膠體考馬斯染劑的制作方法
【專利說明】膠體考馬斯染劑
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月12日提交的美國臨時專利申請第61/777, 801號的優(yōu)先 權，該文通過引用納入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 可采用考馬斯亮藍G-250對電泳凝膠進行染色至確定的終點，因為所述染料可以 膠體形式制備，其不進入供染色的凝膠，而是被該凝膠中的蛋白質條帶吸附，用充足的時間 來擴散遍及所述條帶將條帶飽和。因為所述膠體形式不進入凝膠本身，使得背景非常低，由 此降低對脫色步驟的需求，所述脫色步驟可導致染色的蛋白質條帶強度下降。
[0005] 通常采用2-部分（two-part)染劑對電泳凝膠進行染色。所述2-部分染劑需在每 次使用之前新鮮配制，以具有所需性能（例如，低背景）。2-部分染劑會快速形成沉淀物， 這使溶液不可使用-通常在24小時內。2-部分染劑制劑還基于甲醇（作為醇）的使用。 簡單地用乙醇替代甲醇將使所述制劑的性能不可接受。

【發(fā)明內容】

[0006] 提供用于對電泳凝膠中的蛋白質染色的穩(wěn)定化的膠體染劑制劑。
[0007] 在一些實施方式中，所述制劑包含：考馬斯亮藍；表面活性劑；乙醇；硫酸銨；和 可任選的正磷酸。在一些實施方式中，所述考馬斯亮藍是考馬斯亮藍G-250或考馬斯亮藍 R-250。在一些實施方式中，所述表面活性劑是泊洛沙姆407。在一些實施方式中，所述制 劑包含0.01-0. 05%重量/重量的考馬斯亮藍；0.01-0. 10%重量/重量的泊洛沙姆407 ; 10-20 %重量/重量的乙醇；5_10 %重量/重量的硫酸銨；和0. 5_5 %的正磷酸。
[0008] 在一些實施方式中，所述制劑包含考馬斯亮藍染料；表面活性劑；乙醇或甲醇；和 硫酸銨。在一些實施方式中，該制劑還包含正磷酸。在一些實施方式中，所述制劑包含乙醇 (并且在一些進一步實施方式中，不包含甲醇）。在一些實施方式中，所述制劑包含甲醇（并 且在一些進一步實施方式中，不包含乙醇）。
[0009] 在一些實施方式中，所述考馬斯亮藍以式1表示。在一些實施方式中，所述考馬斯 亮藍以式2表示。
[0010] 在一些實施方式中，所述表面活性劑是含聚氧乙烯的表面活性劑。在一些實施方 式中，所述表面活性劑是泊洛沙姆表面活性劑。在一些實施方式中，所述表面活性劑是泊洛 沙姆407。
[0011] 在一些實施方式中，所述制劑包含：0.01-0. 05%重量/重量的考馬斯亮藍染料； 0. 01-0. 10%重量/重量的表面活性劑；10-20%重量/重量的乙醇；5-10%重量/重量的 硫酸銨；和〇. 5-5%正磷酸。在一些實施方式中，所述表面活性劑是含聚氧乙烯的表面活性 劑。在一些實施方式中，所述表面活性劑是泊洛沙姆表面活性劑。在一些實施方式中，所述 表面活性劑是泊洛沙姆407。
[0012] 還提供采用本文所述的制劑對電泳凝膠中的蛋白質染色的方法。在一些實施方式 中，所述方法包括：使所述凝膠與本文所述的權利要求1~10中任一項所述的制劑在一定 條件下接觸充足的時間以對該凝膠中的蛋白質染色，和，檢測所述凝膠中至少一個區(qū)域內 蛋白質的存在或量。在一些實施方式中，所述制劑在所述接觸之前儲存至少三天。
[0013] 還提供儲存用于電泳凝膠中蛋白質的膠體制劑的方法。在一些實施方式中，所述 方法包括將本文所述的膠體制劑儲存至少3 (例如，至少7、10、15、30或更多）天。
[0014] 還提供包含本文所述的膠體制劑的試劑盒。
[0015] 附圖簡述
[0016] 圖1說明染色制劑中普流羅尼克F-127的不同濃度（0. 5% -0. 05% )對染色強度 的影響。
[0017] 圖2說明染色制劑中普流羅尼克F-127較低的不同濃度（0. 05%及以下）對染色 強度的影響。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 引言
[0020] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在所述制劑中納入表面活性劑和乙醇可生成穩(wěn)定的膠體考馬斯 亮藍染劑。所得的膠體制劑i)保質期長，ii)環(huán)境友好（采用乙醇的低環(huán)境影響配方），和 iii)比2-部分染劑更易使用，因為采用所述制劑所需的步驟較少。本文所述的制劑的性能 與傳統(tǒng)的保質期短的2-部分膠體考馬斯染劑（例如，見述于Neuhoff等，ELECTROPHORESIS 9 (6) : 255 - 262 (1988))基本相同。
[0021] 本文所述的制劑具有至少兩個顯著方面。首先，采用乙醇作為醇?？墒挂掖家约?硫酸銨的量最優(yōu)化以增加考馬斯劑在EtOH對比MeOH中的溶解度，由此允許穩(wěn)定的膠體考 馬斯制劑。
[0022] 第二，添加表面活性劑（例如，普流羅尼克?F_127 ( -般稱為泊洛沙姆407))來使 所述制劑穩(wěn)定并防止沉淀，由此允許長期穩(wěn)定保質的1-部分溶液。
[0023] 制劑組分
[0024] 用于對蛋白質染色的膠體染料可用于本文所述的制劑。考馬斯亮藍是一類染料的 商品名，此類染料通常用于蛋白質染色。示例包括考馬斯亮藍G-250和考馬斯亮藍R-250。 考馬斯亮藍R-250以式1表示。
[0026] 考馬斯亮藍G-250(CAS編號6104-58-1)與R-250不同，其包含兩個甲基基團，如 下方式2所示。 γν ifiHmrm A 說明書 3/5 頁
[0028] 考馬斯亮藍R_250(CAS編號6104-59-2)的通用名包括二甲花青亮藍G，以及 C. I. 42655、C. I.酸性藍90、艷靛青G，和艷吲哚青G。
[0029] 如上所述，在所述制劑中納入表面活性劑使所述試劑穩(wěn)定（例如，無顯著沉淀）， 允許所述制劑在使用前的長時間儲存（例如，基于加速的保質期研究，至少兩年）。鑒于 所述制劑的穩(wěn)定性，所述制劑可被制備作為" 1-部分"制劑（即，全部染色成分存在于同一 溶液中），由此避免了當前業(yè)內實行的由"2-部分"制劑制備新鮮染料溶液的步驟。并不 意在限制可用于所述制劑中的表面活性劑的范圍，在一些實施方式中，所述表面活性劑是 含聚氧丙烯的表面活性劑，例如泊洛沙姆表面活性劑。泊洛沙姆表面活性劑的特點是，其 具有聚氧丙烯（聚（環(huán)氧丙烷））中央疏水鏈，側連兩條聚氧乙烯（聚（環(huán)氧乙烷））親水 鏈。因為該聚合物嵌段部分的長度可定制，存在多種性質稍有差異的不同的泊洛沙姆。泊 洛沙姆共聚物的常用命名采用"P"(表示泊洛沙姆）后跟三個阿拉伯數(shù)字，前兩個阿拉伯數(shù) 字X 100即是聚氧丙烯核心的大致分子量，最末阿拉伯數(shù)字X 10即是聚氧乙烯的含量百分 比（例如，P407 =這樣的泊洛沙姆，其具有4, 000g/mol的聚氧丙烯分子量和70%的聚氧 乙烯含量）。對于普流羅尼克和辛普羅尼克（Synperonic)泊洛沙姆商品名，這些共聚物的 代稱（coding)以一個字母起始以確定其在室溫下的物理形式（L =液態(tài)，P =糊狀，F(xiàn) =片 狀（固態(tài)））后跟兩個或三個阿拉伯數(shù)字，在該數(shù)字標記中，首個阿拉伯數(shù)字（三個阿拉伯 數(shù)字中的前兩位）乘以300,指示疏水部分的大致分子量；而最末阿拉伯數(shù)字XlO即是聚 氧乙烯的含量百分比（例如，L61指示l，800g/mol的聚氧丙烯分子量和10%的聚氧乙烯 含量）。在該給出示例中，泊洛沙姆181(P181)=普流羅尼克L61和辛普羅尼克PE/L 61。 示例性泊洛沙姆表面活性劑包括但不限于，普流羅尼克F-127、F-108、F-68、P-105、L-35和 P-123。在其它實施方式中，所述表面活性劑是含聚氧乙烯的表面活性劑，即，包含一個或多 個聚氧乙基基團的表面活性劑。
[0030] 所述制劑將包含醇，例如，乙醇或甲醇。甲醇曾被用于染劑制劑，因為采用乙醇的 標準制劑具有不可接受的性能問題。然而，如本文中所討論的，表面活性劑的納入允許包含 乙醇來代替甲醇。鑒于甲醇的環(huán)境和身體危險性，在許多情況下優(yōu)選