定性定量檢測(cè)大豆脂肪酸組分的氣相色譜方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種定性定量檢測(cè)大豆脂肪酸組分的氣相色 譜方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是世界植物油的主要來(lái)源之一。脂肪酸是大豆油脂的主要成分，其含量約占 脂肪總量的90%。脂肪酸按性質(zhì)可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其中飽和脂肪酸包括 棕櫚酸和硬脂酸，不飽和脂肪酸包括油酸、亞油酸和亞麻酸。大豆油脂中的不飽和脂肪酸 有降低患心血管疾病的作用，可降低人體中的有害膽固醇，但多不飽和脂肪酸，尤其是亞麻 酸，容易被脂肪氧化酶氧化，從而產(chǎn)生豆腥味。改良大豆脂肪酸組分，提高其抗氧化性是近 年來(lái)大豆脂肪酸育種的主要目標(biāo)。
[0003] 由于研究目的不同，不同研究者所采用的脂肪酸甲酯化提取方法存在差異，所使 用的提取和甲酯化試劑也各不相同。大多數(shù)研究者采用索氏提取法和超臨界CO 2萃取法，從 不同樣品中提取脂肪酸，但耗時(shí)較長(zhǎng)，步驟繁瑣。大豆脂肪酸組分的檢測(cè)方法主要包括近紅 外反射光譜分析法（NIRS)、高效液相色譜（HPLC)法和氣相色譜法（GC)，而應(yīng)用最為廣泛的 當(dāng)屬氣相色譜法。目前，針對(duì)大豆脂肪酸的檢測(cè)主要以相對(duì)百分比含量測(cè)定為主，此類(lèi)方法 較為簡(jiǎn)單，沒(méi)有以脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品作為參照，無(wú)法準(zhǔn)確反映籽粒中脂肪酸組分的真實(shí)含量， 因?yàn)橄鄬?duì)定量的結(jié)果只是以總脂肪酸含量的百分比形式呈現(xiàn)的，不能表示各組分的實(shí)際含 量，例如每克豆粉中究竟含有多少微克的某種脂肪酸。此外，由于不同品種總脂肪酸含量的 差異，如果比較兩個(gè)大豆品種的某個(gè)脂肪酸組分含量水平，只用相對(duì)百分比就不準(zhǔn)確。因 此，需要研究一種對(duì)大豆脂肪酸組分絕對(duì)定量的方法，從而準(zhǔn)確檢測(cè)大豆品種中脂肪酸的 種類(lèi)和含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為滿足上述領(lǐng)域的需求，本發(fā)明提供一種定性定量檢測(cè)大豆脂肪酸組分的氣相色 譜方法，該方法能準(zhǔn)確同時(shí)檢測(cè)大豆脂肪中各種脂肪酸的含量，準(zhǔn)確性高，安全性好，操作 簡(jiǎn)便快捷，容易掌握和推廣。
[0005] 本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0006] -種大豆總脂肪酸的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0007] (1)將大豆粉裝入離心管中，加入正己烷，60°C加熱浸提，間隔充分搖勻；
[0008] (2)加入甲醇鈉溶液進(jìn)行甲酯化，充分搖勻；
[0009] (3)加入飽和氯化鈉，靜置，取上清液。
[0010] 進(jìn)一步地，所述大豆粉、正己烷、甲醇鈉溶液和飽和氯化鈉溶液的用量比例如下： 30.0 mg大豆粉：1. OmL正己烷：1. OmL甲醇鈉：300 μ L飽和氯化鈉，
[0011] 其中甲醇鈉溶液的濃度為0. 5mol/L，所述60°C加熱浸提的時(shí)長(zhǎng)為20分鐘。
[0012] -種定性定量檢測(cè)大豆脂肪酸組分的氣相色譜方法，包括如下步驟：
[0013] (1)獲取五種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：
[0014] 所述五種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)分別為棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞 油酸甲酯和亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的梯度濃度，
[0015] 所述五種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為采用氣相色譜法檢測(cè)梯度濃度的各種標(biāo)準(zhǔn) 品所得的對(duì)應(yīng)的色譜峰面積值；
[0016] (2)采用上述任一提取方法提取待測(cè)樣品的總脂肪酸；
[0017] (3)對(duì)待測(cè)樣品的總脂肪酸進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜峰保留 時(shí)間判斷待測(cè)樣品所形成的色譜峰包括哪些脂肪酸的色譜峰，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定性定量分 析待測(cè)樣品中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的含量。
[0018] 進(jìn)一步地，所述五種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線中，所述棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯的濃度 梯度范圍為0.2-20mg/mL，所述油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯的濃度梯度范圍為 0· 2_40mg/mL。
[0019] 所述獲取五種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及曲線方程指采用已經(jīng)制作好的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，或 者進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和制作。
[0020] 所述氣相色譜檢測(cè)的條件為：色譜柱：RTX-Wax 30mX 0. 25_X 0. 25 μ m ;自 動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1 μ L ;采用分流進(jìn)樣，分流比：40 :1 ;進(jìn)樣口溫度：250°C ;載氣：氮?dú)猓?541111^.111；[111;氫氣，401]11^.111；[111;空氣，4001]11^.111；[11 1;采取程序升溫的方式：180<€保持 I. 5min，以 10°C · min 1 升到 210°C，保持 2min，然后以 5°C · min 1 升到 220°C保持 5min ;檢 測(cè)器：火焰離子檢測(cè)器，溫度為300°C海個(gè)樣品檢測(cè)20min，樣品檢測(cè)之間間隔2min。
[0021] 本發(fā)明提供的大豆脂肪酸提取方法為加熱甲酯化法，與索氏抽提、0)2超臨界法 等傳統(tǒng)方法相比，操作簡(jiǎn)便快捷，可檢測(cè)微量樣品，提高大豆脂肪酸提取效率；其次，甲酯化 試劑采用簡(jiǎn)易提取法中較安全的甲醇鈉替代劇毒的三氟化硼甲醇，在保證甲酯化效果的同 時(shí)，提高了檢測(cè)過(guò)程的安全性。與簡(jiǎn)易甲酯化提取法相比，本發(fā)明的加熱甲酯化法提取大豆 脂肪酸可使大豆脂肪酸的甲酯化較為完全，從而準(zhǔn)確檢測(cè)出待測(cè)大豆樣品中各種脂肪酸的 絕對(duì)含量。與快速氣相色譜分析法相比，本發(fā)明方法中脂肪酸提取液由正己烷代替石油醚 等混合物，減少了測(cè)定樣品中雜質(zhì)的種類(lèi)，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0022] 本發(fā)明還提供定性定量檢測(cè)大豆脂肪酸組分的氣相色譜方法，以大豆5種脂肪酸 甲酯（棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯）為標(biāo)準(zhǔn)樣品，在制定 5種脂肪酸甲酯組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的基礎(chǔ)上，采用本發(fā)明的加熱甲酯化法提取待 測(cè)樣品中的總脂肪酸，對(duì)其進(jìn)行氣相色譜分析，根據(jù)5種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間和峰 面積對(duì)各個(gè)脂肪酸組分進(jìn)行定性定量分析。如圖1所示，棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲 酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯的出峰時(shí)間分別為5. 53、7. 87、8. 15、8. 77和9. 72min，據(jù)此可 對(duì)不同脂肪酸組分進(jìn)行定性。依據(jù)表1中相應(yīng)各組分公式計(jì)算大豆樣品中各脂肪酸組分的 絕對(duì)含量。
[0023] 近紅外光譜法雖然方便快捷，無(wú)需對(duì)樣品破壞性處理，但它是一種間接的分析技 術(shù)，需利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立預(yù)測(cè)模型，然后通過(guò)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)待測(cè)樣品的組分含量。本 發(fā)明采用五種脂肪酸甲酯作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，可以準(zhǔn)確地定性不同脂肪酸組分，結(jié)合氣相色譜 進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)，并制作脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，其決定系數(shù)（R 2)均大于0.99。在定性的基 礎(chǔ)上僅通過(guò)公式計(jì)算可得大豆樣品各脂肪酸組分絕對(duì)含量，提高了脂肪酸試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確 性。本發(fā)明方法可以利用較少的脂肪酸樣品，定性和定量地檢測(cè)不同脂肪酸組分，實(shí)現(xiàn)了脂 肪酸含量檢測(cè)計(jì)算方法的標(biāo)準(zhǔn)化，為大豆脂肪酸的深入研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)大豆脂肪酸檢 測(cè)及育種具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1.不同脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品和豆粉中脂肪酸甲酯組分的氣相色譜圖譜，
[0025] 其中，圖14、1-8、1_(：、1-0、11和14分別代表棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲 酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯和豆粉所測(cè)得脂肪酸甲酯的氣相色譜圖譜。
[0026] 圖2.不同脂肪酸甲酯的氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0027] 其中，圖2-A、2-B、2-C、2-D和2-E分別代表棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞 油酸甲酯和亞麻酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)線性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，需要理解的是，下述實(shí)施例僅作為 解釋和說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 大?品種：
[0030] 4個(gè)，包括3個(gè)低油份含量的大豆品種，魯黑豆2號(hào)（LHD2)、南匯早黑豆（NHZ)、中 黃13 (ΖΗ13)和1個(gè)高油份含量的大豆品種，中黃35 (ΖΗ35)。2014年4個(gè)大豆品種種植于 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所昌平試驗(yàn)基地。
[0031] 實(shí)驗(yàn)試劑：
[0032] 正己烷（氣相色譜專(zhuān)用）、甲醇鈉（0. 5mol/L，分析純），購(gòu)自于華夏遠(yuǎn)洋公司。五種 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品：棕櫚酸甲酯（methyl palmitate)、硬脂酸甲酯（methyl stearate)、 油酸甲酯（methyl oleate)、亞油酸甲酯（methyl Iinoleate)和亞麻酸甲酯（methyl linolenate)，均購(gòu)自于sigma公司。
[0033] 實(shí)驗(yàn)儀器：
[0034] 采用島津GC-2010氣相色譜儀對(duì)大豆脂肪酸進(jìn)行定性定量檢測(cè)。
[0035] 采用近紅外光譜分析儀（Bruker)檢測(cè)大豆樣品的粗脂肪含量。
[0036] 采用近紅外光譜儀（MTRIX-I)分析大豆籽粒中粗脂肪含量。
[0037] 實(shí)施例1、大豆脂肪酸組分的定量檢測(cè)方法
[0038] 步驟1、提取大豆總脂肪酸
[0039] 采用加熱甲酯化法提取大豆脂肪酸，其步驟如下：
[0040] (1)將大豆研磨成粉末，準(zhǔn)確稱(chēng)取大豆粉30.0 mg，放入2. OmL的離心管中，加入 1.0 mL正己烷，60°C加熱浸提20min，間隔充分搖勻；
[0041] (2)然后加入1.0 mL 0. 5mol/L甲醇鈉溶液進(jìn)行甲酯化，充分搖勻lOmin，使其充分 甲酯化；
[0042] (3)加入300 μ L飽和氯化鈉，靜置，取上清液放置于色譜專(zhuān)用樣品瓶中，4°C冰箱 保存待檢測(cè)。
[0043] 步驟2、制作脂肪酸甲酯的氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0044] 采用棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油