基于氫核磁共振結(jié)合偏最小二乘法鑒別蜂蜜真假的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品檢測(cè)，更具體涉及利用氫核磁共振指紋圖譜結(jié)合偏最小二乘法鑒別蜂蜜中摻有糖漿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜂蜜是一種蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或者蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)(蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)GB14963-2011GB)。作為一種天然保健品和營(yíng)養(yǎng)品，深受廣大消費(fèi)者的青睞。盡管標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定蜂蜜是天然物質(zhì)，不允許人為添加和去除任何物質(zhì)，但目前國內(nèi)市場(chǎng)上摻假蜂蜜泛濫成災(zāi)，嚴(yán)重?fù)p害了廣大消費(fèi)者的利益，影響了蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
[0003]蜂蜜市場(chǎng)摻假嚴(yán)重的原因主要有4點(diǎn):(I)蜂蜜中主要糖類物質(zhì)是葡萄糖、果糖，結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，同時(shí)受蜜源植物種類、花期長(zhǎng)短、氣候以及蜂蜜的加工、儲(chǔ)存、結(jié)晶等多種因素影響，造成蜂蜜主要物質(zhì)的含量波動(dòng)范圍較大。這些客觀原因，使得蜂蜜摻假簡(jiǎn)單、方便；
(2)目前摻假的主要手段是在蜂蜜中加入外源植物糖漿，例如玉米糖漿、甜菜糖漿、大米糖漿等。市場(chǎng)上糖漿的價(jià)格遠(yuǎn)低于蜂蜜的價(jià)格，不法生產(chǎn)廠商從摻假蜂蜜中能獲得更多的經(jīng)濟(jì)利益；(3)摻假蜂蜜本身對(duì)人體危害程度不及其它一些摻假食品，沒有引起消費(fèi)者的高度警惕；(4)缺乏有效檢測(cè)手段，導(dǎo)致打擊蜂蜜摻假面臨困難。
[0004]蜂蜜真實(shí)性檢驗(yàn)的傳統(tǒng)方法是感觀鑒別、花粉分析以及化學(xué)分析。然而，這些方法費(fèi)時(shí)，準(zhǔn)確度和精確度較差。目前也發(fā)展了許多儀器檢測(cè)方法，根據(jù)被測(cè)量的物理和化學(xué)性質(zhì)可分為光譜分析法、電化學(xué)分析法、色譜分析法、質(zhì)譜分析法、熱量分析法等幾類。這些方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。例如，高效液相色譜曾廣泛用于蜂蜜摻假的檢測(cè)，但是該方法檢測(cè)不到低濃度摻假以及摻加與蜂蜜成分相似的糖漿。穩(wěn)定性碳同位素比值(13C/12C)法可以測(cè)定蜂蜜中摻入碳-4植物源的糖分，但是對(duì)于摻入的轉(zhuǎn)化糖分(人造甜味劑等)以及由水稻、小麥、大豆等碳-3植物源制造的糖漿就很難區(qū)分開來。通過高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜可以檢測(cè)大米糖漿的特征化合物，進(jìn)而判斷蜂蜜中是否摻有大米糖漿。但該技術(shù)只針對(duì)大米糖漿摻假，對(duì)于其他糖漿摻假則無法判斷。檢測(cè)技術(shù)的滯后影響到蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量保證和食用安全性，必須為蜂蜜的質(zhì)量控制提供新的方法和思路。因此如何鑒別蜂蜜產(chǎn)品摻假已經(jīng)成為我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)亟待解決的問題。有必要開展蜂蜜真?zhèn)舞b定的研宄，以保護(hù)消費(fèi)者利益和保證蜂蜜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。
[0005]核磁共振(NMR)是一種非常重要的研宄和分析測(cè)試工具，在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)有機(jī)小分子和生物大分子的結(jié)構(gòu)解析具有重要作用。核磁共振技術(shù)有如下特點(diǎn):(I)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，無需預(yù)篩選，可以避免由于分離所造成的微小成分的丟失；(2)無損傷性，不會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)；(3)譜圖中信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱直接反映了樣品中各組分的相對(duì)含量；(4)可設(shè)計(jì)多種編輯手段，實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣。
[0006]采用氫核磁共振(1H NMR)技術(shù)測(cè)試食品等復(fù)雜混合體系可以得到體系中許多化學(xué)成分的信息，但是各種成分信號(hào)的重疊也使得圖譜變得十分復(fù)雜。通常，僅靠肉眼觀察只能從核磁共振圖譜中獲得很有限的信息。而多元統(tǒng)計(jì)分析可以有效而全面地分析復(fù)雜的譜圖數(shù)據(jù)，能夠從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中最大限度的提取信息。應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法建立的數(shù)學(xué)模型，就能從未知樣品的1H NMR譜圖中預(yù)測(cè)樣品的成分、性質(zhì)等信息。因此，1H-NMR結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)食品的定性分析提供了一條新的思路和方法，也是目前食品整體質(zhì)量檢測(cè)的理想方法。
[0007]針對(duì)現(xiàn)行的一些蜂蜜質(zhì)量檢測(cè)方法只關(guān)注某一種或者幾種成分的含量和變化，提出了以1H-NMR技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法建立蜂蜜摻假的鑒別方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是，提供一種基于氫核磁共振結(jié)合偏最小二乘法鑒別蜂蜜真假的方法。該方法首先分別建立純蜂蜜數(shù)據(jù)庫和糖漿摻假蜂蜜數(shù)據(jù)庫，然后構(gòu)建鑒別模型，對(duì)鑒別模型進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，再對(duì)待測(cè)蜂蜜樣品的進(jìn)行鑒別，并將待測(cè)蜂蜜樣品的鑒別結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)庫的進(jìn)行擴(kuò)充，以增加樣品的代表性和判別能力。優(yōu)點(diǎn)是:技術(shù)可靠，操作簡(jiǎn)單，可在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品，避免了主觀因素、人為誤差，結(jié)論科學(xué)可靠。
[0009]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0010]一種基于氫核磁共振結(jié)合偏最小二乘法鑒別蜂蜜真假的方法，該方法包含下列步驟:
[0011](a)建立純蜂蜜數(shù)據(jù)庫
[0012](al)收集N個(gè)純蜂蜜樣品，N不少于80 ；
[0013](a2)在N個(gè)純蜂蜜樣品中取一個(gè)純蜂蜜樣品一份；
[0014](a3)將樣品置于離心管中，在60°C水浴至蜂蜜完全溶解，再加入樣品體積8?15倍的磷酸鹽緩沖溶液，渦旋振蕩至均勻混合，離心，取上清液；
[0015](a4)將步驟(a3)中的上清液轉(zhuǎn)移到核磁共振管中，在500MHz液體核磁共振譜儀上進(jìn)行1H NMR測(cè)試，實(shí)驗(yàn)溫度為298K，用D2O進(jìn)行鎖場(chǎng)，采用noesyprld脈沖序列，90°脈沖寬度9.7微秒，混合時(shí)間100.0毫秒，1H NMR譜的譜寬為10kHz，采樣點(diǎn)數(shù)32768，延遲等待時(shí)間2.0秒，累加48次，得到樣品的核磁共振信號(hào)；
[0016](a5)用核磁共振譜儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)樣品的核磁共振信號(hào)進(jìn)行傅里葉變換，變換點(diǎn)數(shù)為131072，指數(shù)線寬因子為1Hz，手動(dòng)調(diào)相位和基線校正，2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉作為內(nèi)標(biāo)物，共振峰設(shè)為S 0.00，進(jìn)行化學(xué)位移定標(biāo)，得到樣品的1H NMR譜圖；
[0017](a6)對(duì)1H NMR譜圖進(jìn)行分段積分，積分范圍為化學(xué)位移δ 0.1-δ 6.0之間，積分間隔為SO-Oldf1H NMR譜中δ 4.73-4.93區(qū)域的信號(hào)剔除，采用峰面積歸一化，得到強(qiáng)度積分相對(duì)值的一組數(shù)據(jù)；
[0018](a7)在N個(gè)純蜂蜜樣品中，逐一取樣品，按照步驟(a3)?(a6)的方法，得到N組數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)為一行，第I行為化學(xué)位移值，構(gòu)成純蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣；
[0019](b)建立糖漿摻假蜂蜜數(shù)據(jù)庫
[0020](bl)從質(zhì)檢部門查獲的糖漿摻假蜂蜜中收集M個(gè)樣品，M不少于40 ；
[0021](b2)在M個(gè)糖漿摻假蜂蜜樣品中，逐一取樣品，按照步驟(a3)?(a6)的方法，得到M組數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)為一行，第I行為化學(xué)位移值，構(gòu)成糖漿摻假蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣；
[0022](c)構(gòu)建鑒別模型
[0023]對(duì)純蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣和糖漿摻假蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化方法采用自適換算；類別變量Y代表樣品的類型，數(shù)值為“ I ”，代表純蜂蜜樣品，數(shù)值為“2”，代表糖漿摻假蜂蜜樣品，閾值設(shè)為0.5 ;采用偏最小二乘法將經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理的純蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣、糖漿摻假蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣與類別變量Y進(jìn)行線性回歸，得到鑒別模型；
[0024](d)鑒別模型的可靠性檢驗(yàn)
[0025]采用排列實(shí)驗(yàn)法對(duì)鑒別模型的可靠性進(jìn)行檢驗(yàn):通過η次隨機(jī)改變類別變量的排列順序，得到相應(yīng)不同的累積貢獻(xiàn)率值R2、預(yù)測(cè)能力值Q2，n多100 ;然后對(duì)類別變量順序隨機(jī)排列模型的R2值、Q2值與類別變量順序未改變模型的R2值、Q2值之間做回歸線，如果類別變量順序未改變模型的Q2值大于任何一個(gè)類別變量隨機(jī)排列模型的Q2值，說明鑒別模型可靠有效，可以使用；
[0026](e)蜂蜜樣品的鑒別
[0027]將待鑒別蜂蜜樣品按步驟(a3)?(a6)的方法，得到強(qiáng)度積分相對(duì)值的一組數(shù)據(jù)；將其導(dǎo)入步驟(C)中的鑒別模型，得到類別變量Y的數(shù)值，當(dāng)類別變量Y在1±0.5之間時(shí)，待鑒別蜂蜜樣品為純蜂蜜，當(dāng)類別變量Y在2±0.5之間時(shí)，待鑒別蜂蜜樣品為糖漿摻假蜂蜜；
[0028](f)數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)充
[0029]如果待鑒別蜂蜜樣品的鑒別結(jié)果為純蜂蜜，在步驟(a7)的純蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣中增加一行該待鑒別蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值的一組數(shù)據(jù)，得到新的純蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣，并用該矩陣更新原步驟(a7)的純蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣；
[0030]如果待鑒別蜂蜜樣品的鑒別結(jié)果為糖漿摻假蜂蜜，在步驟(b2)的糖漿摻假蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣中增加一行該待鑒別蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值的一組數(shù)據(jù)，得到新的糖漿摻假蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣，并用該矩陣更新原步驟(b2)的糖漿摻假蜂蜜樣品的強(qiáng)度積分相對(duì)值數(shù)據(jù)矩陣。以擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫和增加樣品的代表性和判別能力。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明鑒別蜂蜜的真假具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0032](I) 1H-NMR對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，樣品預(yù)處理要求不高，技術(shù)成熟可靠，操作簡(jiǎn)單易行，可以實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)試，短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品。
[0033](2)偏最小二乘法可以有效而全面地分析復(fù)雜的譜圖數(shù)據(jù)，能夠從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中最大限度的提取信息，避免主觀因素、人為誤差，結(jié)論科學(xué)可靠。
[0034](3)整個(gè)方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單高效，可以通過增加數(shù)據(jù)庫容量，擴(kuò)大使用范圍，提高準(zhǔn)確率，對(duì)完善目前蜂蜜質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)體系具有重要意義。
【附圖說明】
[0035]圖1是純蜂蜜樣品(a)與糖漿摻假蜂蜜樣品(b)的1HNMR譜圖。
[0036]圖2是純蜂蜜樣品與糖漿摻假蜂蜜樣品的偏最小二乘法得分散點(diǎn)圖(1-純蜂蜜樣品〇；2_糖楽慘假蜂蜜樣品Λ )。
[0037]圖3是純蜂蜜樣品與糖漿摻假蜂蜜樣品類別變量Y的計(jì)算值與實(shí)際值之間的關(guān)系(“ I”代表純蜂蜜，“2”代表糖漿摻假蜂蜜)。
[0038]圖4鑒別模型的可靠性驗(yàn)證(排列實(shí)驗(yàn)Permutat1n Test)。
[0039]圖5是待鑒別蜂蜜樣品類別變量Y的計(jì)算值。
【具體實(shí)施方式】
[0040]1.儀器、試劑與樣品
[0041]1.1 儀器:
[0042]500MHz液體核磁共振譜儀(BrukerAVANCE)，瑞士 Bruker B1spin公司；微量臺(tái)式離心機(jī)(Sorvall Legend Micro 17R)，美國 Thermo Scientific 公司;電子天平(AL104)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；5mm核磁管(ST500-7)，美國Norell公司
[0043]1.2 試劑:
[0044]K2HPO4.3Η20和NaH2PO4.2Η20(分析純)購于上海國藥集團(tuán)試劑有限公司。NaN3(分析純)購于天津福晨化學(xué)試劑廠。重水(D20，99.9%氘代，含2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉(TSP), 0.05wt% )購于 Cambridge Isotope Laboratories 公司。用于樣品制