一種絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于新型生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物傳感器領(lǐng)域，酶電極占有重要的地位。酶電極是指將活性物質(zhì)酶固定在電 極表面，探測電流型或電位型催化反應(yīng)信號，具有酶的分子識別和催化功能，又有電化學(xué)電 極響應(yīng)快，操作簡便的特點(diǎn)，能快速測定試液中某一給定化合物的濃度。
[0003] 在酶電極研宄的基礎(chǔ)上引入了電子介體修飾的方法，不同的電子介體，如小分子 染料、二茂鐵系化合物、氧化還原聚合物等，可以改變電極電位，促使了在酶反應(yīng)過程中產(chǎn) 生的電子于酶的活性中心和電極表面之間轉(zhuǎn)移，提高酶電極反應(yīng)過程的電流響應(yīng)，且排除 其它活性物質(zhì)的干擾。電子介體在近來得到迅速發(fā)展，使用的電子介體根據(jù)作用機(jī)理，將其 分為了兩類：第一類是含有過渡金屬元素的化合物或配合物，包括二茂鐵及其衍生物，鋨、 釘及其配合物，鐵氰酸鹽和過渡金屬納米材料等，通過過渡金屬價(jià)態(tài)的改變，促使電極和酶 之間的電子傳遞；第二類是有機(jī)化合物，通改變分子中特殊官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行傳遞電子，包 括了有機(jī)染料，導(dǎo)電有機(jī)鹽，四硫富瓦烯（TTF)，醌及其衍生物，富勒烯等。此外，金屬納米 離子也屬于電子介體的一種。電子介體性質(zhì)對酶電極具有影響，采用的鋨-聚乙烯基吡啶 (Os(bpy) 22 (PVP) 1(IC12,Os-PVP)具有了良好生物相容性，保障酶的活性，且優(yōu)異的電荷轉(zhuǎn)移 性能提高了電極表面的電子傳輸效率，相比于游離擴(kuò)散型的電子介體，在反應(yīng)過程中不易 流失，保障了電流信號的強(qiáng)度。可以降低檢測時(shí)水體中還原性物質(zhì)的干擾等特點(diǎn)。所以選 擇適當(dāng)?shù)慕轶w修飾酶電極，以獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0004] 在實(shí)際應(yīng)用的分析中通常將樣品滴加到這類電極的工作區(qū)域或直接把電極放入 樣品液中。近來出現(xiàn)了流動(dòng)注射分析（FIA)與絲網(wǎng)印刷生物傳感器聯(lián)用技術(shù)，為了提供 多步驟化學(xué)反應(yīng)，簡化分析流路操作，在實(shí)際應(yīng)用的在線和過程分析工作中，順序注射分析 (SIA)和電化學(xué)生物傳感器聯(lián)用技術(shù)得到了關(guān)注。如Ledru等采用FIA與電化學(xué)絲網(wǎng)印刷 電極結(jié)合檢測HRP-SPCE與H202體系間電子直接轉(zhuǎn)移，該方法提高了傳感器分析的精確度和 靈敏度。如Gomes等采用SIA與鉬電極電化學(xué)生物傳感器結(jié)合檢測L-乳酸；Niculescu等 采用噴壁式FIA和SIA與石墨棒及絲網(wǎng)印刷脫氫酶電極結(jié)合監(jiān)測酒發(fā)酵過程中的乙醇。與 FIA相比，SIA檢測系統(tǒng)中泵閥到檢測器間管道較短，消耗試劑較少，可通過注射泵定量抽 吸實(shí)現(xiàn)多步驟的定量反應(yīng)與分析，且不需要因?yàn)闄z測項(xiàng)目變化而改變流路系統(tǒng)，有利于提 供自動(dòng)實(shí)時(shí)的在線監(jiān)測。采用SIA與酶傳感器聯(lián)用的技術(shù)，能夠簡化實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約試劑， 靈敏度高，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)在線檢測。
[0005] 根據(jù)絲網(wǎng)印刷電極上固定酶數(shù)量的不同，可以分為單位點(diǎn)酶電極和多位點(diǎn)酶電 極。單位點(diǎn)酶電極的缺點(diǎn)主要是檢測物質(zhì)不全，或容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性。多位點(diǎn)酶 電極是用固定在同一絲網(wǎng)電極上的多種酶催化連續(xù)或同時(shí)發(fā)生的多個(gè)反應(yīng)，多位點(diǎn)酶電極 可以擴(kuò)大酶電極選擇檢測底物的范圍、調(diào)整酶電極電位、提高檢測性能，且具有了更加快速 簡單測定，多位點(diǎn)酶電極采用不同酶對底物有不同的電流響應(yīng)，具有單酶電極難以達(dá)到的 性能，有很大的應(yīng)用潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極及其制備方法和應(yīng)用。該多 位點(diǎn)酶電極在檢測分析環(huán)境中有機(jī)污染物上具有簡便快捷特點(diǎn)；為環(huán)境污染物快速測定提 供了一種準(zhǔn)確，靈敏及自動(dòng)化的檢測技術(shù)；為復(fù)雜的環(huán)境檢測手段擴(kuò)寬了檢測范圍及選擇 性。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] -種絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極，包括基底電極，所述基底電極表面的多位點(diǎn)固定 有酶；所述基底電極為絲網(wǎng)印刷電極；所述酶為氧化酶。
[0009] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述氧化酶包括辣根過氧化物酶和漆酶。
[0010] 所述絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極的制備方法，步驟為：
[0011] (1)以碳漿印刷碳電極層，碳電極層印刷完畢后烘干；再印刷絕緣層，絕緣層印刷 完畢后烘干；超聲清洗后晾干即得到絲網(wǎng)印刷電極，待用；
[0012] (2)用磷酸鹽緩沖液配制辣根過氧化物酶酶液和漆酶酶液；將這兩種酶液分別與 戊二醛溶液和牛血清白蛋白溶液混勻，得到辣根過氧化物酶混合液和漆酶混合液；
[0013] (3)將辣根過氧化物酶混合液、漆酶混合液、辣根過氧化物酶酶液、漆酶酶液中的 一種或多種，順序滴加到絲網(wǎng)印刷電極的每一個(gè)工作區(qū)域，然后干燥密封反應(yīng)，即得到絲網(wǎng) 印刷型多位點(diǎn)酶電極。
[0014] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：用濃度為0.lmol/L、pH= 7. 0的磷酸鹽緩沖液配制 lg/L的辣根過氧化物酶酶液；用濃度為0.lmol/L、pH= 4. 5的磷酸鹽緩沖液配制lg/L漆 酶酶液；戊二醛溶液的質(zhì)量濃度為〇. 3 % ;牛血清白蛋白溶液的濃度為1?2g/L。
[0015] 一種應(yīng)用絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極制備的多位點(diǎn)酶生物傳感器，包括對電極以及 作為工作電極的絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極。
[0016] 一種應(yīng)用絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極檢測酚類化合物的方法，以循環(huán)伏安或計(jì)時(shí)電 流的方法測定溶液中底物濃度；底物為H202和酚類化合物，H202和酚類化合物濃度范圍均為 0? 1?1.Ommol/L;采用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，濃度為0? 05?0? 25mol/L，pH= 4. 0? 8. 0〇
[0017] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述酚類化合物為鄰苯二酚，鄰苯二酚的濃度取 0. 8mmol/L,H202的濃度取 0? 6mmol/L〇
[0018] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述緩沖液的濃度取0. 15mol/L，pH= 6。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明的酶電極以多種氧化酶聯(lián)用分析酚類物質(zhì)，利用戊二醛，BSA交聯(lián)將鋨聚合 物分別與HRP、漆酶混合后固定于四位點(diǎn)電極上，加入H202作為輔助，對兩種酶共同反應(yīng)強(qiáng) 的鄰苯二酚底物進(jìn)行檢測，對酚類化合物提供較好的分析能力和抗干擾能力。本發(fā)明的多 位點(diǎn)酶電極制作方法簡單，成本低廉，操作工藝簡單，電子和酶之間電子傳遞速率高；本發(fā) 明的檢測靈敏度高，快捷準(zhǔn)確，節(jié)約試劑；采用SIA與絲網(wǎng)印刷型電化學(xué)生物傳感器聯(lián)用方 法，提供更有利的在線長期實(shí)時(shí)檢測環(huán)境，可以用于湖泊、水庫、河流、污水處理廠、農(nóng)藥廠 等的污染快速監(jiān)測，也可以用于蔬菜等食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測。在制備單酶位 點(diǎn)電極或是二者聯(lián)用的酶電極應(yīng)用中，提高了生物傳感器的檢測靈敏度及測定范圍，使得 檢測結(jié)果更為快速準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0021] 圖1為四位點(diǎn)電極示意圖；
[0022] 圖2為四位點(diǎn)電極的pH影響；
[0023] 圖3為四位點(diǎn)電極的緩沖液濃度影響；
[0024] 圖4為四位點(diǎn)電極的鄰苯二酚底物濃度影響；
[0025] 圖5為四位點(diǎn)電極H202的濃度影響；
[0026] 圖6a_6d鄰苯二酚不同濃度下四位點(diǎn)酶電極的電流響應(yīng)；
[0027] 圖7a_7d為四位點(diǎn)酶電極的電流響應(yīng)與鄰苯二酚濃度的線性關(guān)系；
[0028] 圖8為四位點(diǎn)兩種酶電極的平均電流峰值比較；
[0029] 圖中：1和2為對電極，3為工作電極。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。如無特殊說 明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0031] 一種絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極，包括基底電極，所述基底電極表面的多位點(diǎn)固定 有酶；所述基底電極為絲網(wǎng)印刷電極；所述酶為氧化酶，包括辣根過氧化物酶（HRP)和漆 酶。
[0032] 所述絲網(wǎng)印刷型多位點(diǎn)酶電極的制備方法，步驟為：以碳漿印刷碳電極層，碳電極 層印刷完畢后，將碳電極層放入90°C的烘箱中，保溫30min;再印刷絕緣層，絕緣層印刷完 畢后，放入90°C的烘箱中，保溫15min;再放入水中超聲清洗3min，然后取出用水清洗，晾 干即得到絲網(wǎng)印刷電極，待用；用濃度為0.lmol/L、pH= 7. 0的磷酸鹽緩沖液（PBS)配制 lg/L的辣根過氧化物酶酶液和濃度為0.lmol/L、pH= 4. 5的磷酸鹽緩沖液（PBS)配制lg/ L漆酶酶液，以及相應(yīng)的質(zhì)量濃度為0. 3%的戊二醛溶液；用水配制分別配置1?2g/L的 牛血清白蛋白（BSA)溶液；將這兩種酶液分別與戊二醛溶液和牛血清白蛋白溶液按照1 : 0. 5-2:0. 5-2的