一種基于大鼠口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì)肺部炎癥有誘導(dǎo)作用的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及卷煙危害的生物評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體為一種基于大鼠口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì) 肺部炎癥有誘導(dǎo)作用的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人們已經(jīng)普遍接受了這樣一種觀點(diǎn)，即通過(guò)降低卷煙煙氣中有害成分的釋放量可 以有效地降低卷煙對(duì)人體的危害。但是國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有形成統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。目前，國(guó)內(nèi)外 普遍以卷煙中含有主要有害物質(zhì)的致癌，致畸變數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合數(shù)學(xué)模型公式進(jìn)行危害 評(píng)價(jià)，尚無(wú)關(guān)于卷煙和肺部炎癥相關(guān)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。大多在研究卷煙危害往往以固定卷煙煙 氣濃度進(jìn)行暴露，或采用全身暴露，我們首次采用大鼠經(jīng)口鼻暴露方式，且卷煙煙氣經(jīng)吸煙 機(jī)產(chǎn)生后直接由載氣載入暴露裝置，模擬人吸煙時(shí)吸煙和吐煙的實(shí)際情況，使獲得數(shù)據(jù)更 加接近現(xiàn)實(shí)。慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructivepulmonarydiseases，C0PD)簡(jiǎn)稱(chēng) 慢阻肺，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的呼吸困難及肺功能下降，反復(fù)發(fā)作后，將發(fā)展成慢性肺源性心 臟病，導(dǎo)致嚴(yán)重的心、肺功能障礙，甚至多個(gè)器官的功能衰竭。目前，coro發(fā)病機(jī)制尚未完 全研究清楚，普遍認(rèn)為吸煙會(huì)誘導(dǎo)coro的形成，且吸煙者coro患病率較不吸煙者高。即使 沒(méi)有出現(xiàn)氣流受限，健康吸煙者肺部仍然有輕度炎癥。主要原因是卷煙中含有成千上萬(wàn)種 物質(zhì)，卷煙煙氣中有i〇15種自由基，卷煙焦油中含有1018活性物質(zhì)和氮化合物（R〇s)，這些 有害物質(zhì)能在肺部長(zhǎng)期滯留，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。因此，我們結(jié)合模擬人吸煙的大鼠口鼻暴 露裝置對(duì)卷煙對(duì)肺部早期炎癥的誘導(dǎo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)狀況下提供一種基于大鼠口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì)肺部 炎癥作用檢測(cè)方法。本方法提供的檢測(cè)方法，具有模擬人吸煙，僅口鼻暴露，多指標(biāo)綜合評(píng) 價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的： 一種基于大鼠口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì)肺部炎癥有誘導(dǎo)作用的檢測(cè)方法，包括以下步驟： 1) 吸煙機(jī)分別按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)或加拿大深度抽吸模式設(shè)置吸煙程序，口鼻暴露裝置設(shè)置載 氣流量為8L/min，連接煙氣質(zhì)量檢測(cè)儀，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)香煙煙氣質(zhì)量濃度； 2) 清潔級(jí)大鼠15只/組置于固定器中，置于口鼻暴露塔上，僅口鼻吸煙； 3) 每批大鼠每天吸煙20支；待一批大鼠吸煙完成后，換另一批大鼠吸入另外批次香煙 或不同抽吸設(shè)置；空白組以不吸煙空氣進(jìn)行暴露；連續(xù)吸煙28天； 4) 大鼠最后一次吸煙18小時(shí)后處死大鼠，右肺結(jié)扎，采用PBS5ml' 3次對(duì)左肺進(jìn)行 肺泡灌洗，以回收率大于80%為合格；肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，3000r' 5min離心，取 上清液采用eBioscienceElisa試劑盒測(cè)定IL-1P和TNF-a的含量，細(xì)胞沉淀涂片，瑞 士-吉姆薩染色進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)；右肺于10%甲醛溶液中固定一周后，脫水，石蠟包埋，切片， 進(jìn)行染色，觀察肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)卷煙對(duì)大鼠肺部炎癥的誘導(dǎo)作 用。
[0005] 本發(fā)明卷煙樣品經(jīng)吸煙機(jī)按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式或者加拿大深度抽吸模式吸煙， 將卷煙煙氣以空氣為載氣通入大鼠口鼻暴露塔中，大鼠固定于口鼻暴露塔，僅口鼻暴露于 卷煙煙氣中，同時(shí)暴露塔抽氣保持微小負(fù)壓，模擬人吸煙過(guò)程中的吸煙吐氣過(guò)程。大鼠每天 吸煙20支，連續(xù)28天，空白組以不含卷煙煙氣的空氣暴露。28天后處死大鼠，左肺進(jìn)行肺泡 灌洗，對(duì)總炎癥細(xì)胞數(shù)及炎癥細(xì)胞分類(lèi)進(jìn)行計(jì)數(shù)；同時(shí)取灌洗液上清進(jìn)行炎癥因子IL-1 3 和TNFa檢測(cè)；右肺固定一周進(jìn)行病理檢測(cè)。結(jié)果表明：口鼻暴露煙氣質(zhì)量濃度檢測(cè)大鼠吸 煙的煙氣證實(shí)煙氣質(zhì)量濃度呈現(xiàn)的峰谷變化，一定程度上模擬人自然吸煙過(guò)程；在對(duì)三種 市售不同焦油濃度卷煙按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式或者加拿大深度抽吸模式下誘導(dǎo)卷煙大鼠肺 部炎癥的評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，高焦油含量卷煙組大鼠出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì) 胞，淋巴細(xì)胞均有一定上升，炎癥因子IL-1P和TNFa分泌對(duì)比空白組顯著上升，而低濃度 焦油卷煙組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，說(shuō)明大鼠肺部炎癥浸潤(rùn)程度與卷煙焦油含量呈現(xiàn)正比例關(guān) 系；同時(shí)發(fā)現(xiàn)同等焦油含量卷煙，加拿大深度抽吸模式對(duì)大鼠肺部炎癥高于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抽吸 模式。上述結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)單，能很好的評(píng)價(jià)不同卷煙對(duì)大鼠肺部炎癥的誘導(dǎo)作用， 填補(bǔ)國(guó)內(nèi)經(jīng)口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì)肺部炎癥的誘導(dǎo)作用的研究。
[0006] 本發(fā)明由于采用上述的技術(shù)方案，建立了一種基于大鼠口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì)肺部 炎癥有誘導(dǎo)作用的檢測(cè)方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1. 大鼠僅口鼻吸煙，避免卷煙有害物質(zhì)經(jīng)粘膜或大鼠舔毛等方式進(jìn)入，更加準(zhǔn)確； 2. 由吸煙機(jī)吸煙產(chǎn)生卷煙煙氣，能檢測(cè)卷煙不同抽吸模式下對(duì)大鼠肺部炎癥誘導(dǎo)作 用，運(yùn)用靈活； 3. 卷煙煙氣經(jīng)載氣進(jìn)行暴露，能更好的模擬人吸煙過(guò)程中的吸煙和吐煙的實(shí)際過(guò)程； 4. 采用的肺泡灌洗炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)，病理和炎癥因子分泌多指標(biāo)綜合觀察， 更加系統(tǒng)和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)卷煙對(duì)大鼠肺部炎癥的誘導(dǎo)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1為不同焦油卷煙按加拿大深度抽吸或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式經(jīng)載氣進(jìn)入大鼠口 鼻暴露塔后于口鼻暴露口檢測(cè)的煙氣質(zhì)量濃度變化圖。
[0008] 圖2為不同焦油含量卷煙對(duì)大鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明通過(guò)以下具體實(shí)例作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明。
[0010] 考察市售3種不同焦油含量卷煙對(duì)大鼠肺部炎癥誘導(dǎo)作用。卷煙樣品為市售的烤 煙型卷煙，焦油含量分別為1lmg，5mg及l(fā)mg。實(shí)驗(yàn)前樣品準(zhǔn)備在溫度22± 1°C，相對(duì)濕度為 60±2%的條件下平衡48h。SD雄性大鼠，220±20g，購(gòu)于上海斯萊克。吸煙時(shí)大鼠均飼養(yǎng) 于空氣潔凈度十萬(wàn)級(jí)的動(dòng)物房，室溫21±1°C，濕度58±4%，晝夜周期為12h/12h。采用慧 榮和大鼠口鼻暴露系統(tǒng)，維持載氣流量8L/min，抽氣流量9. 5L/min，氧分壓20 ±0. 5%，溫度 24± 2°C，相對(duì)濕度60-80% ;同時(shí)測(cè)定大鼠口鼻暴露口卷煙煙氣質(zhì)量濃度。單孔道吸煙機(jī)， 分別采用加拿大深度抽吸模式(抽吸體積55ml，抽吸間隔30s，抽吸時(shí)間2s)及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抽 吸模式(抽吸體積35ml，抽吸間隔60s，抽吸時(shí)間2s)進(jìn)行吸煙。大鼠連續(xù)吸煙28天后，吸 麻醉處死大鼠，左肺采用PBS進(jìn)行肺泡灌洗，去回收率大于80%肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 并離心取上清測(cè)定IL-1 0及TNF-a，細(xì)胞沉淀涂片后，瑞士 -吉姆薩染色進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)。 右肺經(jīng)10%甲醛固定一周后，取材，脫水，透明，石蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色，觀察肺部炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0011] 結(jié)果顯示： 1、不同焦油含量卷煙對(duì)大鼠BALF中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 大鼠經(jīng)28天吸煙后，加拿大深度抽吸模式下lmg和5mg卷煙組BALF灌洗液中總細(xì)胞 數(shù)相對(duì)不吸煙空白組無(wú)顯著想變化，而加拿大深度抽吸模式及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式下llmg 卷煙組總細(xì)胞數(shù)有顯著上升。分類(lèi)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：加拿大深度抽吸模式下lmg卷煙組大鼠 BALF中巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均無(wú)明顯的上升；5mg卷煙組對(duì)淋巴細(xì)胞和中性 粒細(xì)胞的肺部浸潤(rùn)有顯著誘導(dǎo)作用，而對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)顯著作用。加拿大深度抽吸及國(guó)際標(biāo) 準(zhǔn)抽吸模式下llmg卷煙均能顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的肺部浸潤(rùn)。進(jìn)一 步分析，發(fā)現(xiàn)加拿大深度抽吸模式下llmg卷煙對(duì)BALF中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及分類(lèi)計(jì)數(shù)與加拿 大深度抽吸模式下的lmg有顯著上升，而和加拿大深度抽吸模式下5mg卷煙組及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) 抽吸模式下llmg卷煙組無(wú)顯著差異（表1)。
[0012] 表1不同吸煙組大鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于大鼠口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì)肺部炎癥有誘導(dǎo)作用的檢測(cè)方法，其特征在于該 方法包括W下步驟： 1) 開(kāi)啟吸煙機(jī)和卷煙口鼻暴露裝置于待機(jī)狀態(tài)，吸煙機(jī)分別按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)或加拿大深度 抽吸模式設(shè)置吸煙程序，口鼻暴露裝置設(shè)置載氣流量為化/min,連接煙氣質(zhì)量檢測(cè)儀； 2) 清潔級(jí)大鼠15只/組置于固定器中，置于口鼻暴露培上，僅口鼻吸煙； 3) 插入卷煙，開(kāi)始吸煙，每批大鼠每天吸煙20支，待一批大鼠吸煙完成后，換另一批大 鼠吸入另外批次香煙或不同抽吸設(shè)置；空白組W不吸煙空氣進(jìn)行暴露；連續(xù)吸煙28天； 4) 大鼠最后一次吸煙18小時(shí)后處死大鼠，右肺結(jié)扎，采用PBSSml ' 3次對(duì)左肺進(jìn)行 肺泡灌洗，W回收率大于80%為合格；肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，300化'5min離也，取 上清液采用聯(lián)科生物Elisa試劑盒測(cè)定IL-1目和TNF- a的含量，細(xì)胞沉淀涂片，瑞± -吉 姆薩染色進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)；右肺于10%甲酵溶液中固定一周后，脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行肥 染色，觀察肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種基于大鼠口鼻吸煙評(píng)價(jià)卷煙對(duì)肺部炎癥有誘導(dǎo)作用的檢測(cè)方法，步驟如下：1）吸煙機(jī)分別按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置吸煙程序，連接煙氣質(zhì)量檢測(cè)儀，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)香煙煙氣質(zhì)量濃度；2）清潔級(jí)大鼠置于口鼻暴露塔上；3）每批大鼠每天吸煙20支；待一批大鼠吸煙完成后，換另一批大鼠吸入另外批次香煙或不同抽吸設(shè)置；空白組以不吸煙空氣進(jìn)行暴露；4）大鼠最后一次吸煙后處死大鼠，對(duì)肺部進(jìn)行處理，觀察肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)卷煙對(duì)大鼠肺部炎癥的誘導(dǎo)作用。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.大鼠僅口鼻吸煙，避免卷煙有害物質(zhì)經(jīng)粘膜或大鼠舔毛等方式進(jìn)入，更加準(zhǔn)確，運(yùn)用靈活。
【IPC分類(lèi)】G01N33-48, G01N33-53
【公開(kāi)號(hào)】CN104535747
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410692123
【發(fā)明人】周?chē)?guó)俊, 儲(chǔ)國(guó)海, 肖衛(wèi)強(qiáng), 黃芳芳, 徐建, 沈凱, 戴路, 史春云, 夏倩, 胡雅軍, 許成云, 吳希美
【申請(qǐng)人】浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年11月26日