)的觀察到的時(shí)空分布曲線與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生模型(18)較好的 吻合(圖12a)。
與先前研究(6)—致，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組BrdU標(biāo)記大于非運(yùn)動(dòng)組(F=9.8; p=0.004)(圖13a)。 超過90。/。的BrdU-陽(yáng)性細(xì)胞共同標(biāo)記NeuN， 一種神經(jīng)元特異的標(biāo)記物(圖13a)。再次應(yīng) 用重復(fù)測(cè)量模型考察神經(jīng)發(fā)生和CBV之間的聯(lián)系，包括BrdU用作協(xié)變量。觀察到一個(gè) 顯著的時(shí)間XBrdU相互作用僅適用于齒狀腦回CBV(F=3.3, p=0.039)，主要由從第2周到 第4周的變化驅(qū)動(dòng)(F:8.8， p=0.006)。如直接分析所示，該作用反映了從第2周到第4周 BrdU與CBV的改變之間的正相關(guān)(beta-0.58, p=0.001)(圖13b)。注意，當(dāng)ANOVA包含 BrdU作為一個(gè)協(xié)變量時(shí)，在齒狀腦回中觀察到的組X時(shí)間作用不再顯著，證實(shí)了神經(jīng)發(fā) 生是運(yùn)動(dòng)影響CBV的原因。目視檢查齒狀腦回CBV變化和BrdU之間的關(guān)系(圖13b) 提示，二次模型比線性模型更好的表征該關(guān)系，這可由曲線估算分析來證實(shí)(線性模型， R-平方K).34，p-0.001; 二次模型，R-平方^.59,p〈0.0001)。因此，齒狀腦回CBV改變和BrdU之間的聯(lián)系基本上當(dāng)CBV隨著運(yùn)動(dòng)而增加的時(shí)候存在(圖13b)。 在運(yùn)動(dòng)中的人中觀察到齒狀腦回CBV的選擇性增加
一旦確定了齒狀腦回CBV與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生相關(guān)聯(lián)，就有興趣檢測(cè)在運(yùn)動(dòng)中人 中是否也能觀察到這種效應(yīng)。使用先前報(bào)道的MRI方法得到人海馬結(jié)構(gòu)的CBV圖像，該 MRI方法是特別制定用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物海馬結(jié)構(gòu)成像的(13)。 11名受試者(平均年齡=33)參 加研究，完成為期3個(gè)月有氧運(yùn)動(dòng)課程，分別在運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)后獲取海馬CBV圖像。測(cè) 量得到可靠的所有海馬亞區(qū)(除CA3亞區(qū)外)的CBV值(圖14b)。與試驗(yàn)動(dòng)物相比較， 無(wú)法控制人在日常生活中出現(xiàn)的體力活動(dòng)的個(gè)體間差異。因此在運(yùn)動(dòng)前后我們測(cè)量 V02maX (最大耗氧量)，這是運(yùn)動(dòng)相關(guān)的有氧適應(yīng)能力(27, 28)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，來定量化運(yùn) 動(dòng)程度的個(gè)體差異。用改良的Rey聽覺言語(yǔ)學(xué)習(xí)試驗(yàn)(RAVLT)評(píng)測(cè)認(rèn)知性能(29)，該 設(shè)計(jì)允許跨越不同的學(xué)習(xí)試驗(yàn)并在延遲回憶，識(shí)別，和源頭記憶的期間測(cè)試認(rèn)知能力。10 名受試者在運(yùn)動(dòng)后評(píng)測(cè)認(rèn)知力，其中8名受試者在運(yùn)動(dòng)前基線時(shí)接受評(píng)測(cè)。
重復(fù)測(cè)量的ANOVA用于分析圖像數(shù)據(jù)，顯示齒狀腦回是唯一的CBV隨時(shí)間顯著增 加的海馬亞區(qū)(F-12, p=0.006)(圖14a)。如在小鼠中一樣，內(nèi)嗅皮質(zhì)是其它海馬亞區(qū)中唯 一的CBV隨時(shí)間略微增加，盡管沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，(F=4.3, p=0.064)(圖14a)。作 為一個(gè)組，VO2max值顯著地隨時(shí)間而增加(F^1.6;p^.007)(圖15a)，并且為了證實(shí)成像 的改變直接與運(yùn)動(dòng)相關(guān)，且不簡(jiǎn)單的受測(cè)試一再測(cè)試效應(yīng)影響，研究發(fā)現(xiàn)齒狀腦回CBV 個(gè)體差異與VO2max的個(gè)體變化有關(guān)聯(lián)(betai.662,p^.027)(圖15b)。重要地，在其它海 馬亞區(qū)未觀察到CBV和V02max的相互關(guān)聯(lián)，包括內(nèi)嗅皮質(zhì)(圖15b)，這證實(shí)運(yùn)動(dòng)對(duì)齒狀 腦回CBV有選擇性影響。
在認(rèn)知上，個(gè)人在試驗(yàn)l學(xué)習(xí)(F-7.0，p-0.027)運(yùn)動(dòng)后表現(xiàn)更好，伴隨著在所有試驗(yàn)學(xué) 習(xí)(F-5.0, p-0.053)和延遲回憶(F-5.0, p=0.057)改善的趨向。對(duì)延遲認(rèn)知(F-0.19, p=0.67) 或源頭記憶(F崎15,p《25)不存在影響(圖15a)。為了測(cè)試認(rèn)知能力提高與運(yùn)動(dòng)本身相關(guān)， 研究發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)1學(xué)習(xí)中個(gè)體的變化與V02max的個(gè)體變化相關(guān)(betaK).660，pK).037)。然 而，由于10名受試者中僅有8名完成運(yùn)動(dòng)前認(rèn)知測(cè)試，使用運(yùn)動(dòng)后認(rèn)知性能分值重復(fù)分 析。研究再次發(fā)現(xiàn)，V02max的變化只與運(yùn)動(dòng)后試驗(yàn)1學(xué)習(xí)相關(guān)聯(lián)(beta-0.70,p-0.026)(圖 15b)。附加分析表明，V02max的變化和認(rèn)知能力之間的相關(guān)性對(duì)試驗(yàn)l學(xué)習(xí)是具有選擇 性的(圖15b)，因此可以證實(shí)，盡管在其它認(rèn)知任務(wù)上有表面上的提高，但該獨(dú)特的能力 是選擇性地受運(yùn)動(dòng)影響的。
最后，檢測(cè)了認(rèn)知能力和CBV的關(guān)系。在所有海馬亞區(qū)中，試驗(yàn)l效果的提高和齒狀腦回CBV的增加之間的關(guān)聯(lián)是唯一一個(gè)趨向顯著性(betai.62, p=0.052)。由于缺少運(yùn) 動(dòng)前數(shù)據(jù)，重復(fù)進(jìn)行了對(duì)比CBV變化和運(yùn)動(dòng)后認(rèn)知能力的所有分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)后 試驗(yàn)1學(xué)習(xí)和齒狀腦回CBV專屬的關(guān)聯(lián)(beta二0.63， p=0.026)(圖15b)。 討論
這些研究的結(jié)果表明，齒狀腦回CBV與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生有成像相關(guān)，且這種相 關(guān)表達(dá)在訓(xùn)練的人中。如用任何的成像生物標(biāo)記物的情況一樣，用體外神經(jīng)發(fā)生的測(cè)量來 檢驗(yàn)它目前對(duì)于人是不可能的。盡管如此，運(yùn)動(dòng)對(duì)人和小鼠的海馬CBV顯著相似的影響 提示，這些影響具有相似的內(nèi)在機(jī)制。此外，對(duì)嚙齒類動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)程度的個(gè)體差 異與神經(jīng)發(fā)生的水平有關(guān)聯(lián)(30)，該結(jié)果與對(duì)人的研究發(fā)現(xiàn)是平行的，在對(duì)人的研究中運(yùn) 動(dòng)程度的個(gè)體差異性與CBV水平有關(guān)聯(lián)。縱觀以上結(jié)果，這些發(fā)現(xiàn)支持這樣的假說如 在小鼠中一樣，運(yùn)動(dòng)也刺激人的神經(jīng)發(fā)生。
運(yùn)動(dòng)顯示出對(duì)大腦多效的影響(31， 32)，緩解老年認(rèn)知能力下降(7，10-12)和改善抑郁癥 (33， 34)。在人(14，35)，非人靈長(zhǎng)類(13， 36)和嚙齒類動(dòng)物(13)的研究表明，齒狀腦回是特 別易受衰老過程影響的海馬亞區(qū)，且齒狀腦回機(jī)能障礙與認(rèn)知力老化有關(guān)(13， 14)。通過 發(fā)現(xiàn)人表現(xiàn)出的運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)與神經(jīng)發(fā)生的關(guān)聯(lián)性，且通過優(yōu)化確定跨物種生物標(biāo)記物的工 具，未來的研究可以進(jìn)一步深入了解正常大腦和衰老大腦的神經(jīng)發(fā)生功能的重要意義。而 且，本發(fā)明描述的成像工具是獨(dú)特地適用于研究神經(jīng)發(fā)生的潛在藥理學(xué)調(diào)節(jié)因素，用于測(cè) 試它們?cè)谥委熞钟舭Y(37)，或者在逆轉(zhuǎn)隨我們變老而發(fā)生的認(rèn)知能力下降中的作用(7， 38)。
試驗(yàn)細(xì)節(jié)IV參考文獻(xiàn)
1. Amaral， D. G. & Witter, M. P. (1989) Neuroscience 31， 571-91.
2. Altman， J. & Das， G. D. (1965) J Comp N畫l 124, 319-35.
3. Kaplan, M. S. & Hinds, J. W. (1977) Science 197， 1092-4.
4. Kempermann, G., Kuhn, H. G. & Gage, F. H. (1997) Nature 386， 493-5.
5. Eriksson, P. S., Perfilieva, E., Bjork-Eriksson, T., Alborn， A. M.， Nordborg, C, Peterson, D. A. & Gage, F. H. (1998) Nat Med 4， 1313-7.
6. van Praag, H., Christie, B. R., Sejnowski, T. J. & Gage, F. H. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96,13427-31.
7. van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C. & Gage, F. H. (2005) J Neurosci 25， 8680-5.
8. Snyder, J. S., Hong, N. S.， McDonald, R. J. & Wojtowicz， J. M. (2005) Neuroscience 130， 843-52.
9. Shors， T. J" Miesegaes, G., Beylin, A.， Zhao, M., Rydel, T. & Gould, E. (2001) Nature 410， 372-6.
10. Kramer, A. F., Hahn, S., Cohen, N. J., Banich, M. T., McAuley, E., Harrison, C. R., Chason, J., Vakil， E.， Bardell, L., Boileau, R. A. & Colcombe, A. (1999) Nature 400, 418-9.
11. Chan， A. S" Ho， Y. C， Cheung, M. C, Albert, M. S" Chiu， H. F. & Lam, L. C. (2005) J Am Geriatr Soc 53,1754-60.
12. Weuve，丄，Kang，.H., Manson, J. E., Breteler， M. M., Ware, J. H. & Grodstein， F. (2004) Jama 292， 1454-61.
13. Small, S. A., Chawla, M. K.， Buonocore, M., Rapp, P. R. & Barnes, C. A. (2004) Proc Natl AcadSciUS A 101,7181-6.
14. Small, S. A.， Tsai, W. Y., DeLaPaz, R.， Mayeux, R. & Stern, Y. (2002) Ann Neurol 51, 290-5.
15. Palmer, T. D., Willhoite， A. R. & Gage, F. H. (2000) J Comp Neurol 425,479-94.
16. Louissaint, A., Jr., Rao, S.， Leventhal， C. & Goldman, S. A. (2002) Neuron 34, 945-60.
17. Carmeliet， P. (2000) Nat Med 6, 389-95.
18. C謹(jǐn)eliet, P. (2003) Nat Med 9, 653-60.
19. Dunn, J. F., Roche， M. A., Springett, R., Abajian, M.，Merlis, J., Daghlian, C. P., Lu, S. Y. & Makki, M. (2004) Magn Reson Med 51， 55-61.
20. Pathak， A. P., Schmainda, K. M.， Ward, B. D.， Linderaian, J. R., Rebro, K. J. & Greene, A. S. (2001) Magn Reson Med 46, 735-47.
21. Jiang, Q.， Zhang， Z. G" Ding, G. L.， Zhang, L., Ewing， J. R" Wang, L" Zhang, R.， Li， L., Lu, M.， Meng, H., Arbab, A. S., Hu, J" Li, Q. J., Pourabdollah Nejad, D. S., Athimman, H. & Chopp, M. (2005) Neuroimage 28, 698- 707.
22. Moreno, H., Hua, F., Brown， T. & Small, S. (2006) NMR Biomed.
23. Lin, W., Paczynski, R. P., Kuppusamy, K., Hsu， C. Y. & Haacke, E. M. (1997) Magn Reson Med 38,420-8.
24. Lin, W., Celik, A. & Paczynski, R. P. (1999) J Magn Reson Imaging 9, 44-52.
25. Vissing， J" Andersen, M. & Diemer, N. H. (1996) J Cereb Blood Flow Metab 16， 729-36.
26. Ide, K. & Secher, N. H. (2000) Prog Neurobiol 61， 397- 414.
27. Mitchell, J. H" Sproule， B. J. & Chapman, C. B. (1958) J Clin Invest 37, 538-47.
28. Wagner, P. D. (1996) Annu Rev Physiol 58, 21-50.
29. Rey, A. (1964) L'examen clinique en psychologie (Presses Universitaires de France, Paris).
30. van Praag， H., Kempermann， G. & Gage, F. H. (1999) NatNeurosci 2, 266-70.
31. Cotman， C W. & BerchtoW, N. C. (2002) Trends Ne薩ci 25, 295-301.
32. Dishman, R. K.， Berthoud, H. R.， Booth, F. W., Cotman, C. W.， Edgerton, V. R., Fleshner, M. R.， Gandevia， S. C，Gomez-Pinilla, F.， Greenwood, B. N., Hillman， C. H.， Kramer, A. F.,Levin, B. E.， Moran, T. H.， Russo- Neustadt， A. A., Salamone, J. D., Van Hoomissen, J. D., Wade, C. E., York, D. A. & Zigmond, M. J. (2006) Obesity (Silver Spring) 14, 345-56.
33. Dunn, A. L., Trivedi, M. H.， Kampert， J. B.， Clark, C. G. & Chambliss, H. O. (2005) Am J PrevMed28, 1-8.
34. Blumenthal, J. A., Babyak, M. A.， Moore, K. A., Craighead, W. E., Herman, S., Khatri， P., Waugh， R., Napolitano, M. A., Forman, L. M., Appelbaum, M., Domiswamy, P. M. & Krishnan， K. R. (1999) Arch Intern Med 159, 2349-56.
35. West, M. J" Coleman, P. D.， Flood, D. G. & Troncoso, J. C (1994) Lancet 344, 769-72.
36. Gazzaley, A. H.， Siegel, S. J.， Kordower, J. H., Mufson， E. J. & Morrison, J. H. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93， 3121-5.
37. Santarelli, L., Saxe, M., Gross, C., Surget, A.， Battaglia, F.， Dulawa, S., Weisstaub, N., Lee， J., Duman, R., Arancio, 0., Belzung, C. & Hen, R. (2003) Science 301， 805-9.
38. Small, S. A., Stem, Y., Tang, M. & Mayeux， R. (1999) Neurology 52， 1392-6.
39. Fletcher, G. F., Balady, G.， Froelicher, V. F.， Hartley, L. H.， Haskell, W. L. & Pollock, M. L. (1995) Circulation 91, 580-615.
40. Lei， H., Grinberg, 0" Nwaigwe, C. I" Hou, H. G.， Williams, H., Swartz, H. M. & Dunn, J. F. (2001) Brain Res 913, 174-9.
41. Paxinos， G. & Franklin, K. (2001) The mouse brain in stereotaxic coordinates (Academic Press.
42. Van der Elst， W.， van Boxtel， M. P., van Breukelen, G. J. & Jolles, J. (2005) J Int Neuropsychol Soc 11, 290-302.
權(quán)利要求
1.一種方法，用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，其患有與海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生下降有關(guān)的疾病，其特征在于，所述方法包括給該對(duì)象施用治療有效劑量的化合物，該化合物導(dǎo)致對(duì)象的海馬齒狀腦回腦血容量增加，其增加量比其引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的增加量的百分比要高，從而達(dá)到治療的目的。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述對(duì)象是人。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述疾病選自疾病組，包括阿爾茨海默氏病，創(chuàng)傷 后心理壓力緊張綜合癥，衰老性記憶力喪失或抑郁癥。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述疾病是阿爾茨海默氏病。
5、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述疾病是創(chuàng)傷后心理壓力緊張綜合癥。
6、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述疾病是衰老性記憶力喪失，且對(duì)象年齡大于65 歲。
7、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述疾病是抑郁癥。
8、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述化合物是5-羥色胺選擇性吸收抑制劑。
9、 一種方法，用于抑制哺乳動(dòng)物對(duì)象的與該對(duì)象海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生下降有關(guān)的疾病 的發(fā)作，其特征在于，所述方法包括給對(duì)象施用預(yù)防有效劑量的化合物，該化合物導(dǎo) 致對(duì)象的海馬齒狀腦回腦血容量增加，其增加量比其引起對(duì)象者海馬CA1區(qū)腦血容量 的增加量的百分比要高，從而達(dá)到抑制疾病發(fā)作的目的。
10、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述對(duì)象是人。
11、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述疾病選自疾病組，包括阿爾茨海默氏病，創(chuàng) 傷后心理壓力緊張綜合癥，衰老性記憶力喪失或抑郁癥。
12、 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述疾病是阿爾茨海默氏病。
13、 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述疾病是創(chuàng)傷后心理壓力緊張綜合癥。
14、 如權(quán)利要求ll所述的方法，其中，所述疾病是衰老性記憶力喪失，且對(duì)象年齡大于 65歲。
15、 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述疾病是抑郁癥。
16、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述化合物是5-羥色胺選擇性吸收抑制劑。
17、 一種方法，用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，其患有與對(duì)象的海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生增加有 關(guān)的疾病，其特征在于，所述方法包括給對(duì)象施用治療有效劑量的化合物，該化合物導(dǎo)致對(duì)象海馬齒狀腦回腦血容量減少，減少量比其引起對(duì)象的海馬CA1區(qū)腦血容量 的減少量的百分比要高，從而達(dá)到治療的目的。
18、 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述對(duì)象是人。
19、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述疾病是癲癇。
20、 一種方法，用于抑制哺乳動(dòng)物對(duì)象的與該對(duì)象的海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生增加有關(guān)的疾 病的發(fā)作，其特征在于，所述方法包括給對(duì)象施用預(yù)防有效劑量的化合物，該化合物 導(dǎo)致對(duì)象海馬齒狀腦回腦血容量減少，減少量比其引起對(duì)象海馬CA1區(qū)腦血容量的減 少量的百分比要高，從而達(dá)到抑制疾病發(fā)作的目的。
21、 如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述對(duì)象是人。
22、 如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述疾病是癲癇。
23、 一種方法，用于檢測(cè)一種藥物是否能增加哺乳動(dòng)物對(duì)象海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生，其特 征在于，所述方法包括(a) 檢測(cè)對(duì)象海馬齒狀腦回中一定體積的組織的腦血容量和對(duì)象海馬CA1區(qū)一定體積的 組織的腦血容量；(b) 給對(duì)象施用藥物，其施用方式為允許該藥物進(jìn)入對(duì)象的海馬齒狀腦回和海馬CA1區(qū)。(c) 通過施用已知能引起這種增加的藥物，在一個(gè)足以使得對(duì)象的海馬齒狀腦回的神經(jīng)發(fā) 生產(chǎn)生可檢測(cè)的增殖的時(shí)間段之后，測(cè)定對(duì)象的海馬齒狀腦回該體積的組織腦血容量 與對(duì)象的海馬CA1區(qū)該體積組織腦血容量；及(d) 比較步驟(a)和(c)測(cè)量的腦血容量，從而確定對(duì)象的海馬齒狀腦回是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生特 有的誘導(dǎo)腦血容量增加，該增加表明該藥物增加了對(duì)象海馬齒狀腦回的神經(jīng)發(fā)生。
24、 如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述方法使用磁共振成像測(cè)定腦血容量。
25、 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述腦血容量是測(cè)定1 mm3或更少的一定體積組 織的腦血容量，且測(cè)量腦血容量包括以下步驟(a) 獲得體內(nèi)該體積組織的首次成像；(b) 對(duì)該體積組織施用一種造影劑；(c) 獲得體內(nèi)該體積組織的第二次成像，其中第二次成像在施用造影劑后至少四分鐘獲 得；和(d) 根據(jù)第一次和第二次影像測(cè)定該體積組織的腦血容量。
26、 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述造影劑包含釓。
27、 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述一種測(cè)量關(guān)于一定體積組織的腦血容量的方 法包含以下步驟(a) 獲得體內(nèi)該體積組織的首次磁共振成像；(b) 給對(duì)象通過腹腔給藥施用一種含釓造影劑，給藥劑量大于1 mg/千克體重但少于20 mg/千克體重；(c) 獲得體內(nèi)該體積組織的第二次磁共振成像，其中第二次成像至少在施用造影劑大約 15分鐘后，但不超過大約2小時(shí)獲得；和(d) 根據(jù)第一次和第二次圖像測(cè)定腦血容量。
28、 如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述造影劑是釓噴替酸(gadoliniumpentate)。
29、 如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述對(duì)象是小鼠。
30、 如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述藥物是5-羥色胺選擇性吸收抑制劑。
31、 一種方法，用于測(cè)定一種藥物是否降低哺乳動(dòng)物對(duì)象海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生，包括(a) 測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回一定體積的組織腦血容量，和海馬CA1區(qū)一定體積的組織腦 血容量；(b) 給對(duì)象施用藥物，其施用方式為允許該藥物進(jìn)入對(duì)象海馬齒狀腦回和海馬CA1區(qū)；(c) 通過使用已知有這種降低作用的藥物，在一個(gè)足以產(chǎn)生可檢測(cè)的對(duì)象海馬齒狀腦回 的神經(jīng)發(fā)生減少的時(shí)間段以后，測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回該體積組織的腦血容量和對(duì)象海馬CA1區(qū)該體積組織的腦血容量；和(d) 比較步驟(a)和(c)測(cè)量的腦血容量，從而測(cè)定對(duì)象海馬齒狀腦回是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生 特有的誘導(dǎo)腦血容量下降，該下降表明該藥物減少了對(duì)象海馬齒狀腦回的神經(jīng)發(fā) 生。
32、 如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述方法使用磁共振成像測(cè)定腦血容量。
33、 如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述腦血容量測(cè)定是測(cè)量1 mm3或更少的體積的 組織，且測(cè)量腦血容量包括以下步驟(a) 獲得體內(nèi)該體積的組織的第一次成像；(b) 向該體積的組織施用一種造影劑；(c) 獲得體內(nèi)該體積組織的第二次成像，其中第二次成像在施用造影劑后至少四分鐘 獲得；和(d) 根據(jù)第一次和第二次圖像測(cè)定該體積組織的腦血容量。
34、 如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述造影劑包含釓。
35、 如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述測(cè)量關(guān)于一定體積的組織腦血容量的方法包 含以下步驟(a) 獲得體內(nèi)該體積組織的首次磁共振成像；(b) 給對(duì)象通過腹腔給藥施用一種含釓造影劑，給藥劑量大于約1 mg/千克體重但少于 約20 mg/千克體重；(c) 獲得體內(nèi)該體積組織的第二次磁共振成像，其中第二次成像至少在施用造影劑大約 15分鐘后，但不超過大約2小時(shí)獲得；和(d) 根據(jù)第一次和第二次圖像測(cè)定腦血容量。
36、 如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述造影劑是釓噴替酸(gadoliniumpentate)。
37、 如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述受試者是小鼠。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療方法，主要治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，其患有海馬齒狀腦回神經(jīng)發(fā)生下降導(dǎo)致的疾病，該方法包括給該對(duì)象施用治療有效劑量的化合物，該化合物導(dǎo)致對(duì)象的海馬齒狀腦回中腦血量(CBV)增加，該增加量比該化合物引起對(duì)象海馬CA1區(qū)CBV的增加量的百分比要高，從而達(dá)到治療的目的。
文檔編號(hào)G06K9/00GK101371261SQ200680051022
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2006年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者斯考特·A·斯麥爾 申請(qǐng)人:紐約哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)