專利名稱：Bnp的免疫測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鈉尿肽家族之一的影響腦的鈉尿肽(BNP)的免疫測(cè)定法，更詳細(xì)地講，涉及γ-BNP及其衍生物的免疫測(cè)定法。
背景技術(shù)：
鈉尿肽家族包含影響心房的(ANP)、影響腦的(BNP)和C型(CNP)鈉尿肽3種，其中ANP和BNP主要在心臟中合成，是分泌出的心臟激素。ANP和BNP結(jié)構(gòu)上相類似，ANP是由28個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，它含有第7位和第23位半胱氨酸間通過二硫鍵而形成的鏈接部分。而BNP是由32個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，它含有第10位和第26位半胱氨酸間通過二硫鍵形成的鏈接部分。由這些28和32個(gè)氨基酸構(gòu)成的成熟肽，是在細(xì)胞內(nèi)或從細(xì)胞中分泌的時(shí)候分別從其前體切除前導(dǎo)序列后生成的。即，人BNP在心肌細(xì)胞中以前激素原(以下稱作前BNP原)的形式產(chǎn)生的，在分泌前或分泌時(shí)在Ser 26-His 27間斷裂開，成為前BNP(以下稱作γ-BNP)后，在Arg 102-Ser 103間斷裂開，成為BNP32(以下叫做α-BNP)和BNP(1-76)，具報(bào)道，前者具有活性，以為其活性的表達(dá)至少鏈接部分是必要的。
因?yàn)樾呐K激素的分泌是接受由各種心臟疾病所產(chǎn)生的刺激引起的，所以它能很好地反映心功能的變化。ANP的分泌主要是在心房負(fù)荷的情況下亢進(jìn)，BNP是在心室負(fù)荷下生成、分泌亢進(jìn)的，所以ANP和BNP均可用作心臟疾病診斷的指標(biāo)。隨著它們?cè)谏矬w內(nèi)作用的明確，也就明確了BNP作為心臟疾病診斷指標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)。例如，與正常的血中濃度相比，BNP的濃度不過ANP濃度的1／6，但當(dāng)心功能不全的時(shí)候，它的血中濃度比ANP還高；心功能不全的病例，其血中BNP濃度與ANP濃度均上升，但重癥病例中血漿BNP濃度多超過ANP濃度，在末梢血水平的血漿中，ANP，BNP濃度均伴隨心功能不全的嚴(yán)重程度而增加，但BNP的增加率比ANP大。而且，心功能不全病例中，有時(shí)BNP的值能達(dá)到健康值的數(shù)十～數(shù)百倍，由于心功能不全時(shí)BNP的變動(dòng)有其它激素所無法比擬的顯著，這提示BNP的測(cè)定很有益(齊藤能彥等，Mebio，12(5)，28，(1995))。
這種狀況下就公開了可用于心功能不全診斷的應(yīng)用BNP抗體的免疫測(cè)定法。特表平7-507210公開了測(cè)定通過蛋白酶等在生物體內(nèi)分解得到的γ-BNP(1-76)的方法，但是其方法的測(cè)定對(duì)象是γ-BNP(1-76)，由于它不包含BNP活性表達(dá)所必需的鏈接部分，所以不能直接測(cè)定BNP的激素活性。
作為測(cè)定具有鈉利尿活性的α-BNP的方法，已有市售的應(yīng)用多克隆抗體的測(cè)定試劑盒(“BNP-32”ペニンシユラ公司)。但是，這種測(cè)定測(cè)定了在血中分解缺失了C末端等喪失了活性的α-BNP的分解產(chǎn)物?？紤]到BNP的血中濃度低，不能忽視對(duì)該分解產(chǎn)物的測(cè)定值，因此認(rèn)為該方法做為正確診斷心功能不全的BNP測(cè)定法包含有不適宜的因素。
另一方面，市場(chǎng)有售非上述不合理的BNP測(cè)定試劑盒(シオノリ

BNP鹽野義制藥公司)，其特征在于它應(yīng)用活性表達(dá)所必要的構(gòu)造的識(shí)別抗體。但是，這種測(cè)定中，采血后α-BNP在血中不穩(wěn)定，所以恐怕待檢體的采血和保存方法等對(duì)結(jié)果有很大的影響。因此，為了得到可靠的數(shù)據(jù)，本方法中推薦對(duì)檢測(cè)體進(jìn)行特別處理，如向采血管中添加分解抑制劑，低溫保存標(biāo)本等?？峙逻@樣的處理會(huì)成為該BNP測(cè)定試劑盒廣泛臨床應(yīng)用的障礙。
發(fā)明的公開本發(fā)明人為了建立與BNP相關(guān)的心臟疾病的正確診斷方法而進(jìn)行重復(fù)研究的過程中發(fā)現(xiàn)，血中BNP的存在形式不是象以往認(rèn)為的以α-BNP為主，而是由γ-BNP和至少結(jié)構(gòu)上包含α-BNP的γ-BNP分解產(chǎn)物(以下稱之為γ-BNP衍生物)構(gòu)成。另外發(fā)現(xiàn)，血中γ-BNP比α-BNP穩(wěn)定，即，γ-BNP N末端結(jié)構(gòu)的功能之一是使BNP分子穩(wěn)定。這提示生物體內(nèi)合成至少2種半衰期不同具有BNP活性的BNP分子。在這樣的理論基礎(chǔ)上，本發(fā)明人達(dá)成這樣的見解，為了正確診斷心臟疾病，不僅α-BNP，而且有必要特異性測(cè)定γ-BNP衍生物，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供哺乳類γ-BNP衍生物的特異性免疫測(cè)定方法，其特征在于，它應(yīng)用與哺乳類的α-BNP反應(yīng)的第1抗體和與前BNP原或γ-BNP衍生物反應(yīng)而與α-BNP不反應(yīng)的第2抗體。
本說明書中“哺乳類的α-BNP”是指哺乳類的前BNP原或γ-BNP從其加工信號(hào)序列的羧基末端開始進(jìn)行加工，由N-末端的肽分離而生成的具有利尿活性的低分子量的肽。α-BNP在人中是由序列表的序列號(hào)1中羧基末端的32個(gè)氨基酸(第103～134位)構(gòu)成的、具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽。前BNP原的加工信號(hào)序列的羧基末端位置因種屬而有若干差異。例如，人的BNP時(shí)，序列表的序列號(hào)1中的氨基酸序列中第102位的氨基酸殘基為Arg，相當(dāng)于豬和狗的第100位氨基酸殘基。
“哺乳類的γ-BNP”是指羧基末端有相當(dāng)于α-BNP的32個(gè)氨基酸的肽部分，當(dāng)指人時(shí)，它是由序列表的序列號(hào)1中氨基酸序列的27位His～134位His的108個(gè)氨基酸構(gòu)成的前BNP原?！扒癇NP原”是指，當(dāng)為人時(shí)，它是由序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列中1位Met～134位His的134個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽。
“哺乳類的γ-BNP衍生物”是指由哺乳類的前BNP原或γ-BNP，主要在生物體內(nèi)蛋白酶的作用下生成的、含有α-BNP而比該α-BNP大的肽片段。而通常情況下比γ-BNP小，但比它大的分子亦可。本說明書中若無特別限定，“γ-BNP衍生物”包含γ-BNP本身及其衍生物。
本說明書中與BNP相關(guān)的“穩(wěn)定”是指，經(jīng)蛋白酶分解后，至少羧基末端的連接結(jié)構(gòu)和C末端殘存保持鈉利尿活性，采血后經(jīng)過24小時(shí)，其鈉利尿活性未見顯著減少的狀態(tài)。按照本定義，本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象γ-BNP衍生物是穩(wěn)定的。
另一方面，不穩(wěn)定是指，經(jīng)蛋白酶等作用C末端分解，采血后經(jīng)24小時(shí)其鈉利尿活性顯著減低的狀態(tài)。按照此定義，α-BNP不穩(wěn)定。
附圖簡(jiǎn)述

圖1用α-BNP測(cè)定體系進(jìn)行測(cè)定時(shí)血漿樣品的Superdex 75凝膠過濾HPLC的色譜圖。圖中A表示α-BNP的洗脫位置。圖2用α-BNP測(cè)定體系進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與圖1不同的血漿樣品經(jīng)Superdex 75凝膠過濾HPLC的色譜圖。圖中A表示α-BNP的洗脫位置。圖3用γ-BNP特異性免疫測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，與圖2相同血漿樣品經(jīng)Superdex 75凝膠過濾HPLC的色譜圖。圖中A表示α-BNP的洗脫位置。圖425℃保存人血漿中的γ-BNP時(shí)，保存時(shí)間與BNP免疫活性間的關(guān)系圖。圖54℃保存人血漿中的α-BNP時(shí)，保存時(shí)間與α-BNP免疫活性間的關(guān)系圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的第1方式涉及應(yīng)用與哺乳類的α-BNP反應(yīng)的第1抗體和與前BNP原或γ-BNP衍生物反應(yīng)而與α-BNP不反應(yīng)的第2抗體的方法。
該方法中所使用的抗體既可以是單克隆抗體又可以是多克隆抗體，第1抗體能以在市場(chǎng)上出售的?；蛘弑绢I(lǐng)域技術(shù)人員用已知方法化學(xué)合成的人α-BNP或其部分肽作免疫原，用該領(lǐng)域中已知的方法制備出來?；蛘咭部蓱?yīng)用市售的α-BNP測(cè)定試劑盒(シオノリ

BNP鹽野義制藥公司)中應(yīng)用的與α-BNP羧基末端部分進(jìn)行反應(yīng)的單克隆抗體。
第2抗體可應(yīng)用滿足上述條件的任意抗體，優(yōu)選例如序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列中氨基酸序號(hào)27-120所示的氨基酸序列及其代謝產(chǎn)物特異的抗體。本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象γ-BNP衍生物，當(dāng)為人時(shí)，優(yōu)選至少包含序列號(hào)1的氨基酸序列中序號(hào)27-134所示的部分氨基酸序列。因此，作為優(yōu)選方式，在制備本發(fā)明方法中應(yīng)用的第2抗體時(shí)，有必要注意選擇能制備識(shí)別序列號(hào)1的氨基酸序號(hào)27-102的抗體的抗原。可應(yīng)用該領(lǐng)域中已知的方法來進(jìn)行該抗體的制備。理論上認(rèn)為γ-BNP能被蛋白酶酶切的可能部位包含該序列號(hào)1的第47位的Arg，53位的Lys和72位的Arg。因此，識(shí)別序號(hào)1中氨基酸序號(hào)73-102的抗體可用作第2抗體。
本發(fā)明的測(cè)定法既可用競(jìng)爭(zhēng)法，亦可用夾心法，所用的抗體既可為單克隆抗體又可為多克隆抗體。
第1抗體和第2抗體中至少有一方進(jìn)行可檢測(cè)的標(biāo)記，或固相化。
抗體的標(biāo)記方法以及固相化方法是該領(lǐng)域人員已知的。可應(yīng)用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物或粒子等進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)此沒有限定?？贵w的標(biāo)記方法也是已知的，例如可應(yīng)用河野等(核醫(yī)學(xué)技術(shù)，13(1)，2(1993))的方法進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還提供哺乳類γ-BNP衍生物特異的免疫測(cè)定試劑盒，其特征在于，它包含與哺乳類的α-BNP反應(yīng)的第1抗體和與前BNP原或γ-BNP衍生物反應(yīng)而與α-BNP不反應(yīng)的第2抗體。
本發(fā)明的試劑盒無論應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法或夾心法均可，所用抗體既可為單克隆抗體又可為多克隆抗體。
第1抗體和第2抗體中至少一方進(jìn)行可檢測(cè)性標(biāo)記，或進(jìn)行固相化。再者，本發(fā)明的試劑盒亦可包含檢測(cè)標(biāo)記的手段。標(biāo)記可應(yīng)用放射性同位素、酶、熒光素、發(fā)光物或粒子等進(jìn)行，但不限于此。
以下例舉實(shí)施例和試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于此。實(shí)施例1用夾心IRMA法測(cè)定γ-BNP的衍生物下面的實(shí)施例中，一般的試劑應(yīng)用和光純藥或ナカライテスク公司的特級(jí)試劑，牛血清白蛋白(BSA)使用Sigma公司的。(1)血漿樣品的制備1)從心臟病患者或者健康的自愿者采取靜脈血到添加有來源于牛肺的抑肽酶(Sigma公司生產(chǎn))(500KIU／L)的EDTA采血管中，4℃、2000×g離心5分鐘(コクサン公司H-107RGA)，分離血細(xì)胞。將所得血漿樣品-80℃凍存，備用。
2)將上述1)中制備的來源于心臟病患者和健康人的血漿在凝膠過濾HPLC系統(tǒng)LC10A (島津制作所)上用Superdex 75 10／30柱(Pharmacia)進(jìn)行分級(jí)分離。用0．1M磷酸緩沖液(pH 7．5，0．3MNaCl、5mM EDTA)，以流速1ml／min平衡柱子后，注入1ml血漿樣品，以1m1／份收集柱上的流出液。依照下面(2)-2)的α-BNP測(cè)定法和(2)-3)的γ-BNP測(cè)定法，分別測(cè)定各部分。(2)α-BNP測(cè)定體系及γ-BNP衍生物測(cè)定體系的構(gòu)建1)用以下的肽、抗體和試劑盒進(jìn)行測(cè)定?！と甩?BNP(肽研究所)·γ-hBNP氨基末端部分(序列號(hào)1中的氨基酸序號(hào)27-64)的抗體(肽研究所)·α-BNP羧基末端部分的單克隆抗體(BC203)。
BC203是シオノリア BNP試劑盒(鹽野義制藥公司)中附帶的α-BNP羧基末端(129-134)的單克隆抗體，固化到珠上，作為固相抗體應(yīng)用。α-BNP連接結(jié)構(gòu)部分相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體(KY-BNPII)。
KY-BNPII是シオノリア BNP試劑盒(鹽野義制藥公司)中付帶的與α-BNP連接結(jié)構(gòu)(112-128)相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體，用125I標(biāo)記的。
2)應(yīng)用α-BNP測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定血漿流份應(yīng)用市售的シオノリアBNP試劑盒(鹽野義制藥公司)測(cè)定α-BNP。該系統(tǒng)中應(yīng)用α-BNP連接結(jié)構(gòu)的單抗(KY-BNPII)和羧基端的單克隆抗體(BC203)，按照供給者的提示，用夾心I RMA(ImmunoRadioMetricAssay)法進(jìn)行測(cè)定)。
即，將各待測(cè)樣品和各種標(biāo)準(zhǔn)品100μl(α-BNP溶液；0，4，10，130，600，2000pg／ml)分別加到聚苯乙烯制的試管中，添加200μl碘化BNP抗體(125I)溶液加入1個(gè)BC203抗體固相化聚苯乙烯珠，攪拌后，4℃靜置18小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)。用2ml洗滌液洗滌2次后，用γ計(jì)數(shù)儀ARC-600(アロカ公司生產(chǎn))測(cè)定放射活性。結(jié)果如圖1和圖2所示。
3)用γ-BNP衍生物測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定血漿級(jí)份首先用125I標(biāo)記γ-hBNP氨基末端部分(27-64位)的抗體。
應(yīng)用MASPII試劑盒(BioRad公司生產(chǎn))從與γ-hBNP氨基末端部分(序列號(hào)1的氨基酸序號(hào)27-64部分)相應(yīng)的抗血清(肽公司生產(chǎn))中純化IgG，用セントリコン 30(アミコン公司生產(chǎn))置換為0．5M磷酸緩沖液(pH 7．5)。用氯胺T法進(jìn)行抗體標(biāo)記。將純化IgG溶液170μl(77．6μg IgG)分加到玻璃試管中，加入10μl(34．2MBq)Na125I溶液(アマシヤム公司生產(chǎn))。加入0．1％氯胺T溶液20μl，室溫劇烈攪拌30秒鐘后，分別加入20μl的0．23％。焦亞硫酸鈉溶液和5％碘化鉀水溶液，終止反應(yīng)。從Ampure SA柱(アマシヤム)上除去未反應(yīng)的125I并進(jìn)行脫鹽，得到含有125I標(biāo)記抗體的溶液。
接著，應(yīng)用該抗體和將α-BNP羧基末端識(shí)別抗體(BC203)固相化的聚苯乙烯珠，對(duì)血漿的各部分進(jìn)行夾心IRMA測(cè)定。
將各待測(cè)樣品100μl分別加到聚苯乙烯試管中，加入200μl的0．1M磷酸緩沖液(pH 7．5 0．3M、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0．2％BSA，500KIU／L來源于牛肺的抑肽酶(Sigma公司生產(chǎn))，加入1個(gè)BC203抗體固相化聚苯乙烯珠，攪拌后，4℃靜置18小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)。用2ml的洗滌液洗滌2次后，加入125I標(biāo)記抗體溶液300μl，攪拌，4℃靜置18小時(shí)使之反應(yīng)。用2ml的洗液洗滌2次后，用γ計(jì)數(shù)儀ARC-600(アロカ)測(cè)定放射活性。結(jié)果如圖3所示。(3)結(jié)果對(duì)患者血漿進(jìn)行凝膠過濾HPLC色譜分析的測(cè)定結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示。這些圖中，A為α-BNP的洗脫位置。
圖1表示用上述(2)-2)的α-BNP測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖中，縱軸是各部分中用シオノリアBNP測(cè)定出的BNP樣物質(zhì)的濃度，橫軸表示從柱上洗脫出的重量。實(shí)心三角、空心正方形方框和空心菱形分別表示不同血漿樣品的測(cè)定結(jié)果。
圖2表示用上述(2)-2)的α-BNP測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定與圖1不同樣品的結(jié)果。圖中縱軸表示用シオノリア BNP測(cè)定出的各部分中BNP樣物質(zhì)的濃度，橫軸表示從柱上洗脫下的容量。另外實(shí)心三角和實(shí)心正方形表示不同的血漿樣品。
從圖1和圖2可以看出，心臟病患者的血漿中存在比α-BNP分子量大的BNP免疫活性樣物質(zhì)，它是具有BNP免疫活性的主要物質(zhì)。
圖3表示應(yīng)用與圖2相同的樣品，用上述(3)-3)記載的本發(fā)明的γ-BNP測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，縱軸表示用本發(fā)明的γ-BNP免疫測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定出的放射活性，橫軸表示從柱上洗脫出的容量。另外，實(shí)心圓圈表示α-BNP。圖3中實(shí)心圓圈是將α-BNP溶液與血漿同樣進(jìn)行HPLC分級(jí)分離所測(cè)定的結(jié)果。
從圖3中可以看出，本發(fā)明的γ-BNP衍生物特異的免疫測(cè)定法可檢測(cè)出具有BNP免疫活性的主要物質(zhì)，但完全不能檢測(cè)出α-BNP。
以上結(jié)果表明，本發(fā)明的γ-BNP免疫測(cè)定方法不識(shí)別α-BNP，它是γ-BNP衍生物特異的測(cè)定方法。另外還表明具有BNP免疫活性的主要物質(zhì)為γ-BNP。試驗(yàn)例1γ-BNP衍生物及α-BNP在血漿中的穩(wěn)定性根據(jù)上述實(shí)施例1中心臟病患者血漿樣品凝膠過濾HPLC的結(jié)果。收集認(rèn)為含有γ-BNP衍生物的部分。應(yīng)用未添加來源于牛肺的抑肽酶的EDTA采血管，從健康自愿者采靜脈血，按照與上述(1)-1)同樣的操作得到血漿樣品(未滿α-BNP最小檢出界限(4pg／ml)，添加上述級(jí)份后，室溫(25℃)放置0、2、6、24小時(shí)，用測(cè)定α-BNP的シオノリアBNP試劑盒測(cè)定BNP免疫活性，檢測(cè)γ-BNP衍生物的穩(wěn)定性。
另一方面，向與上述同樣的不包含來源于牛肺的抑肽酶的健康自愿者血漿中加入化學(xué)合成的α-BNP后4℃放置0、2、6、24小時(shí)，用同樣的シオノリアBNP試劑盒測(cè)定BNP免疫活性，檢測(cè)α-BNP穩(wěn)定性。
γ-BNP衍生物及α-BNP在血漿樣品中的免疫活性穩(wěn)定性的結(jié)果分別示于圖4和圖5中。
從圖4可以看出，γ-BNP衍生物即便在25℃放置24小時(shí)，與初始值的免疫活性相比較未見到顯著性降低，與此相對(duì)，從圖5可以看出，α-BNP 4℃放置24小時(shí)時(shí)，其免疫活性降低到初始值的40％左右。
以上結(jié)果提示α-BNP與γ-BNP衍生物相比，它在血液中極不穩(wěn)定，對(duì)于心臟疾病的患者更適宜。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，在心功能不全的病例中，BNP值增加到健康者的數(shù)十倍～數(shù)百倍，由于在心功能不全中BNP的變動(dòng)有其它激素類無法比擬的顯著，提示了BNP測(cè)定的有用性。
本發(fā)明的免疫測(cè)定法不測(cè)定α-BNP，而是γ-BNP衍生物特異的測(cè)定方法。所以本發(fā)明的測(cè)定法能提供與以往通過BNP測(cè)定來判斷的心功能不全的診斷及監(jiān)測(cè)預(yù)后的判定不同的臨床意義。
另外，本發(fā)明測(cè)定方法的測(cè)定對(duì)象γ-BNP，如本說明書開始闡明的那樣在血中穩(wěn)定。因此本發(fā)明的測(cè)定法可提供不受測(cè)定樣品的采取法、保存法及到測(cè)定時(shí)的時(shí)間影響的、穩(wěn)定、可靠的臨床數(shù)據(jù)，而且，因?yàn)椴裳獦悠窡o需進(jìn)行特殊處理，所以可簡(jiǎn)便地得到臨床數(shù)據(jù)，為心臟疾病的正確診斷做出貢獻(xiàn)。
序列表<110>Shionogi & Co Ltd．<120>BNP的免疫測(cè)定<130>660984<140><141><150>JP 246684／1997<151>1997-9-11<160>2<117>Word(MS-DOS文本)<210>1<211>436<212>DNA<213>人<400>1atg gat ccc cag aca gca cct tcc cgc gcg ctc ctg ctc ctg ctc ttc48Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe15 10 15ttg cat ctg gct ttc ctg gga ggt cgt tcc cac ccg ctg ggc agc ccc96Leu His Leu Ala Phe Lue Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro20 25 30ggt tca gcc tcg gac ttg gaa acg tcc ggg tta cag gag cag cgc aac 144Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn35 40 45cat ttg cag ggc aaa ctg tcg gag ctg cag gtg gac cag aca tcc ctg 196His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu50 55 60gag ccc ctc cag gag agc ccc cgt ccc aca ggt gtc tgg aag tcc cgg244Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg65 70 75 80gag gta gcc acc gag ggc atc cgt ggg cac cgc aaa atg gtc ctc tac292Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Try85 90 95acc ctg cgg gca cca cga agc ccc aag atg gtg caa ggg tct ggc tgc340Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys100 105 110ttt ggg agg aag atg gac cgg atc agc tcc tcc agt gcc ctg ggc tgc388Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys115 120125aaa gtg ctg agg cgg cat436Lys Val Leu Arg Arg His130 134<210>2<211>134<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>2Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe15 10 15Leu His Leu Ala Phe Lue Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro20 25 30Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn35 40 45His Leu Gln gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu50 55 60Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg65 70 75 80Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Try85 90 95Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys100 105 110Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys115 120125Lys Val Leu Arg Arg His130 13權(quán)利要求
1．哺乳類γ-BNP衍生物特異的免疫測(cè)定方法，其特征在于，它應(yīng)用與α-BNP反應(yīng)的第1抗體和與前BNP原或γ-BNP衍生物反應(yīng)而α-BNP不反應(yīng)的第2抗體。
2．權(quán)利要求1的方法，其中γ-BNP衍生物包含序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列中氨基酸序號(hào)27-102位的氨基酸序列。
3．權(quán)利要求1的方法，其中第2抗體是序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列中27-102位氨基酸序列特異的抗體。
4．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的方法，其中特征在于，第1抗體和第2抗體中至少有一方被可檢測(cè)性的標(biāo)記或被固相化。
5．權(quán)利要求中1～3任一項(xiàng)的方法，其中可檢測(cè)性標(biāo)記為放射性同位素、酶、熒光素、發(fā)光物或粒子。
6．用于哺乳類的γ-BNP衍生物特異性免疫測(cè)定的試劑盒，其特征在于，它包含與哺乳類的α-BNP反應(yīng)的第1抗體和與前BNP原或γ-BNP衍生物反應(yīng)而不與α-BNP反應(yīng)的第2抗體。
7．權(quán)利要求6的試劑盒，其特征在于，第1抗體和第2抗體中至少一方被可檢測(cè)性標(biāo)記或固相化。
8．權(quán)利要求7的試劑盒，其特征在于，它包含檢測(cè)標(biāo)記的手段。
全文摘要
一種哺乳類γ－BNP衍生物特異的免疫測(cè)定方法,它包括應(yīng)用與哺乳類α－BNP反應(yīng)的第1抗體和與前BNP原或γ－BNP衍生物反應(yīng)而與α－BNP不反應(yīng)的第2抗體,其中至少一種抗體被可檢測(cè)性標(biāo)記或被固相化。
文檔編號(hào)G01N33/74GK1278919SQ98811053
公開日2001年1月3日 申請(qǐng)日期1998年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月11日
發(fā)明者淺田英久, 清水洋行, 遠(yuǎn)藤三朗 申請(qǐng)人:鹽野義制藥株式會(huì)社