一種同時(shí)檢測(cè)尿液中鈉、肌酐和微量白蛋白的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶法測(cè)定尿液中鈉、肌酐和微量白蛋白含量的方法，以及應(yīng)用該方法 配制而成的同時(shí)檢測(cè)尿液鈉、肌酐和微量白蛋白的干化學(xué)試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鈉的過(guò)度攝入可引起左室肥厚、蛋白尿、動(dòng)脈硬化等，并對(duì)終末期腎衰竭的進(jìn)展， 起著重要的作用。在降低鈉攝入的同時(shí)不但可以降低血壓，也可以減少尿蛋白的排泌。鈉 在維持正常水分的分布和滲透壓方面發(fā)揮了中心作用。腎是調(diào)節(jié)鈉和水分、維持酸堿平衡 的主要器官。鈉可由腎臟自由濾出，其中絕大部分又被重吸收。尿鈉的排泄還與飲食含鈉 鹽和機(jī)體含水狀態(tài)密切相關(guān)。異常結(jié)果：降低：見于腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)、庫(kù)欣綜合征、原 發(fā)性醛固酮增多癥、充血性心力衰竭等。另外，嘔吐、腹瀉、胃腸道手術(shù)造痿、大面積燒傷等 也可使尿鈉排出減少。升高：見于嚴(yán)重的腎盂腎炎、腎小管損傷、糖尿病、急性腎上管壞死 (少尿期）、尿崩癥、腎上腺皮質(zhì)功能減退等。
[0003]目前電解質(zhì)鈉的測(cè)定有化學(xué)法、火焰光度法及離子選擇電極法，隨現(xiàn)代分析技術(shù) 的發(fā)展?；瘜W(xué)法已逐漸被靈敏、快速的儀器法所取代。目前大多數(shù)醫(yī)院用的是火焰光度法 和離子選擇電極法，后者又以其響應(yīng)快（適合于急診）、靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確而越來(lái)越受化驗(yàn)人 員的青睞。近幾年又出現(xiàn)了電解質(zhì)酶法測(cè)定方法，可以同其它常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目一起用全自動(dòng) 分析儀進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確方便，同時(shí)也降低了檢測(cè)成本。酶法測(cè)定鈉試劑盒國(guó)內(nèi)外已有產(chǎn)品上 市，主要是液體雙試劑，但僅有少數(shù)廠家能夠生產(chǎn)，液體試劑很不穩(wěn)定。
[0004] 肌酐（creatinine，Cre)是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，每20g肌肉代謝可產(chǎn)生lmg 肌酐。肌酐主要由腎小球?yàn)V過(guò)排出體外。血中肌酐來(lái)自外源性和內(nèi)源性兩種，外源性肌酐 是肉類食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物；內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物。在肉類食物攝 入量穩(wěn)定時(shí)。身體的肌肉代謝又沒有大的變化，肌酐的生成就會(huì)比較恒定。尿肌酐主要來(lái) 自血液，經(jīng)腎小球過(guò)濾后隨尿液排出體外。尿肌酐檢查可以測(cè)定血液經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)排出的 肌酐含量。尿肌酐值正常范圍：8. 4~13. 25mmol/24h尿或者是40~130mg/dl尿。正常 人尿肌酐的日排出量相當(dāng)穩(wěn)定，基本不受食物蛋白質(zhì)含量和尿量的影響。當(dāng)尿液中肌酐含 量顯著增高或降低時(shí)，則反映出腎功能受到一定程度的損傷。尿肌酐排泄量增高：見于甲狀 腺功能減退、某些消耗性疾病、肝臟疾患、糖尿病、肢端肥大癥、巨人癥、發(fā)熱以及饑餓等。尿 肌酐排泄量減少：見于腎臟功能不全、甲狀腺功能亢進(jìn)、貧血、癱瘓、傷寒、破傷風(fēng)、結(jié)核等消 耗性疾病及肌肉萎縮和肌肉營(yíng)養(yǎng)不良等。因此，檢查尿肌酐含量的變化對(duì)腎功能的變化及 治療可起到重要的參考作用。
[0005] 肌酐常規(guī)生化檢測(cè)方法主要有兩大類，一是化學(xué)法一一堿性苦味酸終點(diǎn)法和堿 性苦味酸二點(diǎn)動(dòng)力學(xué)法，因終點(diǎn)法受血清內(nèi)源性偽陽(yáng)性和偽陰性干擾物的種類太多，這些 干擾物中有的與苦味酸反應(yīng)比肌酐還快，稱為"快干擾物"，如乙酸、乙酰乙酸；有的比肌 酐反應(yīng)慢，稱"慢干擾物"，如葡萄糖、某些蛋白質(zhì)殘基等。除了偽陽(yáng)性干擾外，還存在偽 陰性干擾物，常見的是膽紅素。膽紅素會(huì)使肌酐測(cè)定結(jié)果偏低，當(dāng)膽紅素濃度升至35mg/dl(600ymol/L)時(shí)干擾明顯。在全國(guó)三級(jí)甲等醫(yī)院現(xiàn)已有近半數(shù)臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室將肌酐酶 法應(yīng)用于血/尿肌酐常規(guī)檢測(cè)中。在臨床化學(xué)方法學(xué)發(fā)展中酶學(xué)方法的運(yùn)用，使臨床化學(xué) 測(cè)定技術(shù)有了一個(gè)質(zhì)的飛躍。其核心是酶作用特異性高，使測(cè)定的準(zhǔn)確性、靈敏度、重復(fù)性、 線性測(cè)量范圍等都有了相應(yīng)的大幅度提高，酶法的普及使采用強(qiáng)酸，強(qiáng)堿的化學(xué)方法漸被 淘汰。酶促反應(yīng)條件溫和，隨著商品試劑盒的發(fā)展，再與半自動(dòng)或全自動(dòng)生化分析儀配套， 使檢測(cè)快速，簡(jiǎn)易，高效。近年發(fā)展起來(lái)的肌酐酶法測(cè)定原理，均有商品試劑盒供應(yīng)，其中有 單試劑也有雙試劑的不同劑型和規(guī)格。酶法提高了檢測(cè)的特異性，但并非絕對(duì)特異性。因 此，雖同屬酶法但因具體測(cè)定原理不同和同一測(cè)定原理而選用工具酶的來(lái)源、純度、比活、 特別是工具酶作用特異性的差異也存在不同類型和大小不一的干擾。肌酐酶法分析近年來(lái) 有了迅速發(fā)展，酶法測(cè)定肌酐試劑盒國(guó)內(nèi)外已有產(chǎn)品上市，主要是液體雙試劑，但僅有少數(shù) 廠家能夠生產(chǎn)，液體試劑很不穩(wěn)定。
[0006]尿微量白蛋白是反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的指標(biāo)，是預(yù)示早期的腎臟損害，也反映肌 體血管內(nèi)皮功能紊亂，通過(guò)檢測(cè)尿中的微量白蛋白即可反映血管的功能狀況，如能早期治 療腎臟功能尚可能恢復(fù)。但是如不早期治療，這些患者從微量白蛋白尿發(fā)展到大量蛋白尿， 預(yù)示患者的腎臟功能惡化且不可逆轉(zhuǎn)。因此通過(guò)檢測(cè)微量白蛋白尿預(yù)測(cè)早期腎臟損害和血 管功能，進(jìn)行早期干預(yù)性治療，對(duì)于改善高血壓或糖尿病所導(dǎo)致的腎臟損害具有重要的臨 床意義。
[0007]白蛋白檢測(cè)方法有膠體金法、免疫比濁法、染料親和化學(xué)方法等，目前相關(guān)產(chǎn)品均 在國(guó)內(nèi)外有產(chǎn)品上市，膠體金法需要專業(yè)人員操作，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而免疫比濁法檢測(cè)成本 高，需要配套儀器，最簡(jiǎn)單的方法是染料親和法，尿液中的白蛋白與磺酞類染料反應(yīng)形成藍(lán) 色產(chǎn)物，呈色深度與尿液中的白蛋白濃度成正比，只需將染料固相在層析膜上，通過(guò)儀器或 肉眼進(jìn)行判讀。
[0008] 綜上，通過(guò)檢測(cè)尿鈉的排泄來(lái)預(yù)測(cè)水鈉潴留、腎小球排泄情況及鈉鹽的攝入情況， 對(duì)腎源性高血壓特別是容量依賴型高血壓有較好的預(yù)測(cè)作用；通過(guò)檢測(cè)尿微量白蛋白的 排泄來(lái)預(yù)測(cè)腎臟是否有損傷，腎臟血管是否發(fā)生病變改變了腎臟濾過(guò)蛋白質(zhì)（尤其是白蛋 白）的功能；微量白蛋白尿也是腎臟和心血管系統(tǒng)改變的早期指征。對(duì)于預(yù)防腎源性高血 壓有重要作用。目前還沒有能夠同時(shí)檢測(cè)尿液中鈉、肌酐和微量白蛋白的干化學(xué)試劑盒或 類似方法的應(yīng)用，為了適應(yīng)基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)尿液中鈉、肌酐和微量白蛋白的非定量檢測(cè)的 需要以及檢測(cè)單位檢測(cè)硬件配備不足的問(wèn)題，迫切需要提供一種快速、簡(jiǎn)便、半定量檢測(cè)尿 液中鈉、肌酐和微量白蛋白的半定量檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)尿液鈉、肌酐和微量白蛋白的干化學(xué)試劑盒。
[0010] 本發(fā)明提供的一種同時(shí)檢測(cè)尿液中鈉、肌酐和微量白蛋白的試劑盒，包括：（1)具 有鈉反應(yīng)孔、肌酐反應(yīng)孔和微量白蛋白反應(yīng)孔的反應(yīng)基板；
[0011] (2)鈉稀釋液、肌酐稀釋液；
[0012] (3)具有不同濃度鈉離子標(biāo)準(zhǔn)顯色、不同濃度肌酐標(biāo)準(zhǔn)顯色和不同濃度微量白蛋 白標(biāo)準(zhǔn)顯色的標(biāo)準(zhǔn)比色板。
[0013] 所述鈉反應(yīng)孔從孔底部起依次放有底物墊和酶墊；
[0014] 所述底物墊由底物溶液滴加在載體上制備而成；底物溶液以100-1000mm〇l/LpH 7. 5-9. 0的緩沖液為溶劑，含有0. 001-0. 01g/mL的β-半乳糖苷酶底物、20-80mmol/L的穴 醚、0. 005% -50%的穩(wěn)定劑和0. 005% -50%的表面活性劑；
[0015] 所述酶墊由酶溶液滴加在載體上制備而成；酶溶液以100-1000mm〇l/LpH 7. 0-9. 0的緩沖液為溶劑，含有200-3000U/mL的β-半乳糖苷酶和0. 01-100g/L酶穩(wěn)定劑。
[0016] 優(yōu)選地，所述酶溶液以100-1000mmol/LpH7. 0-9. 0的緩沖液為溶劑，含有 500-1500U/mL的β-半乳糖苷酶和10-20g/L穩(wěn)定劑。
[0017] 上述緩沖液均可選自磷酸鉀緩沖液、Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液的一種或幾 種。
[0018] 優(yōu)選地，底物溶液的緩沖液為800-1000mmol/LpH8. 0-9. 0的Tris-HCl緩沖液；酶 溶液的緩沖液為100_200mmol/LpH7. 0-8. 0的Tris-HCl緩沖液。
[0019] 底物墊中含有的β-半乳糖苷酶底物為0-硝基-β-D-吡喃糖苷（0NPG)、 5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（x-gal)、氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG)、 PNPG、IPTG。
[0020] 優(yōu)選地，β-半乳糖苷酶底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷 (x-gal)和氯酸紅-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG)。
[0021] 底物墊中含有的穴醚為4, 7, 13, 16, 21-五氧雜-1，10-二氮雜雙環(huán)[8. 8. 5]廿三 烷、18-Crown-8或者是15-Crown-5中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述穴醚為4, 7, 13, 16, 21-五 氧雜-1，10-二氮雜雙環(huán)[8. 8. 5]廿三烷（Kryptofix)
[0022] 底物墊中含有的穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖T70、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋 白、甘露醇、乳糖、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或幾種，優(yōu)選穩(wěn)定 劑為蔗糖和D-海藻糖；
[0023] 底物墊中含有的表面活性劑為吐溫80、吐溫20、TritonΧ-100、ΝΡ40或山梨醇中 的一種或多種，優(yōu)選表面活性劑為吐溫80。
[0024] 酶墊中含有的穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖T70、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、 甘露醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖、阿拉伯糖醇、α-乳糖、馬來(lái)酸、酒石酸或者檸檬酸中的 一種或多種，優(yōu)選穩(wěn)定劑為α-乳糖和葡聚糖Τ70。
[0025] 本發(fā)明提供的一種同時(shí)檢測(cè)尿液中鈉、肌酐和微量白蛋白的試劑盒中的反應(yīng)基板 中的肌酐反應(yīng)孔從孔底部起依次放有下墊和上墊；
[0026] 所述下墊由下墊溶液滴加在載體上制備而成；下墊溶液以水為溶劑，含有 10-2000U/mL的過(guò)氧化物酶、10-1000U/mL肌酐酰胺水解酶，0. 1 % -10 %的顯色劑1， 5-500臟〇1/1口!16.0-8.0的緩沖液，0.005%-50%的穩(wěn)定劑；
[0027] 優(yōu)選地，下墊溶液中過(guò)氧化物酶活力為800-1500U/mL，肌酐酰胺水解酶活力為 500-1000U/m