專利名稱：釩溴過氧化物酶作為化學發(fā)光體系中產(chǎn)生信號之酶的應用:測試藥盒和分析方法
發(fā)明的領(lǐng)域
本發(fā)明涉及利用釩溴過氧化物酶作為產(chǎn)生信號之酶來檢測各種分析物有關(guān)的化學發(fā)光組合物，測試藥盒以及方法。
發(fā)明的背景
眾所周知，將待測的含水液體與一種能產(chǎn)生與該液體中分析物成比例的，可檢測地輸出信號的試劑組合物相接觸，就可以對該含水液體作定量或定性分析。一類有效的檢測方法是利用某些酶促反應來進行，其中，在一種合適的酶存在下，該分析物與合適的試劑接觸后，與氧起反應，而產(chǎn)生與該分析物濃度成比例的過氧化氫。然后，再通過待測液體中與分析物濃度成比例的過氧化氫的反應，而產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。分析物，如葡萄糖、甘油三酸脂、尿酸、膽甾醇和肌酸激酶都可以這樣檢測。在這些檢測方法中，通常使用過氧化物酶。
在其它檢測方法中，使一種過氧化物酶在已加入到該體系中的過氧化氫存在下發(fā)生反應，可以測定一種特定分析物的含量。例如，在利用過氧化物酶作為標記的特異性結(jié)合檢測法中，用配位體的特異性結(jié)合為特征的檢測方法就是如此。這種檢測方法可以在溶液中、在表面或在診斷用的測試裝置中進行。在這種檢測方法中產(chǎn)生的信號，可以是利用熟知的產(chǎn)生信號的試劑所產(chǎn)生的比色信號、化學發(fā)光信號或熒光信號。
由于待測分析物的存在而發(fā)光的過氧化物酶依賴型發(fā)光或光度檢測方法有幾種主要的類型。這些檢測方法也稱為化學發(fā)光檢測法，在例如Kricka等人的美國專利4,729,950中及其所引用的文獻中有所介紹。在這類檢測方法中，各種芳基胺和芳基酚，如4-碘酚都有利于增強發(fā)光(參見Kricka等人的美國專利4,598,044)。Friedman等人的美國專利5,372,931提出某些含水組合物，該組合物利用某些4′-羥基-和烷氧基取代的苯基或萘基的電子遷移劑來增強信號。
雖然，增強過氧化物酶依賴型化學發(fā)光體系的先有技術(shù)產(chǎn)生的光信號，已足以用于免疫檢測，但先有技術(shù)的試劑配方有某些已知的缺點。例如，含有上述化學發(fā)光增強劑的試劑組合物比較復雜，而且易于出現(xiàn)貯藏不穩(wěn)定性。在先有技術(shù)的配方中，需要嚴格控制幾種試劑的活性，這是制造中相當困難的問題。
此外，先有技術(shù)的信號動力學強烈依賴于過氧化物酶的含量，這可能導致標定值呈非線性。
最近，Butler和Walker介紹了從水藻和海藻中提取的釩溴過氧化物酶族以及從陸生地衣和真菌類中提取的某些釩溴過氧化物酶，它們在過氧化氫和溴陰離子的存在下，催化生成某些激活的溴，這些溴是很強的氧化劑(參見，Butler et al.，Chem.Revs.，93，pp.1937-1944，1993，及其參考文獻，和Wever，et al.，Biochem.Phys.Acta，830，pp.181-186，1985，及其參考文獻)。在這里引入上述二篇文獻以供參考。
大多數(shù)鹵素過氧化物酶的問題之一是，它們的pH最佳值通常在較低范圍，即3-5。這對于依賴于過氧陰離子的、以過氧化物酶為基礎(chǔ)的化學發(fā)光體系來說會引起問題；一般情況下，過氧化氫的pKa為約11.5。釩溴過氧化物酶在pH約6-10的范圍內(nèi)才有效地起作用。
雖然，先有技術(shù)中公開的產(chǎn)生信號的含水組合物在許多分析系統(tǒng)中顯示出十分良好的性能，但仍需進一步改進。例如，仍希望提供一種較簡單的產(chǎn)生信號的組合物；即不使用美國專利5,372,931號中所述的電子遷移劑的組合物。而且，還希望研制一種含水組合物，該組合物與已知的先有技術(shù)體系相比較，具有改進的酶穩(wěn)定性、更高的靈敏度和改進的信號輸出。
發(fā)明的概述
在本發(fā)明中，一種提供化學發(fā)光信號的、pH約6.5到約10的含水的分析組合物，滿足了對分析組合物及方法進一步改進的需要。具體地說，具有上述性質(zhì)的、本發(fā)明的產(chǎn)生化學發(fā)光信號的組合物含有
(a)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑，該試劑能應答釩溴過氧化物酶的催化活性產(chǎn)生信號，所說的產(chǎn)生信號的試劑是2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；
(b)一種鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和
(c)一種過氧化物或一種產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。
本發(fā)明還提出一種診斷用的測試藥盒，用來根據(jù)釩溴過氧化物酶的催化活性測定分析物。
根據(jù)本發(fā)明的這個具體實施方案診斷用測試藥盒包括
(i)上述產(chǎn)生信號的組合物；和
(ii)一種釩溴過氧化物酶或一種釩溴過氧化物酶標記的特異性結(jié)合的分子。
本發(fā)明的另一個目的是提出一種方法，能應答釩溴過氧化物酶而產(chǎn)生可檢測的信號。具體地說，本發(fā)明的方法包括
(A)在上述產(chǎn)生信號組合物存在下，使一種釩溴過氧化物酶起反應；和
(B)測定所產(chǎn)生的化學發(fā)光信號，以作為該釩溴過氧化物酶的度量。
本發(fā)明進一步提出一種特異性結(jié)合的檢測方法，用來測定特異性結(jié)合的配位體，該方法包括
(A)使一種特異性結(jié)合的配位體與一種對該配位體有特異性的受體相配合，以形成一種特異性結(jié)合的配合物；
(B)用一種釩溴過氧化物酶標記該特異性結(jié)合的配合物，該釩溴過氧化物酶可以與該受體共軛，或與一種特異性結(jié)合的分子共軛，而該分子是可以與該特異性結(jié)合的配位體或該受體起反應的；
(C)把未配合的物質(zhì)從該釩溴過氧化物酶標記的配合物中分離出去后，用上述產(chǎn)生信號的組合物接觸該配合物；和
(D)測定所產(chǎn)生的信號，以作為該特異性結(jié)合的配位體的度量。
本發(fā)明提供了先有技術(shù)所有已知的優(yōu)點，這些優(yōu)點是與使用各種化學發(fā)光檢測方法相聯(lián)系的；但是本發(fā)明在反應系統(tǒng)中還使用各種釩溴過氧化物酶的化合物。應當進一步看到，使用本發(fā)明的產(chǎn)生信號的組合物，該檢測方法除了能提供先有技術(shù)所有已知的優(yōu)點外，還更為靈敏。
此外，本發(fā)明的組合物顯示出穩(wěn)定的動力學特性，其中，發(fā)光信號長時間保持恒定的光強。而且，本發(fā)明較簡單的組合物，不再需要有機增強劑化合物。
附圖簡要說明


圖1是使用一種本發(fā)明組合物和一種如美國專利5,372,931實施例1中所述的對照組合物，所得到的化學發(fā)光信號的圖示。
圖2是使用一種本發(fā)明的組合物和一種如美國專利5,372,931實施例1中所述的對照組合物，所得到的信噪應答曲線的圖示。
圖3是使用本發(fā)明產(chǎn)生信號的組合物所得到的釩溴過氧化物酶反應的動力學圖示。
圖4是美國專利5,372,931實施例1中所述的一種HRP對照組合物在50,000微微微摩爾(10-18摩爾)濃度下的信號輸出的圖示，以及與相同濃度的釩溴過氧化物酶的比較。
發(fā)明的詳細描述
本發(fā)明可實施于任何一種能促進應答釩溴過氧化物酶的存在而產(chǎn)生化學發(fā)光信號的分析方法中。這種檢測方法可能涉及有機或無機過氧化物(如過氧化氫)或釩溴過氧化物酶的檢測，或涉及除釩溴過氧化物酶或過氧化氫之外的非免疫分析物的檢測。特別是，本發(fā)明在能產(chǎn)生化學發(fā)光信號的特異性結(jié)合檢測法的實際應用中是很有效的。
該檢測方法可以是定性的或定量或既定性又定量的，而且可用于檢測含水液體中的生物或化學物質(zhì)(即分析物)，包括人體或動物的生物體液、廢液、食品、環(huán)境污水，化學處理的液體和本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯而易見的其它試樣中的生物學或化學物質(zhì)。
過氧化氫(或其它過氧化物)可以用本發(fā)明來測定。另外，本發(fā)明可用來測定能產(chǎn)生過氧化氫的分析物，即該分析物參與在合適的產(chǎn)生信號的試劑，和釩溴過氧化物酶的存在下產(chǎn)生過氧化氫的一個或多個反應。這里，把這種分析物看作是“在催化意義上與釩溴過氧化物酶相關(guān)的分析物”。
在一個優(yōu)選的具體方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生信號的組合物有效地用于測定一種特異性結(jié)合的配體，或它相應的受體(即一種與該配體特異性結(jié)合的物質(zhì))。所述配體包括(但不限于)抗體、抗體片斷和其它蛋白質(zhì)(包括脂蛋白、血液蛋白、酶和糖蛋白)、半抗原、藥品、荷爾蒙、甾類化合物、毒素、病毒、細菌、維他命、糖(包括多糖)、類脂物、核酸、非蛋白質(zhì)的血液成分，或任何一種本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員都已熟知的成份。
如上所述，本發(fā)明涉及一種能產(chǎn)生化學發(fā)光信號的、pH值約6.5到約10的分析組合物，所說組合物包含
(a)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑，該試劑應答釩溴過氧化物酶的催化活性產(chǎn)生信號，其中，該產(chǎn)生信號的試劑是2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；
(b)一種鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和
(c)一種過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。
如上所述，本發(fā)明產(chǎn)生信號的組合物含有2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物(本文中稱為“DPD”)作為它的一個組分?？梢栽诨瘜W發(fā)光反應中轉(zhuǎn)換成激發(fā)態(tài)，然后返回非激發(fā)態(tài)并同時發(fā)光的任何一種游離的或共軛的DPD，在本發(fā)明的實際應用中都是很有用的。本領(lǐng)域中已經(jīng)知道大量的這類化合物，包括Kricka等人的美國專利4,598,044中和Grundermann等人的“有機化學中的化學發(fā)光”一書(SpringerVerlag，Berlin，1987，Pages 204-207)中所介紹的那些化合物。
這類化合物通常稱為“魯米諾型酰肼”，包括鄰苯二甲酰肼、萘-1，2-二羧酸酰肼、蒽-2，3-二羧酸酰肼、菲-1，2-二羧酸酰肼、芴-1，2-二羧酸酰肼、苯并〔g，h，i〕苝-1，2-二羧酸酰肼、蔻-1，2-二羧酸酰肼、和其它本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯而易見的化合物。
具體來說，本發(fā)明中可以采用的DPD化合物由下述結(jié)構(gòu)式所定義
其中，Z1、Z2、Z3、和Z4相互獨立地是氫；含有約1到約6個碳原子的烷基，如甲基、乙基、異丙基、叔-丁基，仲戊基和己基；含有約2到約6個碳原子的鏈烯基，如乙烯基、1-丙烯基、異丁烯基、2-(N，N-二異丙氨基)乙烯基、2-(N，N-二異丁氨基)乙烯基、2-(N，N-二異戊氨基)乙烯基和2-己烯基；羥基；含有約1到約6個碳原子的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、異丙氧基、叔-丁氧基和己氧基；羧基；氨基(包括由烷基或烷?；〈陌被?，如甲氨基、乙氨基、酰氨基(例如，乙酰氨基和己酰氨基)、二甲氨基、二乙氨基和二異丁氨基；共軛的氨基烯烴基(如下面的定義)；或包括取代的氨基芳基在內(nèi)的氨基芳基，如P-(N，N-二甲氨基)苯基、P-(N，N-二乙氨基)苯基和5-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮-8-基(也稱為Luminyl)。
Z1和Z2中至少有一個是氨基(包括上面定義的取代的氨基)，共軛的氨基鏈烯基(包括上面定義的取代的氨基鏈烯基)或氨基芳基，如P-(N，N-二甲氨基)苯基、P-(N，N-二乙氨基)苯基和5-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮-8-基。正如在本文中已應用的，“共軛的氨基鏈烯基”一詞指的是一種從氨基經(jīng)過鏈烯基到被取代的二氮雜萘二酮芳基能夠產(chǎn)生電子共振的一價基團，它包括，例如，二烷氨基乙烯基，如2-(N，N-二異丙氨基)乙烯基、2-(N，N-二異丁氨基)乙烯基和2-(N，N-二異戊氨基)-乙烯基；以及二烷基氨丁二烯基團，如4-(N，N-二乙氨基)-1，3-丁二烯-1-基。
此外，Z1、Z2、Z3和Z4中任何相鄰的二個、相鄰的三個或全部四個(即二個或三個相鄰基團，或全部四個基團)可以一起形成含有一個或多個芳香環(huán)的稠環(huán)體系。這種稠環(huán)可以被下列基團取代一個或多個羥基、氨基(如上定義的取代或未取代的氨基)或含有約1個到約4個碳原子的烷氧基，如甲氧基、乙氧基和異丙氧基。優(yōu)選這種稠環(huán)由一個或多個伯胺、仲胺或叔胺，羥基或烷氧基(如上定義)所取代。
代表性的有用DPD化合物包括(但不限于)魯米諾、異魯米諾、N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾半琥珀酰亞胺、N-(6氨己基)-N-乙基異魯米諾、N-乙基異魯米諾和7-二甲氨基萘-1，2-二羧酸酰肼。優(yōu)選魯米諾(5-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮)和異魯米諾(6-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮)，最優(yōu)選的是魯米諾。
DPD化合物中其它有用的類型在上面引述的Gundermann等人的書中有所介紹，它們包括取代或未取代的苯二甲酸酰肼、蒽-2，3-二羧酸酰肼、菲二羧酸酰肼、芴-1，2-二羧酸酰肼，苯并〔g，h，i〕苝-1，2-二羧酸酰肼和蔻-1，2-二羧酸酰肼，正如下述結(jié)構(gòu)式的化合物
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可判斷出能用于本發(fā)明的其它二氮雜萘二酮類似物包括Masuya等人在歐洲專利申請91310875.9和Yamaguchi在美國專利5,324,835中公開的化合物。這些專利內(nèi)容收入本文作為參考。
上述化合物可從市場上購得，或者用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的原料和方法制得。
本發(fā)明產(chǎn)生信號的組合物的第二種成分是鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料。這里所用的術(shù)語“鹵素或提供鹵素的原料”指的是任何一種加入到本發(fā)明組合物中能提供鹵素陰離子，即氟、氯、溴和碘陰離子的物質(zhì)。這包括鹵素如氯、溴和碘。提供鹵素的原料可以包括一種金屬或非金屬的鹽、包括(但不限于)銨、烷基銨、取代的烷基銨、芳基銨、取代的芳基銨、鐘、氧鎓、鎓、锍等物質(zhì)。一般情況下，提供鹵素的原料以IA族金屬鹽形式加入到該組合物中，但也不只限于IA族金屬鹽。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，該提供鹵素的原料是NaBr或溴化銨。
這里所用的術(shù)語“假鹵素或提供假鹵素的原料”，指的是任何一種加入到本發(fā)明組合物中能提供與鹵素相近的高度電子親和力之陰離子的物質(zhì)。應當指出，一般情況下，提供假鹵素的原料是IA族金屬化合物，但不限于此種化合物。在產(chǎn)生信號的分析組合物中可以存在的合適的假鹵素包括(但不限于)CN-、SCN-、OCN-，疊氮化物、異腈等。假鹵素中特別優(yōu)選SCN-。
本發(fā)明的分析組合物中的第三種成分是過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。術(shù)語“過氧化物”包括無機的或有機的過氧化物化合物，一般都是先有技術(shù)中已采用過的。“產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物”一詞，是包括任何一種加入到本發(fā)明的組合物中能產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。這種產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的，它們包括(但不限于)過硼酸鹽，過乙酸鹽、過氧化脲，和有機過氧化物，如過酸、過苯甲酸和過硫酸氫鉀制劑、以及氫過氧化物。
通常，用一種或多種pKa為約6.0到8.0的合適生物緩沖溶液把本發(fā)明的分析組合物緩沖到pH從約6.5到約10，更優(yōu)選約6.8到約8.0。這些緩沖溶液在本領(lǐng)域中是眾所周知的。這些緩沖溶液的典型例子包括(但不限于)三(羥甲基)氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)；2-〔N-嗎啉代〕乙烷磺酸(MES)，哌嗪-N，N′-二〔2-乙烷磺酸〕(PIPES)；3-〔N-嗎啉代〕-2-羥丙烷磺酸(MOPSO)，磷酸鹽緩沖溶液等。上述生物緩沖液中，特別優(yōu)選Tris-HCl。
該分析組合物也可以含有有機溶劑，例如，(但不限于)四氫呋喃、乙腈、己烷、己烷異構(gòu)體、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇等。本發(fā)明的分析組合物可以含有有機溶劑混合物或水-有機溶劑混合，其配伍比例視特定用途可按需要確定，這是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。
本發(fā)明的產(chǎn)生信號組合物中，每種成分的含量可以隨其特定用途、所用試劑的具體靈敏度和其它參數(shù)的不同而變化，這是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。因此，下述的一般范圍只是為專業(yè)人員提供指南，而并不限制本發(fā)明的實際應用。
具體來說，本發(fā)明中采用的緩沖溶液的量對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的，因為都知道如何確定為保持預定的pH所需的任何一種緩沖溶液的量。產(chǎn)生信號的化合物(DPD)的量，通常至少是約0.01毫摩爾；優(yōu)選范圍是約0.1到約10毫摩爾。
至于第二種成分，即鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料，通常存在的量至少約0.1毫摩爾。更優(yōu)選本發(fā)明產(chǎn)生信號的組合中存在的鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料，其量為約50到約100毫摩爾。
至于第三種成分，即過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物，在產(chǎn)生信號的組合物中存在的量至少為約0.02毫摩爾。更優(yōu)選該過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物存在的量為約0.5毫摩爾到1.0毫摩爾。
本發(fā)明還提供一種含有釩溴過氧化物酶的含水組合物，它含有一種游離態(tài)釩溴過氧化物酶，或帶有特異性結(jié)合分子(如抗體、抗生物素蛋白或生物素)的標記共軛釩溴過氧化物酶，和上文描述過的產(chǎn)生信號的組合物。這種組合物也可以象上述對本發(fā)明的產(chǎn)生信號的組合物所做的那樣緩沖調(diào)整pH。釩溴過氧化物酶或釩溴過氧化物酶標記的特異性結(jié)合分子，和產(chǎn)生信號的組合物的用量對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員是顯而易見的。
除了上述組合物外，本發(fā)明還提供用于各種分析方法(如下面所述)的藥盒、裝置和指導。藥盒各成分的包裝(單獨包裝或予混在一起)都是本領(lǐng)域熟知的。
在一個具體的實施方案中，藥盒包括上述產(chǎn)生信號的組合物，和一種釩溴過氧化物酶或釩溴過氧化物酶標記的特異性結(jié)合分子。“特異性結(jié)合分子”一詞，指的是任何一種與受體特異性結(jié)合的生物學或化學的化合物。特別有用的、被標記的特異性結(jié)合的物質(zhì)是釩溴過氧化物酶標記的蛋白質(zhì)或寡核苷酸。所述蛋白質(zhì)包括抗體和抗生物素蛋白。對于特定的特異性結(jié)合物質(zhì)的合適受體在本領(lǐng)域中是眾所周知的，因此這里不再介紹。本發(fā)明的測試藥盒中可以含有檢測方法中有用的其它成分(如表面活性劑)。
本發(fā)明的另一種藥盒只包括本發(fā)明的產(chǎn)生信號的組合物。
正如這里所采用的，“釩溴過氧化物酶”指的是任何一種釩鹵素過氧化物質(zhì)(酶催化的，或其它形式)，它能催化一種物質(zhì)(如魯米諾)的氧化作用，以產(chǎn)生合適的信號。可在本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)釩溴過氧化物酶的具體例子可在Butler et al.，Chem.Revs.，93，pp.1937-1944(1993)中找到，它們包括(但不限于)，由泡葉藻，仙菜，糖海帶，墨角對葉藻(Fucus distichus)，小珊瑚藻，珊瑚藻和巨藻等獲得的酶。這些釩溴過氧化物酶原料中，特別優(yōu)選泡葉藻。
在非蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶化合物中，Butler等人的上述文獻、de Boer，F(xiàn)EBS，235pp.93-97(1988)和Rehder et al.，Inorganica Chom.Acta，136，L7-L10，1987(所有列入本文作為參考)中介紹的那些化合物可以用于本發(fā)明中。這包括(但不限于)VO(Salen)〔Salen＝氧代-N，N′-二(亞水楊基)乙二胺〕和VO(MeOX)2〔MeOX＝氧代二(2-甲基喹啉-8-olato〕，VO(HSP)(OEt)(HOEt)〔HSP＝N-(2-羥苯基亞水楊基二烯胺)〕。這些非蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶的化合物中，優(yōu)選VO(HSP)(OEt)(HOEt)。
本發(fā)明中釩溴過氧化物酶的用量，由于該反應中其它成分用量的不同，可以在很寬范圍內(nèi)變化。有效用量對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的，但最少用量通常在毫微微摩爾范圍內(nèi)。
該測試藥盒的另一種具體方案可以包括產(chǎn)生信號的組合物的各個體成分和任何一種附加的可選成分(這是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員容易理解的)。在本發(fā)明的某些方法中，對臨床分析使用“游離形式”(非共軛)的釩溴過氧化物酶。但在特異性結(jié)合的分析方法中，使用的釩溴過氧化物酶都是與特異性結(jié)合的配位體或其受體共軛的，或與一種特異性結(jié)合的分子(它可與該配位體或受體起反應)共軛的。
在這種檢測方法中，該配體和受體配合，因而由釩溴過氧化物酶所標記，以最終測定該配合的或未配合的物質(zhì)。采用各種已知技術(shù)可以制備出這種共軛化合物(例如，參見Yoshitake et al，Eur.J.Biochem，101，395，1979，and Kondo等人的U.S.Patent No5,106,732)。
各種特異性結(jié)合的檢測方式在本發(fā)明的實際應用中都是很有效的，這包括核酸氫化檢測法、免疫化學檢測法(如酶免疫檢測法和夾層檢測法)和其它本領(lǐng)域中熟知的方法。這類檢測方法通常例如在下述文獻中有所介紹in U.S.Patent No.4,598,044，U.S.Patent No.4,745,077 to Holian etal.，U.S.Patent No.5,077,198 to Shih et al.，U.S.Patent No.5,085,986 to Mauck et al.，Matthews et al.，Anal.Biochem.，169，pages 1-25(1988)，WO 88/01302(published Feb.25，1988)，U.S.Patent No.5,082,780 to Warren et al.and U.S.Patent No.5,387,510 to Wu.
如上文所述，本發(fā)明進一步提供一種應答釩溴過氧化物酶而產(chǎn)生可檢測信號的方法，它包括(i)在下列物質(zhì)存在下，使釩溴過氧化物酶起反應(a)含有2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物的產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑；(b)鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和(c)過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑；從而產(chǎn)生可檢測的化學發(fā)光信號；和(ii)測定所產(chǎn)生的化學發(fā)光信號，以作為該釩溴過氧化物酶的一種度量。
本發(fā)明的方法可預先進行擴增過程，例如Mullis等人在美國專利No.4,965,188中的所述聚合酶鏈反應，以及總的由Weiss在“科學雜志”(Science)，251，第1292-3(1990)中所述連接酶鏈反應，以提高靶核酸之量，然后可使用本發(fā)明產(chǎn)生信號的組合物來進行檢測。
因此，本發(fā)明的方法可用于檢測很廣范圍內(nèi)各種化學和生物學物質(zhì)，例如氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)(包括酶、抗生物素蛋白、抗體和抗原蛋白)、碳水化合物(包括單糖、多糖和脂多糖)、激素(例如人絨毛膜促性腺激素、甲狀腺刺激激素、黃體化激素、甲狀腺素、卵泡刺激激素、甲狀旁腺激素、和生長激素)、代謝產(chǎn)物(例如葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸鹽)、寡核苷酸、核酸、維生素(例如B12和生物素)、來自各種生物體(包括微生物)的完整細胞，以及藥物(麻醉藥、治療藥和濫用藥物)。
特別有用的本發(fā)明特異性結(jié)合法，是本領(lǐng)域已知的夾層測試法，其中所研究的配體至少與第一和第二受體配合，反應同時進行，或者按所希望的順序進行。受體之一在適當載體上(例如微滴平板；高聚物、磁或玻璃顆粒；薄膜；膜；濾紙和本領(lǐng)域已知的其它物質(zhì))由吸附，共價鍵或其它已知連接方式連接而不溶解，或者能通過進一步配合或反應而使之不溶解。例如受體可以以特異性結(jié)合部分(例如生物素)標記，而所述特異性結(jié)合部分是能與連于載體上不溶解的相應受體部分(例如抗生物素蛋白)反應的。
所述夾層測試法中，所研究配體的第二受體可以用釩溴過氧化物酶標記，或者能夠通過附加特異性結(jié)合反應來進行這樣的標記(例如通過抗生物素蛋白-生物素配合物)。使用上述產(chǎn)生信號的組合物來完成該標記物的檢測。更優(yōu)選的實施方案中，所研究的配體是抗體能與之反應的抗原物質(zhì)，或者是互補核酸(例如寡核苷酸)能與之雜交的核酸。
下面的實施例詳細說明本發(fā)明之范圍，因為這些實施例僅為舉例說明而給出，因此概括于本文中的本發(fā)明不應只限于此。
除有具體說明外，所有的試劑和裝置從伊斯曼柯達公司或其它商售途徑獲得。
實施例1制備含水化學發(fā)光組合物
提供化學發(fā)光信號的含水組合物制備如下
配制在0.05M Tris-HCl緩沖液中含10μM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和0.01M NaBr的緩沖溶液(pH8.0)。
從兩份混合物配制產(chǎn)生信號的組合物。第一份含1.0mM魯米諾鈉而第二份含1.0mM H2O2，二者均在上述緩沖液中配制。臨使用前將該兩份再合并。然后加入已知濃度范圍約5至約50000×10-18摩爾的釩溴過氧化物酶。
釩溴過氧化物酶(貯液，貯存于4℃)用0.05M Tris-HCl，pH值8.0，0.01％牛血清白蛋白(BSA)進行系列稀釋。將這些酶溶液用移液管移至含上述產(chǎn)生信號組合物的不透明微滴平板中。
使用DYNATECH(商標)ML3000光度計，在37℃下測量該組合物的化學發(fā)光信號。
圖1表示上述條件下釩溴過氧化物酶的化學發(fā)光輸出信號(t＝5.0分時的1.0秒積分)，以及使用美國專利No.5,372,931實施例1的含水化學發(fā)光組合物，辣根過氧化物酶(HRP)的輸出信號。該圖表明，在無需加入美國專利5,372,931需要加入的增強劑或電子轉(zhuǎn)移劑的情況下，本發(fā)明產(chǎn)生信號組合物所產(chǎn)生的信號，與所述美國專利公開的組合物所產(chǎn)生的信號基本相同。
圖2表示使用本發(fā)明產(chǎn)生信號的組合物與使用上述美國專利的組合物相比較的應答信噪比，并表明本發(fā)明組合物還有大大降低本底值的優(yōu)點。表1中的數(shù)據(jù)(在pH7.5和pH8.0的上述緩沖液中)表示使用本發(fā)明組合物，相對化學發(fā)光信號的產(chǎn)生與信噪比的比較。釩溴過氧化物酶與用4-碘代酚(AMERLITE商標系統(tǒng))或3′-氯-4′-羥基-N-乙酰苯胺強化系統(tǒng)的辣根過氧化物酶(HRP)相比較。列于表1中的結(jié)果顯示，使用本發(fā)明的釩溴過氧化物酶系統(tǒng)能檢測的酶濃度，比先有技術(shù)公開的HRP強化系統(tǒng)能檢測之濃度要低10倍。
實施例2制備含水化學發(fā)光組合物
產(chǎn)生化學發(fā)光信號的含水組合物配制如下
在0.05M MES緩沖液中配制含10μM二亞乙基三胺五乙酸和0.05M NaBr的緩沖溶液(pH7.0)。
從兩份混合物配制產(chǎn)生信號的組合物。第一份含1.0mM魯米諾鈉和300μM 3′-氯-4′-羥基-N-乙酰苯胺，或者4-碘代酚增強劑，第二份含1.0mM H2O2，兩份均在上述緩沖液中配制。臨使用前將該兩份合并，然后加入已知濃度范圍為約5至約50,000×10-18摩爾的釩溴過氧化物酶。
將該釩溴過氧化物酶(貯液，貯存溫度4℃)用0.05M Tris-HCl，pH8.0，0.01％牛血清白蛋白(BSA)進行系列稀釋。將這些酶溶液用移液管移至含上述產(chǎn)生信號組合物的不透明微滴平板中。對于對照物來說，第一份不含增強劑。
使用DYNATECH(商標)ML3000光度計，在37℃測量該組合物的化學發(fā)光信號，t＝5.0分時采用1.0秒積分。
表2表示本發(fā)明的釩溴過氧化物酶系統(tǒng)確實不受HRP系統(tǒng)所用增強劑的影響。
本發(fā)明強于上述美國專利′931的HRP系統(tǒng)的另一優(yōu)點，如圖3和圖4所示，即不同濃度的釩溴過氧化物酶中，該系統(tǒng)的動力學特征在很長時間內(nèi)均基本上保持恒定不變。這由圖4可清楚看出，使用先有技術(shù)的HRP系統(tǒng)的信號急劇并立即變?nèi)酰褂帽景l(fā)明組合物所產(chǎn)生的信號則適度地保持恒定。
表1
加入對碘代酚或3′-氯-4′HA強化HRP產(chǎn)生的化學發(fā)光
輸出信號與未強化的釩溴過氧化物酶的比較
a.對HRP的Amerlite增強劑系統(tǒng)(PIP)b.對HRP的增強劑系統(tǒng)(3′-氯-4′HA)；美國專利5,372,931實施例1。c.釩溴過氧化物酶pH 8.0，Tris-HCl 0.05M，500μM魯米諾，500μM H2O2，0.01M NaBr， 10μM DTPA，最終濃度。d.釩溴過氧化物酶pH7.5 Tris-HCl 0.05M，500μM魯米諾，500μM H2O2，0.01M NaBr，10μM DTPA，最終濃度。
表2
未強化的釩溴過氧化物酶的化學發(fā)光與加入對碘代
酚或3′-Cl-4′HA后相比較
a.MES緩沖液(0.05M) pH＝7.0；VBrPO；p-時碘代酚 150μM；NaBr 0.1M；0.5mM H2O2；魯米諾，0.5mMb.MES緩沖液(0.05M) pH＝7.0；VBrPO；3′Cl-4′HA 150μM；NaBr 0.1M；0.5mM H2O2；魯米諾，0.5mMc.MES緩沖液(0.05M) pH＝7.0；VBrPO；NaBr 0.1M；0.5mM H2O2；魯米諾，0.5mMd.Tris-OH緩沖液(0.05M) pH＝7.5；VBrPO；NaBr 0.1M；0.5mM H2O2；魯米諾，0.5mM
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的分析組合物，其pH從約6.5到約10，包含
(a)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑，該試劑能應答釩溴過氧化物酶的催化活性而產(chǎn)生信號，所說產(chǎn)生信號的試劑含有2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；
(b)一種鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和
(c)一種過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。
2.權(quán)利要求1所述的分析組合物，其中所說提供鹵素的原料是金屬或非金屬鹽。
3.權(quán)利要求2所述的分析組合物，其中所說提供鹵素的原料是任何一種非金屬鹽。
4.權(quán)利要求3所述的分析組合物，其中所說提供鹵素的原料是溴化銨。
5.權(quán)利要求2所述的分析組合物，其中所說提供鹵素的原料是NaBr。
6.權(quán)利要求1所述的分析組合物，其中所說提供假鹵素的原料是含有CN、SCN-、OCN-、疊氮化物或異腈作為其配位體之一的金屬化合物。
7.權(quán)利要求1所述的分析組合物，其中所說的產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物是過硼酸鹽、過乙酸鹽、過氧化脲、過酸、過硫酸氫鉀制劑、氫過氧化物或過苯甲酸。
8.權(quán)利要求1所述的分析組合物，該組合物還含有一種含水混合物。
9.權(quán)利要求1所述的分析組合物，該組合物還含有一種有機溶劑。
10.權(quán)利要求9所述的分析組合物，其中有機溶劑是甲醇、乙醇、異丙醇、四氫呋喃、乙腈、己烷、己烷異構(gòu)體或它們的混合物。
11.權(quán)利要求1所述的分析組合物，該組合物還含有含水有機溶劑混合物。
12.權(quán)利要求1所述的分析組合物，其中所說的2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物是魯米諾、異魯米諾、N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾半琥珀酰亞胺、N-(6-氨基-己基)-N-乙基異魯米諾、N-乙基異魯諾或7-二甲氨基萘-1，2-二羧酸酰肼。
13.權(quán)利要求12所述的分析組合物，其中2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物是魯米諾。
14.權(quán)利要求1所述的分析組合物，該組合物還含有一種釩溴過氧化物酶或釩溴過氧化物酶標記的特異性結(jié)合的分子。
15.權(quán)利要求14所述的分析組合物，其中所說釩溴過氧化物酶是蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的。
16.權(quán)利要求15所述的分析組合物，其中所說蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是從下列物質(zhì)中獲得的泡葉藻，仙菜，糖海帶，墨角對葉藻(Fucusdistichus)，小珊瑚藻，珊瑚藻或巨藻。
17.權(quán)利要求16所述的分析組合物，其中所說蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是從泡葉藻中獲得的。
18.權(quán)利要求15所述的分析組合物，其中所說非蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是VO(Salen)、VO(MeOX)2或VO(HSP)(OEt)(HOEt)。
19.權(quán)利要求18所述的分析組合物，其中所說非蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是VO(HSP)(OEt)(HOEt)。
20.一種診斷用的測試藥盒，用于根據(jù)釩溴過氧化物酶的催化活性來測定分析物，所說測試藥盒包括
(i)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的分析組合物，其pH從約6.5到約10，含有
(a)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑，它能應答釩溴過氧化物酶的催化活性產(chǎn)生信號，所說產(chǎn)生信號的試劑含有一種2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；
(b)一種鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和
(c)一種過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。
21.權(quán)利要求20所述的診斷用測試藥盒，該藥盒還含有(ii)一種釩溴過氧化物酶或用釩溴過氧化物酶標記的特異性結(jié)合物種。
22.權(quán)利要求21所述的診斷用測試藥盒，其中所說釩溴過氧化物酶是蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的。
23.權(quán)利要求22所述的診斷用測試藥盒，其中，蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是從下列物質(zhì)中獲得的泡葉藻、仙菜、糖海帶、墨角對葉藻、小珊瑚藻、珊瑚藻或巨藻。
24.權(quán)利要求23所述的診斷用測試藥盒，其中，所說蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是從泡葉藻中獲得的。
25.權(quán)利要求22所述的診斷用測試藥盒，其中，所說非蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是VO(Salen)、VO(MeOX)2或VO(HSP)(OEt)(HOEt)。
26.權(quán)利要求25所述的診斷用測試藥盒，其中，所說非蛋白質(zhì)的釩溴過氧化物酶是VO(HSP)(OEt)(HOEt)。
27.一種能應答釩溴過氧化物酶而產(chǎn)生可檢測信號的方法，它包括
(i)在下列物質(zhì)存在下，使一種釩溴過氧化物酶起反應
(a)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑，該試劑含有一種2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物。
(b)一種鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和
(c)一種過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑；以產(chǎn)生一種可檢測的化學發(fā)光信號；和
(ii)測定所產(chǎn)生的化學發(fā)光信號作為該釩溴過氧化物酶的一種度量。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中，所說釩溴過氧化物酶就是分析物，或者是為檢測除該釩溴過氧化物酶以外的非免疫學分析物的游離形式。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中，所說釩溴過氧化物酶作為釩溴過氧化物酶和特異性結(jié)合物種的共軛物之部分而被檢測出。
30.一種測定特異性結(jié)合配體的特異性結(jié)合檢測法中，包括使該特異性結(jié)合配體與一種特異性結(jié)合配偶起反應，以形成一種特異性結(jié)合的配合物，并檢測該配合物，其中，用過氧化物酶作標記以檢測該特異性結(jié)合的配合物，其中的改進包括，用釩溴過氧化物酶作為所說的標記，并用下列物質(zhì)接觸該釩溴過氧化物酶標記的特異性結(jié)合配合物
(a)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑，該試劑含有2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮的衍生物；
(b)一種鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和
(c)一種過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物；以產(chǎn)生一種可檢測的化學發(fā)光信號。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中，所說特異性結(jié)合的配體或特異性結(jié)合的配偶是不溶解的或難于溶解的。
32. 權(quán)利要求30所述的方法，其中，附加使用能與所說特異性結(jié)合配體特異性結(jié)合的第二種特異性結(jié)合的配偶，以形成特異性結(jié)合配體的夾層結(jié)構(gòu)，其中，所說特異性結(jié)合的配偶，或所說第二種特異性結(jié)合的配偶是不溶解的或難于溶解的。
33. 權(quán)利要求32所述的方法，該方法用來測定作為所說特異性結(jié)合配體的抗原，其中，所說特異性結(jié)合的配偶和所說第二種特異性結(jié)合的配偶是對所說抗原有特異性的抗體。
34. 權(quán)利要求30所述的方法，該方法用來測定核酸，其中，所說特異性結(jié)合的物種是能與所說核酸起反應的。
35.權(quán)利要求32所述的方法，該方法用來測定核酸，其中，所說特異性結(jié)合的配偶和第二種特異性結(jié)合的配偶是寡核苷酸，該寡核苷酸與所說核酸不同順序互補。
36. 權(quán)利要求30所述的方法，該方法還包括在該反應步驟之前將所說的核酸擴增。
37. 權(quán)利要求32所述的方法，其中，所說2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物是魯米諾、異魯米諾、N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾半琥珀酰亞胺、N-(6-氨己基)-N-乙基異魯米諾、N-乙基異魯米諾或7-二甲氨基萘-1，2-二羧酸酰肼。
38. 權(quán)利要求37所述的方法，其中所說2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物是魯米諾。
39. 權(quán)利要求30所述的方法，其中，所說產(chǎn)生化學發(fā)光信號的化合物的用量從約0.01到約10毫摩爾，所說鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料，其用量從約0.1到約100毫摩爾；所說過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物，其用量從約0.5到約10毫摩爾。
40.一種被緩沖到pH值約6.5到約10的含水組合物，它含有
(a)一種釩溴過氧化物酶或釩溴過氧化物酶標記的特異性結(jié)合的分子；
(b)一種產(chǎn)生化學發(fā)光信號的試劑，該試劑含有2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；
(c)一種鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和
(d)一種過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。
全文摘要
某些含水組合物,測試藥盒以及方法,可在分析物存在下,通過產(chǎn)生化學發(fā)光信號,用于檢測過氧化氫或釩溴過氧化物酶。使用含有2,3－二氫－2,3－二氮雜萘－1,4－二酮衍生物的組合物;鹵素,假鹵素,提供鹵素和假鹵素的原料;過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物可以改善信號產(chǎn)生以及反應的動態(tài)特性。
文檔編號G01N33/58GK1200766SQ9619791
公開日1998年12月2日 申請日期1996年8月16日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月1日
發(fā)明者A·E·弗里德曼, S·F·格勞克斯, A·布特勒爾 申請人:奧索臨床診斷有限公司