專利名稱：測(cè)量細(xì)胞活性用的具有光電導(dǎo)層的二維傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二維傳感器及使用該種傳感器測(cè)量細(xì)胞活性用的測(cè)量系統(tǒng)。該種傳感器檢測(cè)細(xì)胞活性造成的電位變化。
人們正在廣泛地進(jìn)行對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的醫(yī)學(xué)研究及關(guān)于利用神經(jīng)細(xì)胞作為電器件的可能性的研究。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞被刺激時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生某種電位。首先，由于陰離子透明度的變化，細(xì)胞內(nèi)側(cè)與外側(cè)的陰離子密度發(fā)生變化，然后，細(xì)胞膜的電位發(fā)生變化。因此，測(cè)量細(xì)胞膜電位的二維分布，對(duì)于觀察樣品細(xì)胞或機(jī)體是有用的。測(cè)量電位的二維分布提供了一種確定活性部分及活性水平的方法。
本發(fā)明人研制出一種作為二維傳感器的集成組合電極，不必將玻璃探針或其他刺激探針插入細(xì)胞，即可同時(shí)在多個(gè)點(diǎn)上測(cè)量細(xì)胞的電位。這種集成組合電極包括許多排成矩陣的微電極，及其利用導(dǎo)電物質(zhì)在玻璃板上形成的引線圖案，在其上可對(duì)樣品細(xì)胞或機(jī)體進(jìn)行培養(yǎng)。這種集成組合電極使以比玻璃電極或其他普通手段更小的間距，對(duì)多個(gè)點(diǎn)上的電位變化的測(cè)量成為可能。另外，這種集成組合電極還使得對(duì)在該集成組合電極上培養(yǎng)的樣品細(xì)胞或機(jī)體進(jìn)行長(zhǎng)期觀察成為可能。
但是，這種集成組合電極不適合廣泛應(yīng)用，因?yàn)闇y(cè)量電極的尺寸和間距都是固定的。換句話說(shuō)，很難用一個(gè)集成組合電極測(cè)量不同的樣品。事實(shí)上，過(guò)去是通過(guò)調(diào)整電極的尺寸及間距，制造不同的集成組合電極，來(lái)適應(yīng)不同的樣品。
現(xiàn)介紹一種二維傳感器及使用該種傳感器的測(cè)量系統(tǒng)，它通過(guò)改進(jìn)上述集成組合電極，使電極尺寸和間距可變，從而適宜于廣泛地用來(lái)測(cè)量不同樣品的細(xì)胞活性。
按本發(fā)明的二維傳感器是一種板狀傳感器。該傳感器具有在光照射的光斑上電導(dǎo)率增大的光電導(dǎo)層、在光電導(dǎo)層正面上形成的絕緣層，以及在光電導(dǎo)層背面上形成的效應(yīng)電極。在絕緣層的表面上，附著一個(gè)用來(lái)支撐樣品細(xì)胞、培養(yǎng)基及參照電極的細(xì)胞支撐器。當(dāng)電位由于細(xì)胞活性而變化時(shí)，從效應(yīng)電極得到的信號(hào)基本上與光束所照射的光斑上電位的變化相對(duì)應(yīng)。
光電導(dǎo)層可以用硒、CdS、Ge-Si等一類半導(dǎo)體或本征半導(dǎo)體制成。作為另一方案，光電導(dǎo)層可以用光導(dǎo)電聚合物制成。諸如蒽的稠合多環(huán)芳烴、諸如咔唑的芳香雜環(huán)化合物，或者芳氨可用作聚合物側(cè)鏈或主鏈上包括的光電導(dǎo)功能團(tuán)。作為另一方案，可以采用蒸鍍的酞箐薄膜或用作紫蘇染料的Me-PTC(亞甲基-紫蘇基-羧酸)等一類有機(jī)薄膜。
利用本發(fā)明的二維傳感器及光電導(dǎo)層的照射光斑，即可檢測(cè)出與細(xì)胞的一部分的電位變化相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。這一部分與光電導(dǎo)層的上述光斑相接觸。因?yàn)楣怆妼?dǎo)層的電導(dǎo)只在激光束的照射光斑處增大，所以檢測(cè)出的信號(hào)基本上與和傳感器激光照射光斑接觸的細(xì)胞部分的電位變化相對(duì)應(yīng)。
所以，移動(dòng)激光束，即可改變相當(dāng)于測(cè)量電極的激光照射光斑的位置。通過(guò)對(duì)激光的聚焦，即可改變光斑的尺寸(亦即電極的尺寸)。因?yàn)榻^緣層存在于光電導(dǎo)層與細(xì)胞之間，所以細(xì)胞電位本身難以檢測(cè)。但是，電位的變化，亦即電位的交流分量或脈沖分量卻可以檢測(cè)。所以，通過(guò)改變電位，即可測(cè)量細(xì)胞的活性。
按本發(fā)明的測(cè)量系統(tǒng)包括上述二維傳感器、以激光束在二維傳感器背面上照射出光斑用的激光束光源、在二維傳感器背面上的效應(yīng)電極與二維傳感器正面細(xì)胞支撐器內(nèi)的參照電極之間提供直流偏置電壓用的直流電源，以及處理在該兩電極之間獲得的信號(hào)用的裝置。
最好利用激光束來(lái)照射傳感器的光斑，因?yàn)榧す馐軌蛉菀椎鼐劢乖谛〉墓獍呱稀?br> 測(cè)量系統(tǒng)最好包括維持傳感器上細(xì)胞支撐器內(nèi)樣品細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的裝置。該培養(yǎng)裝置使對(duì)樣品的長(zhǎng)期觀測(cè)成為可能。
該系統(tǒng)最好還包括使激光束光源發(fā)出的激光束在二維傳感器背面預(yù)定的面積上高速掃描的裝置。這樣，在多個(gè)光斑上的細(xì)胞活性基本上是同時(shí)測(cè)量的。可以不用一個(gè)激光束，而用包括排成矩陣的多個(gè)激光元件的激光矩陣。通過(guò)用分時(shí)的方法驅(qū)動(dòng)多個(gè)激光元件，可以進(jìn)行速度更快的掃描?？梢圆灰苿?dòng)激光束，而移動(dòng)二維傳感器，以改變傳感器的激光束照射光斑。在這種情況下，該系統(tǒng)可以包括X-Y平臺(tái)，控制二維傳感器的水平位置。


圖1是利用本發(fā)明二維傳感器的細(xì)胞活性測(cè)量系統(tǒng)的框圖。
圖2A和2B表示圖1測(cè)量系統(tǒng)用的二維傳感器的截面圖和平面視圖。
圖3表示與待檢測(cè)的細(xì)胞活性相對(duì)應(yīng)的瞬變電流的波形實(shí)例。
圖4是有關(guān)圖1測(cè)量系統(tǒng)的瞬變電流流過(guò)的電路的示意圖。
圖1表示本發(fā)明測(cè)量細(xì)胞活性用的測(cè)量系統(tǒng)的最佳實(shí)施例。樣品細(xì)胞2及其培養(yǎng)基放在二維傳感器1上。包括樣品2及培養(yǎng)基的二維傳感器1放置在恒溫箱3內(nèi)。
如圖2A及2B所示，二維傳感器包括作為光電導(dǎo)層的本征硅制襯底、在襯底背面(Si面)上形成的作為效應(yīng)電極的金銻薄膜1a、以及在襯底正面作為絕緣層形成的SiO2層。SiO2層上，附著一個(gè)柵欄，用來(lái)盛樣品細(xì)胞、培養(yǎng)基及參照電極。圖2A表示垂直方向上放大的截面圖。例如，傳感器襯底的總厚度是200微米。本征硅襯底兩面精細(xì)拋光。用蒸鍍法在背面形成的金銻薄膜1a，在500℃下變成合金，以便形成歐姆接觸。用來(lái)盛細(xì)胞和其他樣品的柵欄1b，呈圓柱形，用聚碳酸脂制成，其內(nèi)徑為例如，26毫米，粘在襯底的絕緣層上。為了便于處理，該二維傳感器上安裝鋁框。
在圖1中，恒溫箱部分3具有雙壁結(jié)構(gòu)，保證其內(nèi)部免受外部細(xì)菌的感染。溫度控制單元4根據(jù)溫度傳感器的輸出，控制加熱器和風(fēng)扇單元5，使得恒溫箱部分3的樣品室3a保持恒定溫度，例如，37±0.5℃。由95％空氣和5％CO2組成的混合氣體引入樣品室?；旌蠚怏w的管道上裝有流量計(jì)6和電磁閥7。該系統(tǒng)具有驅(qū)動(dòng)閥門(mén)用的驅(qū)動(dòng)電路7a以及控制驅(qū)動(dòng)電路7a的定時(shí)器7b。恒溫箱部分3、溫度控制單元4及其他部分構(gòu)成培養(yǎng)裝置。
該系統(tǒng)包括用于在傳感器柵欄內(nèi)的參照電極(RE)與傳感器背面上的效應(yīng)電極之間施加偏置電壓的穩(wěn)壓器8。上述兩電極之間的電流信號(hào)送入運(yùn)算放大器9，將信號(hào)放大，并把它送到作為處理裝置的計(jì)算機(jī)。計(jì)算機(jī)包括一個(gè)16位A/D轉(zhuǎn)換器。
在傳感器的柵欄內(nèi)有一個(gè)對(duì)應(yīng)電極(CE)；CE和參照電極(RE)都連接到穩(wěn)壓器8上。CE用來(lái)刺激傳感器的柵欄中的樣品，以測(cè)量樣品產(chǎn)生的感應(yīng)電位。為此目的，將脈沖電壓加在CE與RE之間。這個(gè)刺激電壓(脈沖電壓)是按照計(jì)算機(jī)10來(lái)的指令由穩(wěn)壓器8產(chǎn)生的。該系統(tǒng)還可以在不加任何刺激電壓的情況下，測(cè)量自產(chǎn)生的電位。
圖1說(shuō)明激光束光源11及其驅(qū)動(dòng)器12。激光束光源11用激光束照射出二維傳感器背面的光斑。由激光束光源11發(fā)射的激光束被包括反射鏡和透鏡(采用倒置的顯微鏡的目鏡)的光學(xué)系統(tǒng)聚焦。該光束可以聚焦成直徑只有微米數(shù)量級(jí)的光斑。
該系統(tǒng)還包括作為改變激光照射的光斑在傳感器背面上的位置的裝置X-Y平臺(tái)13，X-Y平臺(tái)13在水平方向移動(dòng)恒溫箱3內(nèi)所裝的二維傳感器。該X-Y平臺(tái)具有由計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)馬達(dá)，可以以1微米的步距改變X-Y平面上照射光斑的位置。
在上述實(shí)施例中，二維傳感器1的位置可以移動(dòng)，而激光束的位置卻是固定的。但是，最好不移動(dòng)二維傳感器1，而讓激光束進(jìn)行掃描?？梢栽诠鈱W(xué)系統(tǒng)中，采用X-Y檢流計(jì)式反射鏡來(lái)掃描激光束。一個(gè)替代的方案是，采用由許多布置成矩陣的激光元件的激光矩陣。采用這個(gè)辦法時(shí)，每個(gè)激光元件發(fā)射一個(gè)與傳感器背面垂直的激光束，而激光元件以分時(shí)的方法驅(qū)動(dòng)。
如上所述，二維傳感器1的激光照射光斑產(chǎn)生空穴與電子對(duì)。這樣參照電極與效應(yīng)電極之間的偏壓迫使光電流流動(dòng)。因?yàn)樵诙S傳感器的表面上形成有絕緣層(SiO2)，因此直流無(wú)法流動(dòng)，但脈沖電流卻可以流動(dòng)。因此，細(xì)胞活性自然產(chǎn)生的電位變化，可以作為脈沖電流檢測(cè)出來(lái)。另外，加在對(duì)應(yīng)電極(CE)和參照電極(RE)之間的刺激電壓誘生細(xì)胞的脈沖反應(yīng)。
下面將說(shuō)明一個(gè)試驗(yàn)的例子，其中用上述測(cè)量系統(tǒng)檢測(cè)老鼠大腦切割樣品神經(jīng)細(xì)胞的活性。取出兩天年齡的SD鼠的大腦；大腦可見(jiàn)區(qū)域的一部分切割成5毫米厚的樣品。將該樣品放在二維傳感器的柵欄內(nèi)培養(yǎng)。為了提高黏性，傳感器表面的絕緣層用聚賴氨酸處理，并且用DF＋f作為培養(yǎng)基?！銬F′是比例為1∶1的DMEM和Nutrient Mixture(F12培養(yǎng)基)的混合物；′f′是5微克/毫升的胰島素、100微克/毫升的轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮20毫微重量克分子濃度(nM)、氫化可的松20nM、腐胺100微重量克分子濃度(μM)、硒20nM和胎牛犢血清5％的混合物。
上述樣品從開(kāi)始培養(yǎng)后第7至10天便自己產(chǎn)生電位。圖3表示樣品的電活性，亦即用該測(cè)量系統(tǒng)檢測(cè)出的瞬變電流。在圖3中可以看到兩個(gè)瞬變電流。其中一個(gè)是約0.25秒的正脈沖電流，另一個(gè)是0.7秒的負(fù)脈沖電流。圖4表示瞬變電流所流過(guò)的該測(cè)量系統(tǒng)的簡(jiǎn)化電路。在該圖中，8a表示穩(wěn)壓器8加在參照電極(RE)與效應(yīng)電極(通過(guò)放大器9)之間的偏置電壓。下列假說(shuō)來(lái)自圖3及圖4。
在圖3中約0.25秒處，正電位自然是由該細(xì)胞活性造成的。相對(duì)于其中泡著參照電極的培養(yǎng)基的電位而言，該電位的極性是正。該電位引起圖4方向(a)的瞬變電流。此后，在當(dāng)瞬變電流沿圖4中方向(b)流動(dòng)時(shí)的大約0.7秒處，該正電位消失。
所以，可以認(rèn)為，細(xì)胞活性造成的細(xì)胞內(nèi)的正電位(細(xì)胞膜電位)大約持續(xù)0.45秒。當(dāng)激光照射光斑的位置變化時(shí)，在光斑上都檢測(cè)出類似的瞬變電流，估計(jì)光斑上的細(xì)胞電位是由于細(xì)胞活性而產(chǎn)生的。
如上所述，本發(fā)明的二維傳感器包括光電導(dǎo)層，效應(yīng)電極以及樣品可在其上的柵欄中培養(yǎng)的絕緣層。用激光束在傳感器背面照射光斑時(shí)，就能檢測(cè)出光斑處細(xì)胞活性造成的細(xì)胞電位的變化。所以，將激光束聚焦或使激光束發(fā)生相對(duì)于傳感器的移動(dòng)，即可輕易地改變分別與測(cè)量電極的尺寸及位置相當(dāng)?shù)募す馐獍叩某叽绾臀恢谩?br> 權(quán)利要求
1.一種測(cè)量細(xì)胞活性用的二維傳感器，其特征在于傳感器包括當(dāng)光照射時(shí)導(dǎo)電率增大的光電導(dǎo)層，在光電導(dǎo)層正面形成的絕緣層，在光電導(dǎo)層背面形成的效應(yīng)電極，以及安置在接近絕緣層的裝細(xì)胞、培養(yǎng)基和參照電極用的細(xì)胞支撐器，其中，當(dāng)光束照射在效應(yīng)電極上產(chǎn)生光斑時(shí)，從效應(yīng)電極獲得信號(hào)，該信號(hào)大體對(duì)應(yīng)于光束照射出的光斑處的電位變化。
2.權(quán)利要求1提出的二維傳感器，其特征在于所述光電導(dǎo)層包括半導(dǎo)體。
3.權(quán)利要求1提出的二維傳感器，其特征在于所述光電導(dǎo)層包括光導(dǎo)電聚合物。
4.一種測(cè)量細(xì)胞活性用的測(cè)量系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)包括二維傳感器，它包括光照射時(shí)電導(dǎo)率增大的光電導(dǎo)層、在該光電導(dǎo)層正面形成的絕緣層、安置在接近絕緣層的裝細(xì)胞、培養(yǎng)基和參照電極用的細(xì)胞支撐器，用激光束照射在效應(yīng)電極上產(chǎn)生光斑的激光束光源，直流電源，用來(lái)將直流偏壓加在光電導(dǎo)層背面上的效應(yīng)電極和光電導(dǎo)層正面上細(xì)胞支撐器內(nèi)的參照電極之間，以及處理在效應(yīng)電極與參照電極之間獲得的信號(hào)用的裝置。
5.權(quán)利要求4提出的測(cè)量系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)還包括維持在傳感器上細(xì)胞支撐器內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境用的裝置。
6.權(quán)利要求4提出的測(cè)量系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)還包括使從激光束光源射出的激光束在光電導(dǎo)層背面預(yù)定面積上進(jìn)行掃描用的裝置。
7.權(quán)利要求4提出的測(cè)量系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)還包括激光器矩陣，后者包括多個(gè)排成矩陣的激光元件，每個(gè)激光元件射出與光電導(dǎo)層背面垂直的激光束。
8.權(quán)利要求4提出的測(cè)量系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)還包括X-Y平臺(tái)，后者控制二維傳感器的水平位置，從而改變傳感器上激光照射光斑的位置。
全文摘要
二維傳感器包括光照射的光斑處電導(dǎo)率增大的光電導(dǎo)層、在光電導(dǎo)層正面形成的絕緣層、在光電導(dǎo)層背面形成的效應(yīng)電極以及附在絕緣層表面的裝細(xì)胞、培養(yǎng)基和參照電極的細(xì)胞支撐器。傳感器放恒溫箱內(nèi)，效應(yīng)電極與參照電極間加偏置電壓。當(dāng)激光束在傳感器背面照射出光斑時(shí)，從效應(yīng)電極獲得信號(hào)。該信號(hào)大體相當(dāng)于激光照射光斑處細(xì)胞活性造成的電位變化并用計(jì)算機(jī)處理。使激光束聚焦和移動(dòng)而易于改變相當(dāng)于測(cè)量電極大小和位置的光束光斑的大小和位置。
文檔編號(hào)G01N27/30GK1154475SQ9610820
公開(kāi)日1997年7月16日 申請(qǐng)日期1996年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月20日
發(fā)明者杉原宏和, 竹谷誠(chéng), 龜井明仁, 巖崎裕 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社