一種卵泡刺激素生物活性強度檢測方法
【專利摘要】一種卵泡刺激素生物活性強度檢測方法，包括以下步驟：（1）無卵泡刺激素血清的制備：（2）支持細胞的準備，（3）受檢者血清樣品中卵泡刺激素生物活性強度的分析：將雌二醇的檢測結果在卵泡刺激素標準曲線上反算，查出待測樣本中卵泡刺激素生物活性強度。本發(fā)明的方法（即睪丸細胞法）可以檢出待測樣本中卵泡刺激素生物活性強度，靈敏度高。
【專利說明】
一種卵泡刺激素生物活性強度檢測方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種卵泡刺激素生物活性強度檢測方法。
【背景技術】
[0002] 卵泡刺激素(FSH)是垂體前葉細胞分泌的一種蛋白質激素。在男性，作用于睪丸曲 細精管，可促進精子形成;作用于支持(Sertoli)細胞分泌雌二醇。在女性，促進卵泡顆粒層 細胞增生分化，促進卵巢長大。目前卵泡刺激素的檢測主要是通過酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光 法。這些方法都是直接或間接的檢測卵泡刺激素本身，沒有檢測其生物活性。而唯有生物活 性與臨床癥狀體征相關。同時，由于酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法都是通過免疫反應原理進行 檢測，其檢測的敏感性受到極大限制。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種卵泡刺激素生物活 性強度檢測方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案是，一種卵泡刺激素生物活性強度檢測方 法，通過受檢者血清樣品中的卵泡刺激素(FSH)刺激動物支持（Sertoli)細胞產(chǎn)生雌二醇： 通過測定雌二醇的濃度反算出卵泡刺激素(FSH)的生物活性強度。
[0005] 本發(fā)明具體包括以下步驟： (一) 無卵泡刺激素血清的制備： 將硅橡膠管塞滿雌二醇結晶，皮下植入動物背部4-6周用以抑制動物卵泡刺激素的分 泌;收集40-60毫升動物血清，加入10-20mg的活性炭，在室溫下吸附12小時以上，用濾紙過 濾除去留體激素，濾液存于-40~-80°C冰箱中保存； (二) 支持細胞(Sertoli細胞)的準備： 取動物睪丸2個，去包膜，按4~6.5ml 199培養(yǎng)液/2個睪丸的用量，將睪丸放于199培養(yǎng) 液中，再加入膠原酶III和分離酶II，使培養(yǎng)液中膠原酶III的最終濃度為0.25 - 0.29mg/ ml，分離酶II的最終濃度為0.11 - 0.15μg/ml;在34~37°C孵育15~20分鐘，所得懸浮液用 等量199培養(yǎng)液稀釋，過濾后往濾液中加入聚蔗糖，使聚蔗糖終濃度為11~14g/100mL，將其 在1000~1500g下離心3~20分鐘；將離心所得含支持(Sertoli)細胞的沉淀用4~8mL 199 培養(yǎng)液重懸;然后，加入3-異丁甲基黃嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清，其終濃度分別是:3-異 丁甲基黃嘌呤為0.125 - 0.150mmol/L;牛血清蛋白為0.5 - 0.6g/100mL;胎牛血清為總體積 的0.5 - 2%;用臺盼藍排除法做活細胞計算，得支持(Serto 1 i )細胞懸液； (三) 受檢者血清樣品中卵泡刺激素生物活性強度分析： (A)血清樣品中的卵泡刺激素刺激支持(Sertoli)細胞產(chǎn)生雌二醇： 取70-100yl步驟(二)所得支持細胞懸液，加受檢者血清30-50yl;同時取70-100yl步驟 (二)所得支持(Sertoli)細胞懸液，加30-50yl磷酸鹽緩沖液稀釋過的各濃度的卵泡刺激素 標準品（其中含有與受檢者標本等量但無卵泡刺激素的血清）；將配置好的試劑在37°C，用 5% C02和95%〇2孵育4一6小時后，加入1.5 - 1.6ml含0.01 - 0.012g/1 OOmL硫柳汞明膠的磷 酸鹽緩沖液以終止反應； (B)雌二醇的檢測：將經(jīng)過步驟（A)處理的受檢者血清樣品及標準品按照現(xiàn)有雌二醇 檢測試劑盒或其它方法進行雌二醇濃度的檢測，繪制卵泡刺激素生物活性強度一雌二醇濃 度標準曲線； 步驟（A )中配置的各濃度的卵泡刺激素標準品，其濃度與卵泡刺激素生物活性強度呈 正線性比例關系，即卵泡刺激素標準品濃度越高，卵泡刺激素生物活性強度越高。但研究發(fā) 現(xiàn)，受檢者血清中，卵泡刺激素濃度與活性強度卻不是呈線性比例關系，因此，我們利用此 原理來進行活性強度的檢測。
[0006] (c)卵泡刺激素(FSH)濃度的推算： 將受檢者血清樣品中雌二醇的檢測結果在卵泡刺激素生物活性強度一雌二醇濃度標 準曲線上反算，查出待測樣本中卵泡刺激素生物活性強度。
[0007] 本發(fā)明（即睪丸細胞法)的優(yōu)點:通過采用受檢者血清刺激動物的支持細胞產(chǎn)生雌 二醇，通過測定雌二醇的濃度反算出卵泡刺激素(FSH)的生物活性水平。檢測的是卵泡刺激 素的生物活性，而不是卵泡刺激素本身的含量。檢測結果與臨床癥狀體征緊密相關。而且靈 敏度高。
【具體實施方式】
[0008] 以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0009] 實施例:本實驗以豚鼠支持細胞檢測人FSH為例： (一) 無卵泡刺激素血清的制備： 將0.25cm長（內徑0.062英寸，外徑0.095英寸）的硅橡膠管塞滿雌二醇結晶（雌二醇結 晶，購自西格瑪公司，圣路易斯，密蘇里州，美國），皮下植入豚鼠背部6周用以抑制豚鼠卵泡 刺激素的分泌；收集50毫升豚鼠血清，加入10mg的活性炭，在室溫下吸附12小時，用濾紙過 濾，除去留體激素(即雌二醇等），濾液存于_80°C冰箱中保存； (二) 豚鼠支持細胞的準備： 取體重為550-700g的豚鼠的睪丸2個，去包膜;按6.2ml 199培養(yǎng)液/2個睪丸的用量，將 睪丸放于199培養(yǎng)液(購自西格瑪公司，圣路易斯，密蘇里州，美國）中，再加入膠原酶III和 分離酶II，使培養(yǎng)液中膠原酶III的最終濃度為0.28mg/ml;分離酶II的最終濃度為0.14yg/ ml;在37°C孵育20分鐘，所得懸浮液用等量199培養(yǎng)液稀釋，過濾后往濾液中加入聚蔗糖，使 聚蔗糖終濃度為13g/100mL，將其在1500g下離心10分鐘;將離心所得含支持細胞的沉淀用 8mL 199培養(yǎng)液重懸;然后，加入3-異丁甲基黃嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清。其終濃度分別 是：3_異丁甲基黃嘌呤為0.125 mmol/L;牛血清蛋白為0.5g/100mL;胎牛血清為總體積的 2%;用臺盼藍排除法做活細胞計算，得支持(Sertol i )細胞懸液； (三) 受檢者血清樣品中卵泡刺激素生物活性強度分析 (A)血清樣品中的卵泡刺激素刺激Sertol i細胞產(chǎn)生雌二醇： 取100yl步驟(二)所得支持(36竹〇11)細胞懸液，加受檢者血清50沿；同時取10(^1步驟 (二)所得支持（Sertoli)細胞懸液，加50yl磷酸鹽緩沖液稀釋過的各濃度的卵泡刺激素標 準品（其中含有與受檢者標本等量但無卵泡刺激素的血清）;將配置好的試劑在37°C，用5% C〇2和95%02孵育4小時后，加入1.5ml含0.Olg/lOOmL硫柳汞明膠的磷酸鹽緩沖液以終止反 應； (B)雌二醇的檢測： 將經(jīng)過步驟（A )處理的受檢者血清樣品及標準品按照現(xiàn)有雌二醇檢測試劑盒方法進 行雌二醇濃度的檢測，繪制卵泡刺激素生物活性強度一雌二醇濃度標準曲線； 本實施例是以上海酶聯(lián)生物科技有限公司雌二醇檢測試劑盒進行檢測。以下為按說明 書操作的方法： 1. 實驗前所有的試劑、樣本和微孔板條達到室溫(18~25 °C); 2. 雙蒸水1:40稀釋濃縮的洗液(稀釋的洗液儲存在2~8°C可保存2周）； 3. 每孔加25yl標準品、質控品、樣品(96孔板要求在3分鐘內加樣完畢）。
[0010] 4.每孔加200yl的酶結合物，充分混合10秒鐘，室溫孵育120分鐘。
[0011] 5.洗板:棄去孵育混合物，在吸水紙上拍干。每孔加洗液400yL，洗板之間浸泡時間 為10秒或振蕩5秒，棄去，重復上述操作3次。洗完后在吸水紙上拍干直至沒有潮氣。
[0012] 6.每孔添加lOOiil的底物溶液，混勻，室溫孵育15分鐘。
[0013] 7.每孔加入50yl的終止液，混勻，終止反應。
[0014] 8.在10分鐘內讀取0D值，酶標儀的波長(0D值)使用450 ± 1 Onm。
[0015] 9.結果計算：①計算標準、質控品和樣本的平均0D值。所有的0D值均減去"0"標準 品的平均0D值;②建立標準曲線，使用每一個標準品的0D值與其相對應的濃度值描點作圖。 0D值為縱軸(Y軸），濃度為橫軸(X軸）。③樣品的雌二醇濃度，首先在Y軸上查找0D值，橫向延 伸至標準曲線，以標準曲線上的點拉垂直線與X軸相交，得出雌二醇的濃度值。
[0016] (C)卵泡刺激素 (FSH)濃度的推算： 將受檢者血清樣品中雌二醇的檢測結果在卵泡刺激素生物活性強度一雌二醇濃度標 準曲線上反算，查出待測樣本中卵泡刺激素生物活性強度。
[0017] 結果評價： 將FSH標準品（法瑪西亞普強公司，美國）從1.00 mIU/ml進行系列稀釋為：1.00 mlU/ ml、0.100 mIU/ml、0.010 mIU/ml、0.001 mIU/ml、0.0001 mIU/ml，然后分別用放免法、化學 發(fā)光法以及本發(fā)明的睪丸細胞法進行檢測。每一稀釋濃度進行三次檢測。實驗重復5次。結 果列于表1:
從結果可見，睪丸細胞法檢測人FSH比放免法和化學發(fā)光法敏感100倍。
【主權項】
1. 一種卵泡刺激素生物活性強度檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (一) 無卵泡刺激素血清的制備： 將硅橡膠管塞滿雌二醇結晶，皮下植入動物背部4-6周用以抑制動物卵泡刺激素的分 泌;收集40-60毫升動物血清，加入10-20mg的活性炭，在室溫下吸附12小時以上，用濾紙過 濾除去留體激素，濾液存于-40~-80°C冰箱中保存； (二) 支持細胞的準備： 取動物睪丸2個，去包膜，按4~6.5ml 199培養(yǎng)液/2個睪丸的用量，將睪丸放于199培養(yǎng) 液中，再加入膠原酶III和分離酶II，使培養(yǎng)液中膠原酶III的最終濃度為0.25 - 0.29mg/ ml，分離酶II的最終濃度為0.11 - 0.15μg/ml;在34~37°C孵育15~20分鐘，所得懸浮液用 等量199培養(yǎng)液稀釋，過濾后往濾液中加入聚蔗糖，使聚蔗糖終濃度為11~14g/100mL，將其 在1000~1500g下離心3~20分鐘；將離心所得含支持細胞的沉淀用4~8mL 199培養(yǎng)液重 懸;然后，加入3-異丁甲基黃嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清；用臺盼藍排除法做活細胞計算， 得支持細胞懸液； (三) 受檢者血清樣品中卵泡刺激素生物活性強度分析： (A) 血清樣品中的卵泡刺激素刺激支持細胞產(chǎn)生雌二醇： 取70-100μ1步驟(二)所得支持細胞懸液，加受檢者血清30-50μ1;同時取70-100μ1步驟 (二)所得支持細胞懸液，加30_50μ1磷酸鹽緩沖液稀釋過的各濃度的卵泡刺激素標準品;將 配置好的試劑在3 7 °C，用5 % C 0 2和9 5 % 0 2孵育4 - 6小時后，加入1 · 5 - 1 · 6 m 1含0 · 01 - 0.012g/100mL硫柳汞明膠的磷酸鹽緩沖液以終止反應； (B) 雌二醇的檢測：將經(jīng)過步驟（A )處理的受檢者血清樣品及標準品按照現(xiàn)有雌二醇 檢測試劑盒或其它方法進行雌二醇濃度的檢測，繪制卵泡刺激素生物活性強度一雌二醇濃 度標準曲線； (c)卵泡刺激素濃度的推算： 將受檢者血清樣品中雌二醇的檢測結果在卵泡刺激素生物活性強度一雌二醇濃度標 準曲線上反算，查出待測樣本中卵泡刺激素生物活性強度。2. 根據(jù)權利要求1所述的卵泡刺激素生物活性強度檢測方法，其特征在于，步驟（二） 中，檢測用的是動物的睪丸支持細胞。3. 根據(jù)權利要求1所述的卵泡刺激素生物活性強度檢測方法，其特征在于，步驟（二） 中，3-異丁甲基黃嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清終濃度分別是：3_異丁甲基黃嘌呤為 0 · 125 - 0 · 150mmol/L;牛血清蛋白為0 · 5 - 0 · 6g/100mL;胎牛血清為總體積的0 · 5-2%。
【文檔編號】G01N33/76GK106053861SQ201610608726
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月28日
【發(fā)明人】高常青, 王梅梅, 王姍妮, 支文玲
【申請人】高常青, 王梅梅, 王姍妮