專利名稱：檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)動(dòng)物疾病的試紙條，尤其涉及一種快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜 合癥抗體的試紙條，本發(fā)明還涉及該試紙條的制備方法和應(yīng)用方法，屬于動(dòng)物疾病檢 驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS )是 20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)的一種新病，其癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、 木乃伊胎及仔豬感染后的成活率下降，成年豬的呼吸道癥狀，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致免疫抑制 而繼發(fā)多種其它疾病。目前，該病在全世界幾乎所有養(yǎng)豬地區(qū)都有流行，給世界養(yǎng)豬 業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了國(guó)內(nèi)的廣泛關(guān)注。2006年夏季我國(guó)南方諸省爆發(fā) 豬無名高熱病，損失嚴(yán)重，疫情持續(xù)反彈，其中PRRS是最主要病原之一。目前PRRS 老疫區(qū)并未消滅，新疫區(qū)又不斷發(fā)生，且由于繼發(fā)病的增多，使豬場(chǎng)防疫無所適從， 防疫形勢(shì)十分嚴(yán)峻。目前，7>知的豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)的診斷方法有間接ELISA、免疫熒 光檢測(cè)法(IFA )。 (l)間接ELISA主要用于檢測(cè)血清中的抗體成分。該方法是將特異性 抗原包被在固相載體的表面，形成固相抗原，加入待檢樣品，使其中的相應(yīng)抗體結(jié)合 到固相載體的抗原上，再加入酶標(biāo)記的抗抗體，形成抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物， 最后加入底物溶液顯色。固相載體上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色測(cè)知樣品 中抗體的含量。但是，ELISA法要求抗原純度高、特異性好，否則會(huì)出現(xiàn)非特異性反 應(yīng)，操作程序較復(fù)雜，需反復(fù)洗滌，若洗滌次數(shù)不夠或過多易造成假陽性或假陰性， 并易造成操作者受害或環(huán)境污染，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，需兩個(gè)小時(shí)以上得出檢測(cè)結(jié)果。該 法必須具備酶標(biāo)儀和洗板機(jī)，這在基層實(shí)驗(yàn)室和小型門診較難達(dá)到，且試驗(yàn)受溫度等 條件限制，給檢測(cè)帶來不便。(2)熒光免疫檢測(cè)法(IFA)根據(jù)抗原抗體特異性免疫反 應(yīng)原理設(shè)計(jì)，把感染病毒的細(xì)胞固定在玻片上，將待檢測(cè)血清滴于上面，帶有病毒的 血清中含有相應(yīng)抗體，結(jié)合與玻片上，加入焚光試劑，即可顯示出焚光。在熒光免疫顯微鏡下可直接觀察檢測(cè)結(jié)果。IFA法靈敏度高，但必須具備熒光免疫顯微鏡和暗室 條件，為獲得良好熒光觀察效果必須配置合適的濾光片，實(shí)驗(yàn)時(shí)間需兩小時(shí)，結(jié)果檢 測(cè)于免疫顯微鏡下進(jìn)行，必須由有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員判定檢測(cè)結(jié)果。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種能夠快速檢測(cè) 豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條，該試紙條不需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，方法 簡(jiǎn)便易學(xué)，不用任何儀器進(jìn)行輔助檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果特異性高，重復(fù)性好。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種豬繁殖與呼吸綜合癥抗體快速檢測(cè)試紙條，包括樣品墊、玻璃纖維膜、硝 酸纖維素膜(NCM)、吸水墊和支持物；所述的硝酸纖維素膜含有一條由豬繁殖與 呼吸綜合癥病毒M蛋白包被而成的檢測(cè)線和由兔抗PRRSV抗體包被而成的對(duì)照線； 所述的玻璃纖維膜結(jié)合由膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白；玻璃纖維 膜、硝酸纖維膜和吸水墊按照以下次序相連接并附著在支持物上玻璃纖維膜與靠 近硝酸纖維膜檢測(cè)線的一端相連接，吸水墊與靠近硝酸纖維膜對(duì)照線的一端相連接； 樣品墊附著在玻璃纖維膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相銜接。其中，所述的支持物只要是具有一定的硬度，可以將樣品墊、玻璃纖維膜、硝 酸纖維素膜和吸水墊負(fù)載于其上以達(dá)到支持和負(fù)載的目的，均可作為本發(fā)明的支持 物；可以選用各種材料作為本發(fā)明的支持物，例如塑料板(優(yōu)選為PVC)、硬紙板、 鋁板等。所述的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白可按 照常規(guī)的基因工程方法進(jìn)行制備或表達(dá)，這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所能掌握或 通曉的。所述的兔抗PRRSV抗體可參考以下方法制備得到用豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒 疫苗采用多點(diǎn)注射法免疫陰性家兔3只，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共進(jìn)行3次，最后一 次免疫10天后采血，分離血清，純化后得兔抗PRRSVIgG。所述硝酸纖維素膜(該硝酸纖維素膜也可由尼龍膜來替換)上的;f全測(cè)線和對(duì)照 線之間的間隔優(yōu)選為3-5mm,更優(yōu)選為4mm。一種制備本發(fā)明檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條的方法，包括(1 )用噴膜機(jī)將膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白復(fù)合物噴涂在玻 璃纖維膜上，備用；(2 )將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和兔抗PRRSV IgG依次間隔3-5mm噴在 硝酸纖維膜上，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其余蛋白結(jié)合位點(diǎn)，洗滌，干燥，備用；(3) 將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘貼在支持板 上將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜 上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在竭酸纖 維素膜的另一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；(4) 將粘好的支持板材料切成60mm長(zhǎng)、4mm寬的試紙條，即得。 本發(fā)明試紙條的應(yīng)用方法1、 操作方法在檢測(cè)前先將樣本和試紙條放在室溫條件下放置一段時(shí)間(10 分鐘)，使其恢復(fù)至室溫；從鋁箔袋中取出檢測(cè)試紙條；在橢圓形加樣孔內(nèi)加入3—5 滴(100_200/il )待4企豬血液或血清樣品；將試紙條平放在桌面上，在室溫下靜置 20分鐘判定結(jié)果；2、 結(jié)果判斷無效對(duì)照線和斗全測(cè)線都不出現(xiàn)色線；陰性對(duì)照線出現(xiàn)一條色線，檢測(cè)線不出現(xiàn)色線；弱陽性在對(duì)照線出現(xiàn)一條顏色較深的紫紅色線，而在檢測(cè)線出現(xiàn)一條顏色 很淺的紫紅色線；陽性在對(duì)照線和檢測(cè)線各出現(xiàn)一條顏色較深的紫紅色線，樣品中的抗體表 達(dá)水平越高，檢測(cè)線(T)色線顏色越深。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)表達(dá)PRRSV核蛋白(N蛋白)和M蛋白，采用酶聯(lián) 免疫原理和膜層析技術(shù)制成快速檢測(cè)豬血液或血清中的抗體的試紙條。與ELISA和 IFA相比，本發(fā)明試紙條具有以下明顯的優(yōu)勢(shì)安全性好，無需培養(yǎng)病毒本身，避 免了因操作病毒造成的病毒擴(kuò)散；可以大批量制備，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉；抗 原成分穩(wěn)定均一，操作簡(jiǎn)便省力，不用儀器，檢測(cè)結(jié)果特異性高，重復(fù)性好。整個(gè) 實(shí)驗(yàn)僅需15分鐘。操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、直觀、結(jié)果容易判定。本發(fā)明結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)，可快速檢測(cè)樣本中可能存在的豬 繁殖與呼吸綜合癥抗體，達(dá)到快速檢測(cè)、及時(shí)控制疫情的目的，為下一步的分離鑒 定創(chuàng)造了有利條件，節(jié)省了大量的人力物力。檢測(cè)方法方便、快速、簡(jiǎn)便，不需特 殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨；操作簡(jiǎn)單、易于推廣、適合基層以及突發(fā)事件的大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合流行病調(diào)查，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒感染診 斷起到輔助作用。


圖1 本發(fā)明試紙條的正面示意圖；圖2 本發(fā)明試紙條的側(cè)面示意圖；圖3檢測(cè)結(jié)果示意圖從左至右依次為檢測(cè)線和對(duì)照線顯色為陽性；對(duì)照 線顯色為陰性；；險(xiǎn)測(cè)線和對(duì)照線兩條帶未顯色為無效。附圖標(biāo)記說明1:吸水墊；2:硝酸纖維膜(6:包被基因工程表達(dá)PRRSV M 蛋白；7:包被兔抗PRRSV IgG) ; 3:含有膠體金標(biāo)記抗原的玻璃纖維膜；4:樣 品墊；5:反應(yīng)支持物。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述 而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方 案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1 本發(fā)明檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥抗體試紙條的制備 1基因工程表達(dá)PRRSVN蛋白的制備① 材料來源(1)毒林、菌種PRRSV美洲抹ATCC-VR2332 、表達(dá)載體、受體菌BL21 均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所流行病學(xué)與診斷中心保存；(2)限制性內(nèi) 切酶EcoRI, Xhol, Taq酶，pET30 ( a) 、 T4DNA連"l妻酶購(gòu)于大連寶生物/^司；(3 ) IPTG、卡那霉素購(gòu)于上海生工，ProBord純化試劑、Trizol試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司。② N蛋白的制備(1)表達(dá)載體的構(gòu)建可參考周艷君等的所公開的方法進(jìn)行(周艷君，童光志， 薛強(qiáng)等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-la株核蛋白基因在原核系統(tǒng)中的高效表達(dá)與 初步應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)4艮.2002, 6:401-404.)，也可按照以下方法構(gòu)建將PRRSV病毒培養(yǎng)液經(jīng)差速離心、超速離心后，收獲的病毒粒子用Trizol試劑盒提耳又病毒核酸，應(yīng)用特異性引物(上游5'GTGGGAATTCTTGTCAAATATGCC AAATAA3，,下游5'ATTCTAACCTC GAGGATCC CAAA GAATA CC3，)經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增N蛋白基因，用EcoRI、 XhoI酶切所獲得N蛋白基因和原核表達(dá)載體pET30 (a), 分別回收0.4kb、 5.3kb的目的片段，用T4DNA連接酶于低溫下連接，以BL21 菌種制備的感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。(2) N蛋白基因的誘導(dǎo)表達(dá)活化陽性菌種，于37。C搖床中以200轉(zhuǎn)/分劇烈振搖，至菌液的OD值約為0.5時(shí)， 加人誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼續(xù)振搖3—4小時(shí)，收獲細(xì)菌。將菌體用 200mmol/L Tris-Cl (pH=7.5 )洗2次，然后用PBS懸浮細(xì)菌至終濃度lmg/ml。(3) PRRSV N蛋白的純化將超聲裂解后的菌體以10000r/min離心，經(jīng)0.22)tmi微孔濾膜過濾后，加入lmL 鎳親合層析基質(zhì)，裝柱，4。C作用30min。依次用10 ~ 20倍柱床體積、含10mM咪唑 和20mM咪唑，500mMNaCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次；再用含IOO ~ 500 mM咪唑的 磷酸鹽緩沖液洗脫含His2tag的重組N蛋白，分管收集，洗脫流速控制在2 ~ 3ml/min。2基因工程表達(dá)PRRSVM蛋白的制備① 材料來源(l)毒林、菌種PRRSV美洲抹ATCC-VR2332、表達(dá)載體pET-32a、受體菌 BL21均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所流行病學(xué)與診斷中心保存；Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶及各種》務(wù)飾酶，Trizol試劑盒，購(gòu)于大連寶 生物公司；IPTG、氨卞青霉素上海生工；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)。(3)引物合成。P 上游(5'隱CCTGGATCCTACTCAGCCATAGAAACCT-3，)； P下游(5，陽CATAAGCT CGCTTGCCG TTGTTATTTG-3'),上、下游引物分別包含設(shè)計(jì)為SamHI、 /fzwJIII 酶切位點(diǎn)。② PRRSVM蛋白的制備 (1 )表達(dá)載體的構(gòu)建將PRRSV病毒培養(yǎng)液經(jīng)差速離心、超速離心后，收獲的病毒粒子用Trizol試劑 盒提耳又病毒核酸，應(yīng)用特異性引物(P上游5'-CCTGGATCCTACTCAGCCATAGA AACCT-3; P下游5，-CATAAGCTCGCTTGCCG TTGTTATTTG-3，)經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增 M蛋白基因，用SawHI、 ///"^III酶切所獲得M蛋白基因和原核表達(dá)載體pET-32a。分 別回收0.3kb、 5.9kb的目的片段，用T4 DNA連接酶于低溫下連接，以BL21菌種制 備的感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，小量提取質(zhì)粒。(2 ) PRRSV M蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含有重組質(zhì)粒的BL2!菌種在含氨卞抗生素的LB平板上劃線，37。C培養(yǎng)過夜， 挑取單個(gè)菌落，于含氨千抗生素的LB中37。C搖床培養(yǎng)至OD600為0.5-0.6時(shí)加入誘導(dǎo) 劑IPTG至終濃度0.6mM,繼續(xù)振搖培養(yǎng)4小時(shí)，收獲細(xì)菌。離心后將菌體用0.5M NaCl、 20mM Tris'Cl(pH二7.6)洗兩次，然后用PBS懸浮細(xì)胞。 (3 ) PRRSVM蛋白的純化將超聲裂解后的菌體以10000r/min離心，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾后，加入lmL 鎳親合層析基質(zhì)，裝柱，4。C作用30min。依次用10 ~ 20倍柱床體積、含10mM咪 唑和20mM咪唑，500mM NaCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次；再用含IOO ~ 500 mM咪唑 的磷酸鹽緩沖液洗脫含His2tag的重組M蛋白，分管收集，洗脫流速控制在2 3ml/min。3制備兔抗PRRSV高免血清用豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒疫苗(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn))采 用多點(diǎn)注射法免疫陰性家兔3只，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共進(jìn)行3次，最后一次免疫 IO天后采血，分離血清，純化后得兔抗PRRSVIgG。4膠體金顆粒制備將氯化金(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)配制成0.01%水溶液，取100ml煮 沸2 min后，邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉(1% ) 2 ml,煮沸至溶液顏色變成酒紅色后， 繼續(xù)煮沸至適宜濃度(OD535 =0. 9312),冷卻后加入雙蒸水恢復(fù)到原體積，置4。C 保存。5膠體金標(biāo)記N蛋白制備及純化將待標(biāo)記N蛋白倍比稀釋，分別取100/xl加入l ml月交體金中，10min后加入10% NaC1100jul， 4。C靜止lh。取膠體金顏色沒有發(fā)生改變的最高稀釋倍數(shù)為準(zhǔn)，在此基 礎(chǔ)上加30%為最佳標(biāo)記量。取一定量調(diào)配好的膠體金用0.2 mo1/L K2C03調(diào)至pH = 9.0,按最佳標(biāo)記量加入表達(dá)抗原N蛋白，室溫作用20min,加入Tris-HCl (pH8.0, 20mmol/L) 配制的BSA,使終濃度為1%, 4。C放置2h后使用。將金標(biāo)抗原3000r/ min離心30 min,取上清，60000 g離心60 min，沉淀用0.02 mo1/ L pH7.2含O.l % BSA 的PBS溶解，恢復(fù)到原體積。再超離l次，沉淀用少許上述PBS溶解，使OD535nn^ 1.5。 0.22]Lim濾膜過濾，4。C保存?zhèn)溆谩?、試紙條的組裝(1 )用噴膜機(jī)將膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白復(fù)合物噴涂在玻璃纖維膜上，備用；(2) 將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和兔抗PRRSVIgG依次間隔3-5mm噴在 硝酸纖維膜上，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其余蛋白結(jié) 合位點(diǎn)，洗滌，干燥，備用；(3) 將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘在支持板上 將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜^r測(cè)線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上； 樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在硝酸纖維素 膜的另一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；(4) 將粘好的支持板材料切成60mm長(zhǎng)、4mm寬的試紙條，即得。試驗(yàn)例1本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合癥抗體快速檢測(cè)試紙條的相關(guān)試驗(yàn) 1材料來源豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；高免血清的制備用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的弱毒疫苗，用多 點(diǎn)注射法免疫陰性健康豬4頭，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共進(jìn)行3次，最后l次免 疫10后天采血；分離血清。參考血清豬圓環(huán)病毒(PCV)陽性血清、豬流型性腹瀉病毒(PEDV)陽性 血清、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽性血清、豬輪狀病毒(PRoV)陽性血清、 豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清、豬細(xì)小病毒(PPV)陽性血清均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 院哈爾濱獸醫(yī)研究所流行病學(xué)與診斷中心保存。待檢血清采自黑龍江、天津、福建等全國(guó)各地36個(gè)豬場(chǎng)的1285頭份血清和 全血(其中460頭為假設(shè)健康豬被采豬全血)，雞血清、鴨血清、鵝血清、羊血清 各15份，共計(jì)825份血清和460份全血。并把上述血清、全血編號(hào)待檢；對(duì)照試劑盒ELISA和IF試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī) 研究所提供。一、本發(fā)明試紙條敏感性試驗(yàn)同一份PRRSV陽性高免血清，同時(shí)用本發(fā)明試紙條(實(shí)施例1所制備)和間 接ELISA試劑盒景象檢測(cè)，最低檢出量ELISA為1:2560-5120,本發(fā)明試紙條為 1:2560。壽1感性相似。用本發(fā)明試紙條、ELISA試劑盒和IF試劑盒，分別對(duì)上述 825份血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果基本一致，其中，825份豬血清中陽性739份，陰性147份。在作上述ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)時(shí)，825份豬血清中，滴度在l: 16以上的樣品666份， 在1: 16以下的樣品76份。用本發(fā)明試紙條對(duì)上述采豬場(chǎng)的460份血液進(jìn)行檢測(cè)， 并把檢測(cè)結(jié)果和對(duì)應(yīng)血清檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果基本完全相符。其最小檢出量為 ELISA 1:2560, IF 1:16。二、 本發(fā)明試紙條特異性試驗(yàn)用本發(fā)明試紙條對(duì)豬圓環(huán)病毒(PCV)陽性血清、豬流型性腹瀉病毒(PEDV) 陽性血清、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽性血清、豬輪狀病毒(PRoV)陽性血 清、豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清、豬細(xì)小病毒(PPV)陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，均 不出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)線，而用純化的PRRSV陽性高免血清和未純化的PRRSV陽性血清 則出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)線。三、 批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)(1 )批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)3份陰陽血清樣品在同一批次試紙條試驗(yàn)中每份樣品平 行設(shè)6個(gè)重復(fù)。(2)批間重復(fù)性試驗(yàn)在5個(gè)不同試驗(yàn)日重復(fù)測(cè)定6份樣品。 試驗(yàn)結(jié)果為批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為3.2-8.9%之間，批間重復(fù)變異系數(shù)為 4.1-9.3%之間。四、 符合率試-驗(yàn)用本發(fā)明試紙條對(duì)上述豬場(chǎng)的460 f分血液進(jìn)行4企測(cè)，并4巴4企測(cè)結(jié)果和對(duì)應(yīng)血清 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果基本完全相符。用本發(fā)明試紙條檢測(cè)與用ELISA、 IF兩種 方法4企測(cè)的符合率為99.60%和97.83%。五、 保存期試驗(yàn)2002年12月以來對(duì)保存的紙條試劑盒進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，試劑盒保存期 均在2年以上。建"^義試劑盒在-20。C保存，有效期為12-18個(gè)月。
權(quán)利要求
1、一種快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條，其特征在于包括樣品墊(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維素膜(2)、吸水墊(1)和支持物(5)；所述的硝酸纖維素膜含有一條由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白包被而成的檢測(cè)線(6)和由兔抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體包被而成的對(duì)照線(7)；所述的玻璃纖維膜結(jié)合有膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白；玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維膜(2)和吸水墊(1)按照以下次序相連接并附著在支持物(5)上玻璃纖維膜與靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線(6)的一端相連接，吸水墊與靠近硝酸纖維膜對(duì)照線(7)的一端相連接；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相銜接。
2、 按照權(quán)利要求l所述的試紙條，其特征在于所述的支持物(5)是具有一定 硬度的塑料板、硬紙板或鋁板。
3、 按照權(quán)利要求l所述的試紙條，其特征在于，所述的兔抗PRRSV抗體按照以 下方法制備得到用豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒疫苗采用多點(diǎn)注射法免疫陰性家兔3 只，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共進(jìn)行3次，最后一次免疫10天后采血，分離血清，純化 后，即得。
4、 按照權(quán)利要求l所述的試紙條，其特征在于所述的硝酸纖維素膜能夠由尼 龍膜代替。
5、 按照權(quán)利要求l所述的試紙條，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線 和對(duì)照線之間的間隔為3-5mm。
6、 按照權(quán)利要求5的試紙條，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和對(duì) 照線之間的間隔為4mm。
7、 一種制備權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條的方法， 包括(1 )用噴膜機(jī)將膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白復(fù)合物噴涂在玻璃 纖維膜上，備用；(2 )將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和兔抗PRRSV IgG依次間隔3-5mm噴在硝 酸纖維膜上，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線，將包被好的硝酸纖維膜的其余蛋白結(jié)合位 點(diǎn)封閉，洗滌，干燥，備用；(3)將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘貼在支持板上將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜 上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在硝酸纖 維素膜的另一端，邊l^附著在硝酸纖維素膜上；(4 )將粘好的支持板材料切成60mm長(zhǎng)、4mm寬的試紙條，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)抗體的試紙條及其制備方法。本發(fā)明試紙條由樣品墊(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維素膜(2)、吸水墊(1)和支持物(5)組成；其中，所述的硝酸纖維素膜含有一條由PRRSVM蛋白包被而成的檢測(cè)線(6)和由兔抗PRRSV抗體包被而成的對(duì)照線(7)；所述的玻璃纖維膜結(jié)合有膠體金標(biāo)記的PRRSV N蛋白。本發(fā)明試紙條可以大批量制備，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉。利用本發(fā)明試紙條檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥，無需培養(yǎng)病毒本身，安全性好。本發(fā)明試紙條靈敏度高、重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，直觀，結(jié)果容易判定。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101216488SQ20081000044
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者崔尚金 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所