專利名稱：微量熒光細胞計數(shù)板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于細胞生物學(xué)熒光檢測技術(shù)領(lǐng)域，是一種微量熒光細胞計數(shù)板。
熒光細胞計數(shù)是熒光方法中的一項基本技術(shù)。熒光方法具有靈敏度高、特異性強、方法簡便的特點。該方法可用于研究細胞及細胞內(nèi)各化學(xué)成分的分布、定位、吸收、轉(zhuǎn)運。當(dāng)前應(yīng)用于熒光細胞計數(shù)的儀器主要有兩種，即流式細胞儀和熒光顯微鏡。流式細胞儀的檢測精確度只有1％左右，在某些檢測工作中難以滿足要求，而且儀器設(shè)備價格昂貴，技術(shù)復(fù)雜，難以普及；至于熒光顯微鏡，它必須結(jié)合一定的觀察視野和容量才能進行計數(shù)其中一種做法是在載玻涂片上隨機選擇任一視野進行檢測計數(shù)，由于該法受視野的大小和選擇次數(shù)的限制，受檢的樣品量受到很大的限制。一般在4X物鏡下，每視野的受檢樣品量不超過1μl，因而可重復(fù)性差，對微量熒光細胞計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。如果進行連續(xù)檢測計數(shù)，則因載玻涂片沒有一定的刻度來定位細胞涂片的深度和視野坐標，而導(dǎo)致細胞堆積重疊和漏檢及重檢，難以滿足微量熒光細胞計數(shù)工作的需要。另一種做法是結(jié)合應(yīng)用常規(guī)的血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，該法又由于每次檢測的樣品量僅為0.9μ1，而難以滿足微量熒光細胞計數(shù)工作的需要。
本實用新型的目的在于提供一種結(jié)合熒光顯微鏡的應(yīng)用，既可人工操作又可微機處理、技術(shù)簡單、價格低廉、檢出率高的微量熒光細胞計數(shù)板。
本微量熒光細胞計數(shù)板是對常規(guī)血細胞計數(shù)板的改進，其板面如

圖1所示。
圖1為計數(shù)板俯視結(jié)構(gòu)示意圖包括計數(shù)板板身1、計數(shù)池2、導(dǎo)液凹槽3。計數(shù)板板身1，與現(xiàn)有血細胞計數(shù)板相同，長度為74mm，寬度為33mm，厚度為10mm；計數(shù)池2位于計數(shù)板中央，其長寬各20mm，以刻度線縱橫平均等分80×80格，共計6400個正方形小格，其深度為0.1mm；蓋玻片也相應(yīng)擴大，其長度約40mm，寬度約25mm，厚度約3mm；該計數(shù)板一次檢測樣品量可達40μl，是常規(guī)的血細胞計數(shù)板或隨機視野檢測容量的40多倍，增加了檢測樣品量，提高了微量熒光細胞檢出率(最低可達1/105陽性率)；導(dǎo)液凹槽3位于計數(shù)池的兩側(cè)，長度與計數(shù)板板身1的寬度相同，槽寬約3mm、深為板厚度的1/2-2/3約6mm。
本微量熒光細胞計數(shù)板檢測方法與常規(guī)的血細胞計數(shù)板計數(shù)類似，但有以下幾點注意事項①上樣取待檢樣品約100μl，滴于計數(shù)池的一端，并在該端蓋上蓋玻片，順勢趕出氣泡并放下另一端，使樣品充盈整個計數(shù)池，靜置2分鐘后便可檢測；②計數(shù)樣品細胞總數(shù)用常規(guī)的血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞總數(shù)，即包括熒光陽性和陰性細胞數(shù)；③將熒光顯微鏡目鏡作適當(dāng)?shù)募夹g(shù)處理由于一般的目鏡其視野為圓形，而計數(shù)池為正方形，為便于計數(shù)，可以用錫箔紙等薄片剪成外圓內(nèi)方的屏蔽，嵌襯于目鏡鏡筒中，使視野變?yōu)榉叫?，與計數(shù)池的方格線相吻合。一般使用4X物鏡和10X目下，可將一直徑為13mm的圓形錫箔紙中央剪出一個15mm×4mm的矩形方框嵌襯于目鏡鏡筒中，這樣在一個視野中便可縱向觀察和檢測14格(排)了；④計數(shù)方法在熒光視野下，由于熒光細胞數(shù)少而且清晰可見，可以快速水平橫向連續(xù)移動計數(shù)池，上下不重疊連續(xù)縱向移動以換行，共換6行(次)便可計數(shù)完畢(6行×14排)；⑤按需要可重復(fù)檢測2-3次，計算陽性熒光細胞率。例如以紅色熒光PKH-26標記的CD34+造血干細胞104個通過靜脈輸入到一個受體小鼠體內(nèi)(該小鼠骨髓細胞總數(shù)一般為108個)，3天后殺死小鼠取兩條股骨的骨髓細胞，先以常規(guī)的血細胞計數(shù)板計數(shù)一定量的骨髓細胞數(shù)，然后離心濃縮至每80-100μl細胞懸液含108個細胞，再以本微量熒光細胞計數(shù)板在熒光顯微鏡下重復(fù)檢測2-3次，用來計數(shù)紅色熒光細胞數(shù)(約1×102-2×102個)，則陽性細胞率為1×10-5～5×10-4，由此可計算出CD34+造血干細胞的歸巢率(10％-20％)。在這種情況下若用流式細胞儀和常規(guī)的血細胞計數(shù)板，是不能完成此項計數(shù)工作的。
⑥為了節(jié)省工作量，也可以結(jié)合高分辨攝像或數(shù)碼照像，通過電腦分析計數(shù)，則過程更為簡單和精確。
優(yōu)點和積極效果本微量熒光細胞計數(shù)板使用簡單方便，一次檢測樣品量可達40μl，大大提高了檢出率，最低可達1/105。本實用新型既可用于檢測各種生物活性熒光細胞，也可以用于檢測非熒光標記的微量細胞(如，精子細胞等)。
權(quán)利要求1.一種細胞計數(shù)板，其特征在于計數(shù)池(2)位于計數(shù)板(1)中央，長寬各20mm，以縱橫刻度線平均等分成80格×80格，共計6400個小格，池深0.1mm，蓋玻片也作相應(yīng)擴大。
專利摘要本實用新型是一種微量熒光細胞計數(shù)板,是對常規(guī)血細胞計數(shù)板的改進,其中央的計數(shù)池長寬各20mm,縱橫均等分成80格×80格,共6400個正方形小格,池深0.1mm,其覆蓋的蓋玻片也作相應(yīng)擴大,一次檢測樣品量為40μl,是常規(guī)血細胞計數(shù)板的40多倍,在熒光顯微鏡下可大大提高熒光細胞檢出率,最低可達1/10
文檔編號G01N15/10GK2377532SQ9922691
公開日2000年5月10日 申請日期1999年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月10日
發(fā)明者項鶯松, 許穎, 趙瑋, 聶艷孝, 鄭振東 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)