一種高效液相色譜法測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種高效液相色譜法測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，所屬技術(shù)領(lǐng)域:二、生物與新醫(yī)藥技術(shù)(七)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)4、農(nóng)產(chǎn)品精深加工與現(xiàn)代儲(chǔ)運(yùn):農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評(píng)價(jià)、快速檢測(cè)、全程質(zhì)量控制等技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]HPLC是一項(xiàng)高壓、高效、高靈敏度的分離技術(shù)，可用于分離分析高沸點(diǎn)、相對(duì)分子量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、化工、高分子、生物、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
[0003]齊墩果酸、熊果酸主要存在于亞麻油及其油腳中，為五環(huán)三萜類化合物；性質(zhì)相近，難以分離；是一種活性成分；有保肝、消炎、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫和抑制免疫(免疫雙向調(diào)解作用)等作用。
[0004]目前這2種物質(zhì)還只能從植物中提取，無法化學(xué)合成；檢測(cè)方法有分光光度法、薄層掃描法和高效液相色譜法，前者通常采用顯色劑顯色后測(cè)定，由于他們性質(zhì)相近，分光光度法通常測(cè)得其三萜類總量，方法缺乏專屬性；而普通的薄層色譜很難使OA和UA分離；相比較而言，HPLC較容易實(shí)施兩者的分離，且紫外檢測(cè)相對(duì)于蒸發(fā)光散射檢測(cè)有較好的重現(xiàn)性。在現(xiàn)有可查范圍內(nèi)，利用HPLC同時(shí)測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸未見報(bào)道，采用反相高效液相色譜法二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定了亞麻油中的齊墩果酸和熊果酸含量，旨在為評(píng)價(jià)亞麻油的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高效液相色譜法測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，從而準(zhǔn)確測(cè)定其含量，方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]一種高效液相色譜法測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0008](I)對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.20mg、熊果酸對(duì)照品8.54mg，分別置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品貯備液。
[0009](2)樣品溶液的處理:取亞麻油樣品約1.0-2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，60-90°C索式提取l_4h，浸漬0.5_lh，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；
[0010](3)將濾液過0.40-0.50 μπι微孔濾膜后，在實(shí)驗(yàn)色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定，得測(cè)定數(shù)值；所述的實(shí)驗(yàn)色譜條件為:色譜柱:C18柱，250X4.6mm，5ym;流動(dòng)相:265 %甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流動(dòng)相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng):210nm ;流動(dòng)相流速為0.6mL/min,柱溫20°C，進(jìn)樣體積為20 μ L ;
[0011](4)按照外標(biāo)法計(jì)算亞麻油中齊墩果酸、熊果酸的含量。
[0012]所述的高效液相色譜法測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于:所述的實(shí)驗(yàn)色譜條件為:色譜柱:Cj±，250X4.6mm，5 μπι;流動(dòng)相:265%甲醇-35%水-0.1%冰乙酸-0.05%三乙胺，其中，流動(dòng)相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng):210nm ;流動(dòng)相流速為0.6mL/min，柱溫20°C，進(jìn)樣體積為20 μ L。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明可準(zhǔn)確測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸的含量，方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好。
【附圖說明】
[0014]圖1本發(fā)明實(shí)施例2對(duì)照品中齊墩果酸、熊果酸的色譜圖，a齊墩果酸、b熊果酸。
[0015]圖2本發(fā)明實(shí)施例2亞麻油中齊墩果酸、熊果酸的色譜圖，a齊墩果酸、b熊果酸。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1:高效液相色譜法測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，包括以下步驟:
[0017](I)對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.20mg、熊果酸對(duì)照品8.54mg，分別置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品貯備液。
[0018](2)樣品溶液的處理:取亞麻油樣品約0.5-1.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，60-90°C索式提取l_4h，浸漬0.5_lh，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；
[0019](3)將濾液過0.40-0.50 μπι微孔濾膜后，在實(shí)驗(yàn)色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定，得測(cè)定數(shù)值；所述的實(shí)驗(yàn)色譜條件為:色譜柱:C18柱，250X4.6mm，5ym;流動(dòng)相:265 %甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流動(dòng)相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng):210nm ;流動(dòng)相流速為0.6mL/min,柱溫20°C，進(jìn)樣體積為20 μ L ;
[0020](4)按照外標(biāo)法計(jì)算亞麻油中齊墩果酸、熊果酸的含量。
[0021]所述的實(shí)驗(yàn)色譜條件為:色譜柱:C18柱，250X4.6mm，5ym;流動(dòng)相:265 %甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流動(dòng)相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng):210nm ;流動(dòng)相流速為0.6mL/min，柱溫20°C，進(jìn)樣體積為20 μ L。
[0022]實(shí)施例2:本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):
[0023]I儀器與試劑
[0024]儀器:1100高效液相色譜儀(包括G1311A泵、G1322脫氣機(jī)、G1313AZ自動(dòng)進(jìn)樣器、G1313A柱溫箱、G1315 DAD ;Agilent 1100 ChemStat1n) ;BP221D 電子天平(Sartorius公司)；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；石英亞沸高純水提取器(江蘇金城教學(xué)儀器廠)。
[0025]試劑:齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品(110709-200505、110742-200516，供含量測(cè)定用)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，亞麻油(岳西縣光圣茶油有限公司菊盛牌亞麻油)其他試劑均為分析純。
[0026]流動(dòng)相配制:分別按照265mL甲醇、35mL水、0.05mL冰乙酸和0.05mL三乙胺比例配置流動(dòng)相。
[0027]齊墩果酸、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.20mg、熊果酸對(duì)照品8.54mg，分別置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品IC備液。
[0028]樣品溶液的處理:取亞麻油樣品約0.5-1.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，60-90°C索式提取l_4h，浸漬0.5_lh，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，過0.45 μ m微孔濾膜后，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定。
[0029]2含量測(cè)定方法的建立
[0030]2.1波長(zhǎng)選擇
[0031]齊墩果酸與熊果酸在206nm處有最大吸收，本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器，對(duì)同一亞麻油供試液在205、210、215和220nm處進(jìn)行多波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果顯示除205nm有溶劑干擾和末端吸收外，其它波長(zhǎng)處分離均較為理想，但215nm和220nm均較210nm波長(zhǎng)處響應(yīng)強(qiáng)度低，檢測(cè)靈敏度低，故本實(shí)驗(yàn)采用210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0032]2.2流動(dòng)相的選擇
[0033]對(duì)甲醇-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰乙酸、甲醇-乙腈-水、甲醇-水-冰乙酸-三乙胺等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，通過配比調(diào)整，發(fā)現(xiàn)甲醇-水-冰乙酸-三乙胺(265: 35: 0.1: 0.05)在確定的色譜系統(tǒng)中容易獲得滿意且穩(wěn)定的分離結(jié)果；流速減慢利于分離，本實(shí)驗(yàn)流速為0.6ml/min。
[0034]2.3定性試驗(yàn)
[0035]利用相對(duì)保留時(shí)間法及添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)法定性。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液和樣品溶液在相同的色譜條件下的色譜圖和相對(duì)保留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種溶液中齊墩果酸、熊果酸的出峰時(shí)間是一致的。
[0036]2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)
[0037]精密量取齊墩果酸對(duì)照品貯備液0.04ml、0.22ml、0.42ml、0.62ml、0.82ml，熊果酸對(duì)照品貯備液0.05ml,0.28ml,0.52ml,0.80ml,1.00ml，分別置5個(gè)1ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸和熊果酸混合對(duì)照品溶液系列。分別精密吸取各混合對(duì)照品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，依照上述的色譜條件測(cè)定。以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(x，mg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為齊墩果酸:y = 16782.3x+2.17 (r=0.9998);熊果酸:y = 15682.0x+11.58 (r = 0.9994)。由表可見，齊墩果酸進(jìn)樣量在0.162?3.31 μ g，熊果酸進(jìn)樣量在0.195?3.91 μ g之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
[0038]2.5對(duì)照品、樣品的測(cè)定及重復(fù)性試驗(yàn)
[0039]取上述經(jīng)處理的對(duì)照品溶液及樣品溶液，依照上述的色譜條件，將樣品打入高效液相色譜儀中，其色譜圖見附圖1、2。
[0040]進(jìn)樣6次后，根據(jù)色譜圖，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其進(jìn)樣結(jié)果:亞麻油中齊墩果酸、熊果酸的平均含量分別為:0.090%,0.397% ;RSD分別為1.04%, 1.16%。
[0041]2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0042]取同一亞麻油樣品依照上述處理方法，制取樣品溶液，分別在0，4，8，12，24h進(jìn)樣測(cè)定，峰面積的RSD為1.05%，結(jié)果表明樣品溶液中齊墩果酸、熊果酸在24H內(nèi)含量穩(wěn)定。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:本發(fā)明對(duì)測(cè)定齊墩果酸、熊果酸準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可用于亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的測(cè)定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高效液相色譜法測(cè)定亞麻油中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.20mg、熊果酸對(duì)照品8.54mg，分別置1ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品貯備液。 (2)樣品溶液的處理:取亞麻油樣品約1.0-2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，60-90°C索式提取l_4h，浸漬0.5_lh，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得； (3)將濾液過0.40-0.50 μ m微孔濾膜后，在實(shí)驗(yàn)色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定，得測(cè)定數(shù)值；所述的實(shí)驗(yàn)色譜條件為:色譜柱:(:18柱，250父4.6mm，5 ym ;流動(dòng)相:265%甲醇-35 %水-0.1 %冰乙酸-0.05 %三乙胺，其中，流動(dòng)相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸.0.05mL和三乙胺0.05mL配置；紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng):210nm ;流動(dòng)相流速為0.6mL/min，柱溫20 °C，進(jìn)樣體積為20 μ L ; (4)按照外標(biāo)法計(jì)算亞麻油中齊墩果酸、熊果酸的含量。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種亞麻油中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定方法，其主要是通過采用反相高效液相色譜法，其色譜條件為：a.色譜柱：C18柱，250×4.6mm，5μm；b.流動(dòng)相組成：265％甲醇-35％水-0.1％冰乙酸-0.05％三乙胺，其中，流動(dòng)相由甲醇265mL、水35mL、冰乙酸0.05mL和三乙胺0.05mL配置；c.所用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；d.流速：0.6mL/min，進(jìn)樣體積：20μL，柱溫：20℃；樣品溶液的處理：取亞麻油樣品約1.0-2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，60-90℃索式提取1-4h，浸漬0.5-1h，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。為有效控制其質(zhì)量，本發(fā)明方法靈敏、高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可有效控制亞麻油中齊墩果酸和熊果酸的含量。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號(hào)】CN104897801
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510189117
【發(fā)明人】查孝柱
【申請(qǐng)人】查孝柱
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年4月6日