一種急癥腹痛早期篩查的蛋白芯片及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明急癥腹痛早期篩查的蛋白芯片涉及一種蛋白質(zhì)芯片，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是將 蛋白或多肽有序地點(diǎn)陣在固體基片上，利用免疫學(xué)方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測、識(shí)別、鑒定的新 興技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 急癥腹痛（acute abdominal pain)是急診患者最常見的病癥之一。其就診全年均 可出現(xiàn)，高峰分別是秋季（9~11月）和夏季（6~8月），就診年齡集中在15~44歲之間 (占就診總數(shù)的72. 7%)。常涉及內(nèi)、外、兒、婦產(chǎn)甚至神經(jīng)、精神各科的疾病。其主要病因 是腹腔內(nèi)臟器官發(fā)生病變、結(jié)構(gòu)機(jī)能失常、腹外鄰近器官損傷和/或全身性疾病所致。據(jù)統(tǒng) 計(jì)，非創(chuàng)傷性急癥腹痛疾病中急性胰腺炎的發(fā)病率最高，其次是急性胃腸炎、急性腸梗阻、 急性闌尾炎、急性膽管炎、潰瘍急性穿孔等。該類疾病往往具有發(fā)病急、變化快、病情復(fù)雜且 嚴(yán)重等特點(diǎn)，加之，目前醫(yī)院急診科臨床醫(yī)生趨于年輕化，在急診診斷方面經(jīng)驗(yàn)不足，容易 診斷有誤或治療欠妥，這樣可能造成不良后果，甚至死亡。因此，對急癥腹痛的診斷要求較 高，能否及時(shí)做出明確的診斷，進(jìn)行合理的治療，將直接影響著疾病的治療與預(yù)后。針對此 現(xiàn)象，本發(fā)明研制出通過聯(lián)合檢測血清中胰蛋白酶原_2(TPS II )、血清淀粉樣蛋白A(SSA)、 超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP)、降鈣素原（PCT)與抵抗素進(jìn)行急癥腹痛疾病早期篩查的蛋白芯 片，對急癥腹痛常見的急性胰腺炎、急性闌尾炎、急性腹膜炎、急性胃腸炎與潰瘍性急性穿 孔進(jìn)行排除。
[0003] 目前，國外在臨床急癥腹痛的檢測方面，主要通過結(jié)合患者病史，進(jìn)行體格檢查、 實(shí)驗(yàn)室輔助檢查，根據(jù)患者病情選擇性地進(jìn)行血糖、妊娠試驗(yàn)、血電解質(zhì)、肝腎功能、腹部CT 檢查、腹腔診斷性穿刺以及腹水分析等檢查分析，然后綜合考慮，提出相應(yīng)的治療方案。此 外，還采用對急癥腹痛患者尿胰蛋白酶原-2的檢測，進(jìn)行急性胰腺炎的排查，但對于急癥 腹痛相關(guān)的其他疾病的排查尚沒有相關(guān)生物標(biāo)記物的報(bào)道。在國內(nèi)，對于急癥腹痛的臨床 檢測與國外臨床檢測相似，但TPS II在國外臨床診斷中的應(yīng)用開展較早，而在國內(nèi)是近兩 年陸續(xù)才開始在三級甲等醫(yī)院走入臨床應(yīng)用，它的臨床應(yīng)用價(jià)值依舊處于進(jìn)一步的探索 中。本發(fā)明利用蛋白芯片對急癥腹痛患者血清中TPS II、SSA、hs-CRP、PCT與抵抗素進(jìn)行聯(lián) 合檢測，對急癥腹痛常見疾病進(jìn)行排查，為臨床醫(yī)生做出及時(shí)合理的診斷提供輔助工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種急癥腹痛早期篩 查的蛋白質(zhì)芯片，該蛋白質(zhì)芯片可以同時(shí)測定血漿中胰蛋白酶原-2 (TPSII)、超敏C反應(yīng)蛋 白（hs-CRP)、血清淀粉樣蛋白A(SSA)、降鈣素原（PCT)及抵抗素（resistin)的含量，從而 通過一次檢測，既可實(shí)現(xiàn)對急癥腹痛的相關(guān)疾病進(jìn)行排查的靈敏度高、精確性好并且方便 快速的蛋白芯片檢測技術(shù)，幫助臨床醫(yī)生對急癥腹痛相關(guān)疾病做出及時(shí)診斷，也為病情評 估或預(yù)后判斷進(jìn)行輔助判斷。
[0005] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出了一種用于急癥腹痛早期篩查的蛋 白質(zhì)芯片，包括基片和陣列式分布于所述基片上的目標(biāo)蛋白檢測指標(biāo)和對照檢測指標(biāo)涂 層，所述目標(biāo)蛋白檢測指標(biāo)涂層由目標(biāo)蛋白抗體點(diǎn)樣到所述基片上得到，所述目標(biāo)蛋白抗 體包括胰蛋白酶原-2抗體、超敏C反應(yīng)蛋白抗體、血清淀粉樣蛋白A抗體、降鈣素原抗體及 抵抗素抗體，所述對照檢測指標(biāo)涂層包括樣品對照標(biāo)志物、陽性對照標(biāo)志物、陰性對照標(biāo)志 物和試劑對照標(biāo)志物，其中，所述的樣品對照標(biāo)志物為人血清抗原；陽性對照標(biāo)志物為在正 常人血清中分別添加中添加胰蛋白酶原-2、超敏C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A、降鈣素原 及抵抗素標(biāo)準(zhǔn)品制得，所述的陰性對照標(biāo)志物為正常人血清。其中正常人血清TPS II的含 量低于50 μ g/L，SSA的含量低于0· 5ng/mL，hs-CRP含量低于3mg/L，PCT的含量低于0· 5ng/ mL，抵抗素的含量低于14ng/mL。
[0006] 優(yōu)選地，所述的陽性標(biāo)志物中，胰蛋白酶原_2、超敏C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白 A、降鈣素原及抵抗素的添加量為正常血清中胰蛋白酶原-2、超敏C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣 蛋白A、降鈣素原及抵抗素含量的臨界值的3倍。其中，正常血清中TPS II、SSA、hs-CRP、PCT 與抵抗素含量的臨界值分別為50 μ g/L，0. 5ng/mL，3mg/L，0. 5ng/mL，14ng/mL。
[0007] 優(yōu)選地，所述的基片為玻璃基片或塑料基片，所述蛋白檢測指標(biāo)和對照檢測指標(biāo) 分別在所述基片上進(jìn)行多次重復(fù)點(diǎn)樣形成陣列式點(diǎn)樣涂層，每個(gè)陣列重復(fù)多次，優(yōu)選地，上 述重復(fù)次數(shù)為6~8次。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述急癥腹痛早期篩查的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括如下 步驟：
[0009] (1)準(zhǔn)備玻璃基片或塑料基片，上述玻璃基片或塑料基片上自帶有醛基；
[0010] (2)確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置，將胰蛋白酶原-2、超敏C反應(yīng)蛋白、血清淀 粉樣蛋白A、降鈣素原和抵抗素與樣品對照標(biāo)志物、陽性對照標(biāo)志物、陰性對照標(biāo)志物和試 劑對照標(biāo)志物同時(shí)點(diǎn)陣與同一張基片的不同位置，構(gòu)成陣列式點(diǎn)樣涂層，每個(gè)陣列重復(fù)若 干次；
[0011] (3)根據(jù)樣品數(shù)量設(shè)計(jì)陣列排布，使用高速全自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)器人將目標(biāo)抗體以及樣 品對照標(biāo)志物抗體、陽性對照標(biāo)志物的抗體和陰性對照標(biāo)志物的抗體點(diǎn)陣于基片上，使得 上述目標(biāo)抗體通過化學(xué)鍵固定在基片上，室溫放置16小時(shí)以上，并置于4°C保存，其中，所 述目標(biāo)抗體包括胰蛋白酶原-2抗體、超敏C反應(yīng)蛋白抗體、血清淀粉樣蛋白A抗體、抗降鈣 素原抗體和抗抵抗素抗體；
[0012] (4)最后，利用制作蛋白芯片的常規(guī)方法進(jìn)行封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
[0013] 本發(fā)明更進(jìn)一步地提出了所述的蛋白質(zhì)芯片在急癥腹痛早期篩查中應(yīng)用。
[0014] 具體地，在應(yīng)用中按照如下步驟進(jìn)行：
[0015] (1)將待檢測血清滴加于所述蛋白質(zhì)芯片表面，37°C孵育1~1. 5小時(shí)；
[0016] (2)待檢測血清中的胰蛋白酶原-2、超敏C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A、降鈣素原 和抵抗素將分別與固定在蛋白質(zhì)芯片上的相應(yīng)抗體結(jié)合，用低濃度鈉鹽洗去多余樣品；
[0017] (3)加封閉液進(jìn)行封閉，再次洗脫并晾干；
[0018] (4)加入封閉液稀釋過的熒光標(biāo)記的抗胰蛋白酶原-2抗體、抗超敏C反應(yīng)蛋白抗 體、抗血清淀粉樣蛋白A抗體、抗降鈣素原抗體及抗抵抗素抗體的混合物，37°C孵育半小時(shí) 后洗去未結(jié)合物并晾干；
[0019] (5)反應(yīng)結(jié)束后，利用芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀，其中，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度 與血清中的胰蛋白酶原-2、超敏C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A、降鈣素原及抵抗素的含量 成正比。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述的低濃度鈉鹽的濃度為0. 6wt%~0. 9wt%。
[0021 ] 優(yōu)選地，步驟（3)中，所述的洗脫液為ρΗ6· 0的PBS緩沖液。
[0022] 本發(fā)明提出了一種可以同時(shí)測定血漿中TPS II、SSA、hs_CRP、PCT和抵抗素的蛋白 芯片，所述蛋白芯片由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標(biāo)涂層及對照檢測指標(biāo)涂 層組成。其中，蛋白檢測指標(biāo)涂層包括胰蛋白酶原_2(TPS II )、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP)、 血清淀粉樣蛋白A(SSA)、降鈣素原（PCT)及抵抗素（resistin)，對照檢測指標(biāo)涂層包括樣 品對照標(biāo)志物、陽性對照標(biāo)志物、陰性對照標(biāo)志物、試劑對照標(biāo)志物。通過物理固定方法將 各個(gè)檢測指標(biāo)固定于涂層上，即在涂布游偶氮聚合物的玻璃基片上點(diǎn)樣抗原等蛋白質(zhì)。用 光線照射后，偶氮聚合物產(chǎn)生順式異構(gòu)體-反式異構(gòu)體的交替變換，蛋白質(zhì)逐漸陷入偶氮 聚合物內(nèi)部。停止光照后，偶氮聚合物重新凝固成固體，蛋白質(zhì)就實(shí)現(xiàn)了在基片上面的物理 固定，基片是玻璃基片。將TPS II、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素生物標(biāo)志物，與樣品對照、陽 性對照、陰性對照和試劑對照構(gòu)成陣列式點(diǎn)樣涂層，同時(shí)點(diǎn)陣于一張基片上，每個(gè)陣列重復(fù) 16組，該組數(shù)可以根據(jù)具體的需求進(jìn)行放大或縮小。
[0023] 上述芯片涂層上的每個(gè)陣列中每個(gè)蛋白檢測指標(biāo)有3個(gè)重復(fù)點(diǎn)，對照指標(biāo)也有3 個(gè)重復(fù)點(diǎn)。陣列的多少和大小與所檢測的蛋白標(biāo)志物的多少、基片大小以及點(diǎn)樣的大小直 接有關(guān)，其中與被檢測的標(biāo)記物的數(shù)量及基片的大小呈正相關(guān)，與點(diǎn)樣的大小呈負(fù)相關(guān)。
[0024] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] (1)靈敏度高、檢測方便、耗時(shí)短，且能同時(shí)檢測多種急癥腹痛相關(guān)的生物標(biāo)記物， 節(jié)約了樣本的消耗量，同時(shí)也節(jié)省了人力、物力與財(cái)力；
[0026] (2)所述的標(biāo)志物抗體均為單克隆抗體，所述單克隆抗體均通過單克隆雜交瘤細(xì) 胞技術(shù)制備得到或者通過噬菌體抗體技術(shù)篩選得到；
[0027] (3)通過血清TPS II與hs-CRP的聯(lián)合檢測，對急性胰腺炎急性排查；
[0028] (4)通過聯(lián)合檢測血清中PCT與hs-CRP的含量，及時(shí)、有效地完成急性腹膜炎的診 斷排查，有助于臨床療效的觀察；
[0029] (5)通過血清SSA與hs-CRP的聯(lián)合檢測，對急性闌尾炎進(jìn)行排查；
[0030] (6)通過對患者血清中抵抗素與hs-CRP的含量的檢測，對潰瘍性急性穿孔進(jìn)性排 查；此外，血清hs-CRP的水平對急性胃腸炎、急性膽管炎及急性腸梗阻等炎癥疾病的早期 診斷也存在有效價(jià)值。
【附圖說明】
[0031] 圖1急癥腹痛早期篩查蛋白芯片的檢測原理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1 一種急癥腹痛早期篩查的蛋白芯片的制備。
[0033] 其步驟主要是：（1)準(zhǔn)備玻璃基片或者塑料基片，上述玻璃基片或塑料基片上自 帶有醛基；（2)設(shè)計(jì)芯片，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置，將TPS II、SSA、h