一種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及菊花雜交育種與蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，涉及菊花遠(yuǎn)緣雜交后胚胎在不同發(fā)育時(shí)期利用熒光分光光度法進(jìn)行體外檢測胚胎敗育過程中五種Caspase酶活性的方法，具體地說涉及一種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]菊花原產(chǎn)中國，是我國十大名花和世界四大切花之一，產(chǎn)量居首，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要的地位。目前，國內(nèi)菊花品種高達(dá)數(shù)千個(gè)，按栽培方式可以分為盆栽菊、地被菊、切花菊、造型菊四大類。地被菊多用于園林綠化，栽培管理較粗放，因此就需要有更高的適應(yīng)性和抗性，但多數(shù)觀賞性狀優(yōu)良的品種對栽培條件要求較高，生物和非生物抗性較差，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用的范圍和美化的效果，因此對菊花品種的改良一直是育種工作者研究的重點(diǎn)。目前，運(yùn)用種間，甚至屬間雜交的辦法，將菊屬及其近緣種屬中的優(yōu)良性狀導(dǎo)入栽培菊中是獲得菊花新性狀，提高菊花抗性的最有效途徑之一。
[0003]然而，已有研究表明，菊花遠(yuǎn)緣雜交中經(jīng)常遇到受精前和受精后障礙，導(dǎo)致菊花遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率低，其中受精后障礙更為普遍，即人工雜交后能夠完成受精作用過程，但胚胎發(fā)育過程中遇到障礙，導(dǎo)致細(xì)胞降解、凋亡或死亡，胚胎發(fā)育停止，即胚胎敗育，最終引起雜交失敗。
[0004]目前對于菊花胚胎敗育的研究主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)等方面，如胚胎敗育發(fā)生的時(shí)期和胚胎敗育的組織結(jié)構(gòu)特征等，很少從細(xì)胞衰亡的深層次原因方面開展研究。從形態(tài)結(jié)構(gòu)和組織變化方面能明顯觀察到胚胎細(xì)胞從正常到敗育是一個(gè)細(xì)胞凋亡的過程，在這個(gè)過程中，細(xì)胞器數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)異常并呈退化狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)逐漸收縮，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)加厚等現(xiàn)象。對菊花的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也表明，在菊花敗育胚胎中，參與細(xì)胞衰老、細(xì)胞程序性死亡的基因和蛋白都顯著上調(diào)和增多，盡管有許多信號可以誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，但它們也有共同的特征，其中凋亡時(shí)一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶——Caspase酶的活化就是之一。因此，通過檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase酶的活性，不僅能增加對胚胎敗育過程中導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因的認(rèn)識，更利于從基因和蛋白水平挖掘出控制胚胎敗育的關(guān)鍵基因和蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法及其應(yīng)用。探索菊花胚胎發(fā)育從正常到敗育過程中不同Caspase酶活性的方法，為挖掘控制胚胎敗育的關(guān)鍵基因和蛋白提供了基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法，包括以下步驟:
[0008]I)菊花遠(yuǎn)緣雜交后不同發(fā)育時(shí)期胚珠的獲得
[0009]選擇在人工授粉后會出現(xiàn)胚胎敗育現(xiàn)象的雜交組合進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，人工授粉后12天，取形態(tài)飽滿、發(fā)育正常的正常胚珠;人工授粉后18天，部分胚胎開始敗育，分別取形態(tài)飽滿、發(fā)育正常的胚珠和不飽滿、發(fā)育異常的胚珠;一般情況下，取樣后立即在液氮中預(yù)處理l_2h，然后于_80°C貯存；
[0010]2)采用TCA/丙酮沉淀法分別提取步驟I)中所取得的3個(gè)胚珠樣品的蛋白質(zhì)，得到授粉后12天發(fā)育正常的胚珠蛋白質(zhì)、授粉后18天發(fā)育正常和發(fā)育異常的胚珠蛋白質(zhì)；提取的蛋白質(zhì)于_80°C保存；
[0011]3)將步驟2)中的蛋白質(zhì)預(yù)處理后分別用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并分別用Caspase緩沖液調(diào)整蛋白濃度至lyg/μ? ；
[0012]4)設(shè)空白對照和待測樣品，向空白對照孔中加入熒光底物和Caspase緩沖液，向待測樣品孔中熒光底物、Caspase緩沖液和蛋白質(zhì)樣品，加樣后檢測AMC釋放量，分析熒光強(qiáng)度，確定蛋白質(zhì)樣品中Caspase的酶活性，采用五種熒光底物分別測定蛋白質(zhì)樣品中對應(yīng)的五種Caspase的酶活性。使用多功能酶標(biāo)儀檢測AMC釋放量。
[0013]步驟I)中所述的雜交組合中以栽培菊作為母本，野菊作為父本。所述的栽培菊花為‘雨花落英，，所述野菊為菊花腦，該雜交組合在人工授粉后會出現(xiàn)胚胎敗育的現(xiàn)象。
[0014]步驟3)中蛋白質(zhì)預(yù)處理的過程為:向每個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加Caspase緩沖液并混合均勻，于冰上置放后離心取上清液;優(yōu)選的，于冰上置放30分鐘，離心的條件為:16000g，4°C離心20min。
[0015]所述的五種熒光底物分別為:Ac-YVAD-AMC、Ac-DEVD-AMC、Ac-LEVD-AMC、Ac-VEID-AMC和Ac-LEHD-AMC。
[0016]優(yōu)選的，步驟4)中向空白對照孔加入195μ1Caspase緩沖液，5μ1熒光底物；向待測樣品孔中加入175μ1 Caspase緩沖液，5μ1熒光底物，混勻后再加入20μ1步驟3)中所得的蛋白質(zhì)樣品。
[0017]上述的Caspase緩沖液的配方為:50mM醋酸鈉，1mM L-半胱氨酸，10% (vol/vol)甘油，0.I % (wt/vol，g/ml，100ml Caspase緩沖液中含0.Ig CHAPS)CHAPS，以NaOH或HCl調(diào)pH值至6.0 ο配好后于4°C保存。
[0018]步驟4)中分析熒光強(qiáng)度時(shí)的激發(fā)光波長380nm，發(fā)射光波長為460nm，檢測AMC釋放量時(shí)的檢測溫度為27°C。
[0019]上述的方法在篩選菊花胚胎敗育過程中控制胚胎敗育的關(guān)鍵Caspase酶中的應(yīng)用。
[0020]上述的應(yīng)用，其在于分析正常胚珠和異常胚珠中各種Capsase酶的活化情況，篩選出活化程度異常的Capsase酶即為控制胚胎敗育的關(guān)鍵Caspase酶。
[0021]步驟2)中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)的過程為:取樣品在液氮預(yù)冷的研缽中迅速研磨至粉末狀，加入提取液制成混合液，將混合液裝入離心管中，放在冰上并在搖床上振蕩后，在15，000g，4°C下離心15min，取上清液，向上清液中加入洗滌液I，充分震蕩混勻，-20°C靜置0.5-1.5h;然后在15，000g，4°C下離心15min，棄上清，向沉淀中加洗滌液Π洗滌，-20°C靜置30min以上，重復(fù)用洗滌液Π洗滌I _2次后冷凍干燥沉淀，于_80°C保存。
[0022]上述的提取液為:8M尿素、2%硫脲(g/ml，100ml提取液中含2g硫脲)、1%(ν/ν)Trit1n X_100、50mM NaCl、20mM Tris，pH = 8.0 ;所述的洗滌液I為:_20°C預(yù)冷丙酮加0.07%01'1'(8/1111，1001111洗滌液1中含0.078 DTT)和 10%TCA(g/ml，10ml洗滌液I 中含1gTCA);所述的洗滌液Π為:_20°C預(yù)冷丙酮加0.07%DTT(g/ml，10ml洗滌液Π中含0.07gDTT) ο
[0023]步驟3)中運(yùn)用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量主要包括以下步驟:配制一組濃度分別為0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml ,0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液，測定這組溶液的吸光度，得到蛋白質(zhì)濃度對吸光度的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知蛋白質(zhì)濃度樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)的濃度。
[0024]步驟4)中的五種不同熒光底物分別是:N-Acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp_AMC(Ac-YVAD-AMC),N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AMC(Ac-DEVD-AMC),Ac-Leu-Glu-Val-Asp-AMC(Ac-LEVD-AMC)，Ac-Val-Glu-1le-Asp-AMC(Ac-VEID-AMC)，AC-LEU-GLU-HIS-ASP-AMC(Ac-LEHD-AMC) ο
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026]本發(fā)明針對菊花遠(yuǎn)緣雜交后胚胎敗育的細(xì)胞衰老和凋亡現(xiàn)象，提供了一種快速、準(zhǔn)確鑒定菊花胚胎敗育過程中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵Caspase酶，探索菊花胚胎發(fā)育從正常到敗育過程中不同Caspase酶活性的方法，為研究菊花胚胎敗育的分子機(jī)理，挖掘調(diào)控胚胎敗育的關(guān)鍵基因和蛋白提供了研究基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0027]圖1為正常和敗育胚胎中Caspase-1 ike活性。
[0028]其中，NE12:12天正常胚胎;NE18:18天正常胚胎;AE18:18天敗育胚胎。五種不同的熒光底物分別為:Ac-YVAD-AMC(YVADase) ,Ac-DEVD-AMC(DEVDase) ,Ac-LEVD-AMC(LEVDase) ,Ac-VEID-AMC(VEIDase) ,Ac-LEHD-AMC(LEHDase)。以LEHDase活性的百分比作為相對熒光單位進(jìn)行計(jì)算。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0030]本發(fā)明所提供的利用酶標(biāo)儀體外檢測菊花胚胎敗育過程中不同Caspase活性熒光的方法，其具體實(shí)施示例如下:
[0031]1.遠(yuǎn)緣雜交及取樣
[0032]1.1遠(yuǎn)緣雜交
[0033]以栽培小菊‘雨花落英’(2n= 6x = 54)作母本，選取發(fā)育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時(shí)去雄，即把內(nèi)輪兩性管狀小花全部去除，同時(shí)剪去舌狀花花瓣直到可見柱頭(不傷及柱頭)，并嚴(yán)格進(jìn)行套袋。待母本柱頭伸出并開叉呈現(xiàn)銳角和分泌黏液時(shí)(去雄后3-5d)，于晴天10-15時(shí)收集已套袋的父本菊花腦(2n = 2x= 18)的新鮮花粉，用毛筆對母本進(jìn)行授粉，授粉后立刻對母本雌蕊繼續(xù)套袋隔離。
[0034]1.2胚胎取樣
[0035]授粉后12d時(shí)，剪下一部分已授粉的花序，用尖頭鑷子取下每一朵小花，并取出每一朵小花的胚珠，并去除少部分發(fā)育不良的不飽滿胚珠，最后將發(fā)育正常飽滿的胚珠用錫箔紙包好立即在液氮中預(yù)處理l_2h，然后在_80°C條件下貯存。
[0036]授粉后18d時(shí)，剪下已授粉花序，取下每一朵小花，在體視顯微鏡下能觀察到子房的飽滿程度有差異，并將發(fā)育正常飽滿的和發(fā)育異常不飽滿的子房分開，取出胚珠，分別用錫箔紙包好立即在液氮中預(yù)處理l_2h，然后在-80°C條件下貯存。
[0037]2.蛋白質(zhì)提取
[0038]用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)。具體步驟如下:
[0039]2.1溶液配制
[0040]本方法提蛋白所需的三種溶液分別為:
[0041](I)提取液:8M尿素、2%(g/ml)硫脲、l%(v/v)Trit1n X_100、50mM NaCl、20mMTris，pH=8.0 ；
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