專利名稱：探測短暫受激發(fā)光的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用基于波導(dǎo)的平面介電光學(xué)傳感器平臺探測短暫受激發(fā)光的方法。還涉及所述方法在定性親和性測試(affinity sensing)中的應(yīng)用，以及用于選擇性定量測定光學(xué)混濁液中的發(fā)光成分。本發(fā)明還涉及適宜于實(shí)施該方法的傳感器平臺。
光在波導(dǎo)內(nèi)傳播時(shí)，光波不完全限于真正的波導(dǎo)事實(shí)上一部分光波在光學(xué)上相鄰接的薄介質(zhì)中傳播。該部分稱為短暫場，在傳感技術(shù)中它是光波導(dǎo)多色使用的基礎(chǔ)。
利用這種短暫場有可能在光學(xué)上薄介質(zhì)內(nèi)激勵(lì)發(fā)光。這種激勵(lì)限于波導(dǎo)的中間介面區(qū)域。所以，短暫的發(fā)光激勵(lì)特別有利于應(yīng)用在分析上。
一種平面?zhèn)鞲衅髯詈唵吻闆r下由三層體系組成基底層，波導(dǎo)層和上層，上層通常是由試樣構(gòu)成。尤其在薄波導(dǎo)情況下，其中波導(dǎo)層的厚度小于光波長度，能夠傳播的光場的可漫射模的數(shù)目限于幾個(gè)離散的波導(dǎo)模。
在厚波導(dǎo)時(shí)，可以傳導(dǎo)許多模。在這種情況下，常?？梢月匀セ祝鐚τ诤穸仍?/10毫米或更大一些范圍的波導(dǎo)。
根據(jù)可預(yù)以探測的輻射部分的選擇，已有技術(shù)中探測短暫受激發(fā)光的方法是不相同的·探測“體積發(fā)光”一部分由導(dǎo)波激勵(lì)的發(fā)光入射到全空間角內(nèi)；這一部分發(fā)光可采用光學(xué)方法預(yù)以記錄，并饋送到探測系統(tǒng)內(nèi)。
·探測“短暫發(fā)光”對射入空間的發(fā)光的補(bǔ)充，這種短暫發(fā)光作為導(dǎo)波反向耦合到波導(dǎo)內(nèi)，傳輸并經(jīng)由波導(dǎo)的端面耦合出來。
已知許多探測用發(fā)光染料標(biāo)記的抗體或抗原的短暫受激發(fā)光的方法和裝置，它們已在US-A-4582809中有過介紹。所要求保護(hù)的裝置使用一種光纖，并對短暫激勵(lì)發(fā)光進(jìn)行端面耦合。這種光纖典型的最大直徑為1毫米，在將激光耦合其內(nèi)時(shí)可以傳導(dǎo)許多模。可以用簡單的方式僅通過反向?qū)牍饫w的部分光來測量短暫的受激發(fā)光。這種裝置的尺寸非常大，并且還要求相當(dāng)大的試樣體積，他們都是缺點(diǎn)。實(shí)際上，裝置其尺寸不可能減小，或者甚至小型化成為集成光學(xué)傳感器。靈敏度的增加通常相隨著裝置尺寸的增強(qiáng)。
另一個(gè)缺點(diǎn)是由端面輸出耦合限制的靈敏度在激勵(lì)和熒光發(fā)射共線進(jìn)行時(shí)，需用分束器和濾光器將他們分開(例如用截止濾光器或帶通濾波器)，而濾光器的鑒別特性限制了探測靈敏度。
由D.Christensen，D.Deyer，D.Fowers，J.Herron在“Analysis ofExcitation and Collection Geometries for Planar WaveguideImmunosensors”，SPIE 1886，2(1993)(在醫(yī)學(xué)診斷中的纖維光學(xué)傳感器)一文中對原平面多模波導(dǎo)的使用作出描述。文中，激勵(lì)輻射經(jīng)過端面耦合到波導(dǎo)內(nèi)，對進(jìn)入空間角內(nèi)的發(fā)光進(jìn)行探測。另外，也可以使用端面輸出耦合。在后者情形下，類似于上述裝置介紹中提到的由必須的分束器和濾光器所引起的對靈敏度的限制是一個(gè)缺點(diǎn)。還有的缺點(diǎn)是大的傳感器尺寸和相應(yīng)的大的試樣體積。
在WO 90/06503中，公開一種用薄的平面的最好是單模的波導(dǎo)通過全內(nèi)反射發(fā)光(TIRF)來激勵(lì)發(fā)光的方法。在該方法中，利用波導(dǎo)來增加傳感器表面處的光場強(qiáng)度，激勵(lì)射束從下側(cè)進(jìn)入，并在傳感器全反射。探測射入空間角內(nèi)的體積發(fā)光。在此方法中，受激光與具有發(fā)光特性的分子之間的相互作用區(qū)受限于傳感器，因?yàn)閮H在光束直徑區(qū)域發(fā)生激勵(lì)，所以，僅由光束直徑來有限地決定傳感器的大小，即受到直徑的限制和由于非常窄的有限共振角引起的發(fā)散的限制。
已有技術(shù)使用一個(gè)或一個(gè)以上耦合光柵，用于對導(dǎo)波的輸入-或輸出耦合，這種使用已由K.Tiefenthaler和W.Lnkosz在“Sensitivity ofgrating couplers as integrated-optical chemical sensor”，J.Opt，Am.B6，209(1989)，以及由W.LuKosz，Ph.M.Nellen，Ch，Stamm and P.Weiss在“Output Grating Couplers on planar Waveguides as IntegratedOptical ChemicalSensors”，Sensors and Actuators B1,585(1990)，以及由T.Tamir and S.T.Peng，在“Analysis and Design of GratingCouplers”，Appl.phys.14,235-254(1977)的文中作出介紹。Tiefenthaler等人描述的方法通過采用直接探測方法(通過折射率的改變)對于親和性檢測是很有用的。測定由于折射率改變所引起的耦合角共振的位移，這種位移是由分子的吸附或鍵合所支配的。
已經(jīng)有過各種設(shè)想來增加短暫受激發(fā)光的靈敏度，以及制取集成的光學(xué)傳感器。例如，Biosensors and Bioelectronis 6(1991)，595-607中報(bào)導(dǎo)過平面單模或低模波導(dǎo)，它是在二步離子交換方法中制造的，其中，采用棱鏡來實(shí)現(xiàn)使光耦合成為激勵(lì)波。所使用的親合系統(tǒng)是人類免疫球蛋白G/熒光素標(biāo)記的蛋白質(zhì)A，抗體固定在波導(dǎo)上，欲探測的在磷酸鹽緩沖液中的熒光素標(biāo)記的蛋白質(zhì)A加到聚乙烯醇薄膜中，波導(dǎo)測量區(qū)涂覆了該薄膜。該方法的主要缺點(diǎn)是，波導(dǎo)層和基底層之間只有很小的折射率差可以獲取，從而導(dǎo)致相當(dāng)?shù)偷撵`敏度。
在熒光素異硫氰酸酯鍵合到蛋白質(zhì)A中時(shí)靈敏度是20nm。這時(shí)探測微量物仍舊是不滿足需要的，必需進(jìn)一步增加靈敏度。另外，基于耦合系數(shù)對棱鏡和波導(dǎo)間接觸面的大小和質(zhì)量的相當(dāng)程度的依賴性，利用棱鏡將光耦合成激勵(lì)波的再現(xiàn)性和實(shí)際能力似乎存在困難。
在US-A-508 012中介紹了本發(fā)明主張的將光柵用于發(fā)光探測，該專利公開了將激勵(lì)光耦合進(jìn)波導(dǎo)的光柵結(jié)構(gòu)，以及專用的反射光柵，它能使激勵(lì)波多次通過波導(dǎo)。利用這種方法據(jù)說可以取得增加的靈敏度。體積發(fā)光射入空間角內(nèi)。還有，在經(jīng)二次通過后由輸入耦合光柵耦合出的激勵(lì)輻射可以用作參比信號。該方法的缺點(diǎn)是，由反射光柵引起背景輻射強(qiáng)度的強(qiáng)烈增加，它與熒光信號一起進(jìn)入空間角內(nèi)。所需的濾波器將限制探測靈敏度。
本發(fā)明的目的在于，提供一種用一個(gè)平面光波導(dǎo)測定發(fā)光的方法，該方法簡單而且經(jīng)濟(jì)可行。實(shí)際上只需要小的試樣體積。本發(fā)明的另一目的是，在平面光波導(dǎo)基礎(chǔ)上提供一種小型化的傳感器平臺用于實(shí)現(xiàn)該方法。
上述目的可以采用平面介電光學(xué)傳感器平臺測定發(fā)光的方法來實(shí)現(xiàn)，該平臺由其上涂敷一層透明波導(dǎo)層(b)的透明基底(a)組成，傳感器平臺設(shè)有一個(gè)耦合光柵，用于激勵(lì)光的輸入耦合，所述基底(a)的折射率低于波導(dǎo)層(b)的折射率，使液體樣品作為上層與層(b)相接觸，用光電方法測量樣品中具有發(fā)光特性物質(zhì)所產(chǎn)生的光。或固定在層(b)上的具有發(fā)光特性的物質(zhì)所產(chǎn)生的發(fā)光，用耦合光柵將激勵(lì)光耦合到平面波導(dǎo)內(nèi)，使光渡越波導(dǎo)層，于是，使具有發(fā)光性質(zhì)的物質(zhì)受到激勵(lì)，在波導(dǎo)層的短暫場內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光。該方法包括利用厚度小于激勵(lì)輻射波長λ的波導(dǎo)層，該波導(dǎo)層由在激勵(lì)輻射波長時(shí)其折射率≥1.8的材料組成，并用與第一耦合光柵空間上分開的第二耦合光柵從波導(dǎo)層耦合出，并探測反向耦合到波導(dǎo)層(b)內(nèi)的發(fā)光輻射。
優(yōu)選采用的方法構(gòu)成權(quán)利要求20-23的主題。傳感器平臺及其優(yōu)選實(shí)施例，即特別適合于實(shí)施本發(fā)明方法的實(shí)施例描述于權(quán)利要求24-38。本方法的優(yōu)選實(shí)施例構(gòu)成權(quán)利要求2-19的主題。
在本發(fā)明的實(shí)施中，采用耦合光柵將激勵(lì)輻射耦合到波導(dǎo)內(nèi)，并作為導(dǎo)波在波導(dǎo)層內(nèi)傳播。為有效短暫激勵(lì)熒光，通過選擇波長參數(shù)(折射率，厚層)有可能在/或靠近傳感器表面處取得高的場強(qiáng)。
很驚奇地發(fā)現(xiàn)，為確定下面介紹的波導(dǎo)的尺寸，發(fā)光輻射的相當(dāng)大的部分的光被短暫地反向耦合到波導(dǎo)中，并和激勵(lì)波一起由波導(dǎo)傳送。由此，采用與第一耦合光柵在空間上分開的第二耦合光柵可以將發(fā)光輻射從波導(dǎo)中耦合出，并傳導(dǎo)到探測系統(tǒng)。這種“光柵探測短暫發(fā)光”超越已有的“體積探測”的優(yōu)點(diǎn)在于使傳感器平臺和從屬的探測系統(tǒng)小型化的簡化可能性。
根據(jù)平面波導(dǎo)理論，有可能得到最有效發(fā)光激勵(lì)的平面波導(dǎo)的尺寸。下述的尺寸可以結(jié)合W.Lukosz″Principles and sensitivities ofintegrated optical and surface plasmon sensors for direct affinitysensing and immunosensing″，Biosensors & Bioelectronics 6,215-255(1991)，D.G.Hall，″Optical waveguide diffraction gratingscouplingbetween guided modes″，in Progress in Optics XXIX，ed.E.Wolf，Elsevier，New York(1991)；等文觀察到。
平面波導(dǎo)的短暫場進(jìn)入上層的穿透深度由下式表示Δzevo=λ/2π1Neff2-nsuper2]]>
對有效模式折射率Neff，上層折射率nsuper，工作波長λ。在上式中，z表示垂直于波導(dǎo)表面的座標(biāo)，x表示波導(dǎo)傳播的座標(biāo)?？紤]到在波導(dǎo)表面電場強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)化因子f，f=nfilm2-Neff2nfilm2-nsub2]]>其中，nfilm是波導(dǎo)折射率，nsub是基底折射率，在波導(dǎo)上短暫場的強(qiáng)度曲線IE正比于 垂直于波導(dǎo)表面的激勵(lì)短暫場的強(qiáng)度曲線確定量度層厚度和波導(dǎo)折射率的主要比例因子。在分析時(shí)，為探測靠近波導(dǎo)層的發(fā)光分子，就需考慮在確定波導(dǎo)尺度時(shí)分子離波導(dǎo)表面的距離。
對發(fā)光探測，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，發(fā)光的短暫反向耦合對于薄的、高折射平面波導(dǎo)是一種有效的探測方法。層厚度和折射率的選擇對于(可計(jì)算的)激勵(lì)效率以及短暫反向耦合均有影響。在后一種情況下，在靠近波導(dǎo)表面的鍵合分子輻射部分的輸入耦合與從試樣體積未鍵合分子的輸入耦合之間存在著競爭。
為了用本發(fā)明的方法有效探測在靠近波導(dǎo)表面具有發(fā)光特性的分子，已發(fā)現(xiàn)，波導(dǎo)參數(shù)必須在下述范圍內(nèi)·對激勵(lì)波長λ的折射率nfilm≥1.8。
·對激勵(lì)波長λ，層厚度tfilm≤λ，優(yōu)選tfilm≤λ/2。
本方法特別優(yōu)越的實(shí)施例是，層厚度選擇在40-160nm范圍內(nèi)，同時(shí)光柵的調(diào)制深度在3-60nm時(shí)，調(diào)制深度與層厚的比＜0.5。
這些波長也可表征為，它們一般只允許波導(dǎo)模數(shù)m低于或等于3的可傳播。
短暫反向耦合到波導(dǎo)的發(fā)光在波導(dǎo)內(nèi)傳輸；所以其特性是用導(dǎo)波的衰減系數(shù)「表征。如果有一個(gè)低的Stokes′位移，可以假設(shè)對激勵(lì)和光輻射具有相同的衰減數(shù)據(jù)(波導(dǎo)衰減的可能原因是，在波導(dǎo)介面的散射損耗，以及在波導(dǎo)層內(nèi)的吸收，或者在基底或上層內(nèi)的吸收)。如果沒有顯著的窄吸收帶，則對于散射和吸收兩者，可以預(yù)料由典型的10-50nm的Stoke′s位移引起的衰減變化不明顯。這種光譜窄帶吸收效應(yīng)必須在選擇傳感器平臺材料時(shí)予以避免。
在波導(dǎo)內(nèi)傳輸?shù)陌l(fā)光輻射必須耦合出來，并導(dǎo)入探測系統(tǒng)。不宜采用端面輸出耦合；一方面，這種耦合需要高質(zhì)量的波長邊緣，在某些情況下需經(jīng)浸液體或膠接觸光學(xué)探測器，另一方面，不能使傳感元件與液池結(jié)合成整體。
使用與輸入耦合激勵(lì)輻射的耦合光柵空間分開的第二耦合光柵將發(fā)光輻射耦合出，這樣能完全避免端面的問題。另一優(yōu)點(diǎn)是，在X方向光柵距離A(即在導(dǎo)波方向)可以隨意選擇。因此，可提供調(diào)節(jié)距離A來對每一波長的衰減最佳化，而不需要改變傳感器和液池的外部尺寸。還有的優(yōu)點(diǎn)是，傳感元件的外邊緣不需要滿足任何光學(xué)性能的要求，他們的結(jié)構(gòu)可以調(diào)整以與液池匹配，尤其是與采用的密封結(jié)構(gòu)液池匹配。
光柵距離B的最佳值是B＝X1/e，B值在B≈(0.2-3)*X1/e的范圍內(nèi)可變動(X1/e表示在X方向傳導(dǎo)的激勵(lì)波的強(qiáng)度下降至波長的1/e)。
(Conversion.Γ[dB/cm]→X1/e[1/mm]X1/e＝100/(ln10*Γ))對于較大的距離，激勵(lì)光以及傳導(dǎo)的發(fā)光受到明顯衰減，導(dǎo)致強(qiáng)信號下降。首先，不用激勵(lì)和反向耦合表示下限，還需要加上光柵和在輸入耦合光柵上激勵(lì)輻射的位置來確定。這里的間距不能小于100um，還要依據(jù)下面將介紹的輸入耦合光柵的寬度大小以及在輸入耦合光柵邊緣上激勵(lì)輻射的光直徑大小而定。
下面將參照附圖更為詳細(xì)描述本發(fā)明。

圖1表示尤其適用于實(shí)施具有一種可能的輻射曲線的本發(fā)明方法的光學(xué)傳感器平臺的側(cè)視圖。圖2表示圖1所示傳感器平臺的頂視圖。
在圖1中，1是傳感器平臺，2是用于耦合激勵(lì)光的耦合光柵，3是用于耦合出發(fā)光的耦合光柵，4是波導(dǎo)層，5是基底。
圖1表示激勵(lì)和發(fā)光輻射輸入耦合進(jìn)和輸出耦合出傳感器平臺的可能光路。在X方向傳播的導(dǎo)波受到傳感器平面內(nèi)的耦合光柵2激勵(lì)，此時(shí)涉及波矢×分量的共振條件得到滿足kWL＝kein±m(xù)*kG±m(xù)*2π/AG，m是整數(shù)，KG是光柵倒易矢量kWL＝2π/λ*Neff＝k0*Neff具有有效模折射率Neff的波矢-導(dǎo)波。
在圖1中，負(fù)角θ表示kin＝ko*cosθ的輸入耦合(ko在圖平面內(nèi)的波矢幅度)，從而導(dǎo)波在與激勵(lì)“相反方向”內(nèi)運(yùn)行(所謂“后向耦合”)。選擇正角將激勵(lì)波耦合出來(Kout)，同時(shí)將發(fā)光輻射(Kout)耦合出來。
用對反射的入射光和耦合出的光有明顯不同方向的輸入和輸出構(gòu)形來取得高的背景自由度。不同輻射部分的空間分隔可保證發(fā)光探測的最佳信噪比耦合出的激勵(lì)輻射和發(fā)光輻射不在共同光路內(nèi)運(yùn)行，這樣濾光器(截止或帶通濾光器，圖1未示出)只用于抑制散射光，但不用于耦合出激勵(lì)輻射的整個(gè)強(qiáng)度。
使用輸出耦合光柵的另一優(yōu)點(diǎn)是，發(fā)光輻射不同的光譜成分在不同的方向上耦合出來。所以，借助本發(fā)明也可探測弱的發(fā)光試樣介質(zhì)中的分子，如果欲探測分子的發(fā)光和試樣介質(zhì)的發(fā)光在光譜上是不同的，甚至可以不用附加濾光器進(jìn)行探測。
通過選擇光柵常數(shù)∧1和∧2，可以調(diào)節(jié)輸入和輸出耦合光柵的角度。如圖1所示的優(yōu)選情況，輸入和輸出光柵之間具有一個(gè)方向間隔，必須選擇明顯不同的光柵常數(shù)。
另一方式，為簡化傳感器的制造，可以使光柵2和3具有相同的光柵常數(shù)，這對盡可能低費(fèi)用加工傳感器是很重要的，如果采用全息光柵結(jié)構(gòu)，則許多步驟可以省略。耦合輸出的激勵(lì)和發(fā)光輻射的方向的空間分開在使用相同光柵常數(shù)時(shí)仍可以確保。只是忽略了反射輸入耦合輻射方向的可靠的區(qū)分。因此，需要對反射發(fā)光屏進(jìn)行附加測量，例如使用孔徑或光擋來測量。
可以在|θ|≈1°-50° (對角度的輻度)范圍內(nèi)選擇光柵常數(shù)來確定耦合角?？紤]到Bragg反射，應(yīng)避免采用較小的角度值，否則至甚在傳感器的水平度或調(diào)節(jié)的低容限時(shí)會出現(xiàn)這種反射，使輸入和輸出耦合不出現(xiàn)。大至幾乎達(dá)90°的角度是可能的，但是為了光路的合理調(diào)試，應(yīng)避免該角度超過傳感器的面法線。
光柵深度的大小可以按照已有技術(shù)所述( T.Tamir，S.T Peng″Analysis and Design of Grating Couplers″，Appl.phys.14,235-254(1979)；T.Tamir，″Beam and waveguide Couplers″in″IntegratedOptics″，ed，T.Tamir，Springer，Berlin(1979)。所謂“漏參數(shù)”α在此作為一個(gè)特征α表示在界面具有深度為tgrating的耦合光柵的波導(dǎo)內(nèi)導(dǎo)波的強(qiáng)度下降1/e。因此，1/α是輻射能量從導(dǎo)波轉(zhuǎn)移到自由傳播的波，或相反情況的特征長度。所以，選擇輸入耦合光柵深度的重要性，首要的不是漏參數(shù)的絕對值，而是調(diào)節(jié)漏參數(shù)和入射光的輻射參數(shù)(光束直徑和發(fā)散度)。為了在空間有限的光柵上取得最佳的具有高斯形激光束的輸入耦合，就需滿足下述的漏參數(shù)條件，光束直徑和相對于光柵邊緣的光束位置·α*wo＝1.36·xo/wo＝0.733值Xc表示光點(diǎn)中心朝向光柵邊緣位置的位移。這種位移發(fā)生在遠(yuǎn)離從邊緣至光柵結(jié)構(gòu)區(qū)的地方。按照該條件，可取得輸入耦合效率大于80％。
一個(gè)對輸出耦合的模擬觀察，其結(jié)果是可以取得80％或更高的高耦合效率。前提是，光柵在X方向的橫向展開明顯地大于漏參數(shù)。然而，由于導(dǎo)波通過光柵的衰減耦合出來的自由傳播光束的強(qiáng)度分布是非對稱的。
在設(shè)定輸入耦合的漏參數(shù)時(shí)需考慮下述方面·確定光斑相對于光柵邊緣的位置·使傳感元件小型化雖然小的漏參數(shù)(α＜＜1/mm)和相應(yīng)的大的光束直徑使定位簡化，但是在光柵寬度大于A＝3mm情況下，使傳感器小型化的可能性明顯地受到限制。對實(shí)現(xiàn)完全耦合，光柵寬度應(yīng)該是A＞3*Wo。此外，光柵和波導(dǎo)的不均勻性對耦合效率具有負(fù)效應(yīng)。而大的漏參數(shù)(α＞10/mm)和光束直徑Wo＜10μm將允許非常小的光柵尺寸，并且允許定位精度為＜＜100μm。還有，在這種情況下，耦合效率尤其受到光束發(fā)散度明顯超過耦合共振角度范圍這一事實(shí)的限制。
已發(fā)現(xiàn)，漏參數(shù)范圍α＝( 0.2-5)/1mm正好兼顧了調(diào)節(jié)要求，定位容限和小型化。對于上述波導(dǎo)層厚度，tgrating＝3-60nm，尤其是3-40nm的范圍，對于光柵深度來說，在基底-波導(dǎo)界面使用正弦波調(diào)制時(shí)，通常與該范圍相當(dāng)。由于漏參數(shù)非常依賴于光柵的表面分布形狀，對于傳感器功能的重要量度不是幾何深度而是漏參數(shù)。
傳感器平臺的基底必須在激勵(lì)和發(fā)射波長是透過的?；滓部梢允且环N塑料，如在EP-A-0533074中所述的。
基底也可以是不同材料的復(fù)合系統(tǒng)，例如在一個(gè)支承板上的層系統(tǒng)，或類似物。在這種情況下，只需要使直接相鄰于波導(dǎo)層的材料的折射率小于波導(dǎo)層的折射率就可。
在可以使用微結(jié)構(gòu)的聚合物用作波導(dǎo)層的基底時(shí)，就可以使低費(fèi)用制造傳感器平臺成為可能。在這種情況下，激勵(lì)基底-本征發(fā)光限制了探測靈敏度。這種本征發(fā)光的激勵(lì)和短暫的反向耦合以類似于上述在波導(dǎo)-上層界面處的機(jī)制出現(xiàn)在波導(dǎo)基底材料界面處。這種基底-發(fā)光可以采用在波導(dǎo)涂層之前將一種低折射率的非發(fā)光中間層涂在基底上予以避免(這種低折射率中間層其折射率低于或等于波導(dǎo)的折射率)。一種特別合適的中間層材料是SiO2，或者基本由具有組分SiOxHyCz的SiO2組成，該組合物可以另外插入低級烴基。選擇中間層的厚度tbuffer，以便由基底側(cè)上導(dǎo)波的短暫場傳輸?shù)哪芰烤窒拊谥虚g層內(nèi)。如果tbuffer大于短暫場的光穿透深度值Zeva的六倍，上述條件實(shí)際上得到滿足。在短暫發(fā)光探測中，對于最佳信噪比，5倍的值是適宜的。該條件完全滿足于tbuffer≤2000nm。
利用中間層的另一優(yōu)點(diǎn)在于減小基底表面的不平度。于是，伴隨對信噪比的正面影響降低了短暫發(fā)光探測中的波導(dǎo)衰減「。
只有基本上平行的光適用于發(fā)光激勵(lì)。本發(fā)明中，應(yīng)明白“基本平行”所表示的是光束發(fā)散度小于5°。這意味著，光可以是稍有發(fā)散或會聚。較大的發(fā)散度可以簡化對輸入耦合角度的調(diào)節(jié)，但是降低了熒光信號，由于輸入耦合共振的寬度明顯由于發(fā)散角，因此只有小部分的用于發(fā)光激勵(lì)的入射能量可以獲取。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，平面的介電光學(xué)傳感器平臺表示所述的平臺是條帶狀的，平板狀的，圓盤狀的或者任何其它幾何形狀的，只要用肉眼看是平面的。如果導(dǎo)波能夠在波導(dǎo)層內(nèi)傳播，以及能實(shí)現(xiàn)如圖1那樣的輸入和輸出耦合則平面度的偏差要求不十分嚴(yán)格?？梢愿鶕?jù)內(nèi)設(shè)置傳感器平臺的整個(gè)裝置的結(jié)構(gòu)來統(tǒng)盤考慮所選擇的幾何形狀。優(yōu)選的布置應(yīng)滿足小型化要求。
除上述的使用有機(jī)微結(jié)構(gòu)基底外，也可以使用無機(jī)基底，例如玻璃或石英。他們相對于聚合物的優(yōu)點(diǎn)在于低的本征發(fā)光。然而，對于低費(fèi)用加工傳感器平臺，對這些基底涂以低折射率的涂層是適宜的，在該涂層中插入了耦合光柵的光柵結(jié)構(gòu)這描述于EP-A-0533074中。
另外，耦合光柵可以位于波導(dǎo)/上層界面處。
制造這種耦合光柵的方法是已知的。在它們的生產(chǎn)中主要應(yīng)用光刻，或全息照相方法和蝕刻技術(shù)。這尤其描述于Chemical，Biochemicaland Enviromental Fiber Sensors V.proc，SPIE，vol.2068，1-13，1994。
可以在基底上制作光柵結(jié)構(gòu)，再轉(zhuǎn)移至波導(dǎo)層，在波導(dǎo)層內(nèi)使光柵結(jié)構(gòu)成象，或者就在波導(dǎo)內(nèi)制作光柵光柵周期可以是200-1000nm，而最好光柵只有一種周期性，即是單色衍射。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，“試樣”一詞是指欲測試的整個(gè)溶液，它包含欲探測的物質(zhì)-被分析物。這種探測可以一步或多步方式進(jìn)行，在探測過程中，傳感器平臺的表面與一種或多種溶液接觸。至少所用溶液的一種包含具有本發(fā)明可測的發(fā)光特性的物質(zhì)。
如果具有發(fā)光特性的物質(zhì)已經(jīng)在波導(dǎo)層(b)上被吸收，那么試樣也可以無發(fā)光成分。試樣可以包含其它的成分，典型的是PH緩沖劑，鹽，酸，堿，表面活性物質(zhì)，影響粘度的調(diào)節(jié)劑或染料。生理鹽水溶液尤其可以用作溶劑。如果熒光成分本身是液體，則可以不用添加溶劑。在這種情況下，試樣可包含高至100％的具有發(fā)光特性的成分。
試樣還可包含生物介質(zhì)，例如蛋黃，體液或其成分，尤其是血液、血清、血漿或尿液。另外，試樣可由表面水、天然或合成介質(zhì)的土壤、植物部分的提取溶液，生物工藝的發(fā)酵液或合成發(fā)酵液等組成。
試樣可以是不稀釋的，或添加溶劑的。
合適的溶劑是水，水質(zhì)緩沖液，蛋白質(zhì)溶液和有機(jī)溶劑。適合的有機(jī)溶劑是醇、酮、脂族烴，最好使用水，水質(zhì)緩沖液，或者水和水溶有機(jī)溶劑的混合液。
然而，試樣也可包含不溶于溶劑的組分，例如色素粒子，分散劑，天然或合成低聚體或聚合物。在這種情況下，試樣是以光學(xué)混濁分散液或乳液的形式存在。
合適的發(fā)光化合物是在波長330nm-1000nm范圍內(nèi)具有發(fā)光的發(fā)光染料，典型的是若丹明，熒光素衍生物，香豆素衍生物，聯(lián)苯乙烯聯(lián)苯(distyryl biphenyls)，茋衍生物，酞菁、萘菁，聚吡啶-釕配合物，例如氯化三(2，2′聯(lián)吡啶)合銠，氯化三(1，10-菲咯啉)合釕，氯化三(4，7-二苯基-1，10) 菲咯啉)合釕和聚吡啶-吩嗪-釕配合物，鉑-卟啉配合物，例如辛乙基-鉑-卟啉，長壽命的銪和鋱配合物或菁染料。最適合血或血清分析的是在600-900nm范圍具有吸收和發(fā)射波長的染料。
最合適的發(fā)光化合物是諸如熒光素衍生物的染料，其所含的功能基團(tuán)可以使其共價(jià)鍵合，例如熒光素異硫氰酸酯。
非常合適的功能熒光染料可以從生物檢測系統(tǒng)公司( BiologicalDetection System Inc.)獲取，例如在Clinical Chemistry 40(9)1819-1822，1994中介紹的單官能和雙官能Cy5.5TM染料。
優(yōu)選的發(fā)光是熒光，優(yōu)選用相干光激勵(lì)，由此在輸入耦合光柵的共振條件伴隨高效率得到滿足。所以選用的激光光源應(yīng)根據(jù)發(fā)光或熒光分子的吸收波長來選擇。
最好使用激光二極管或超發(fā)光二極管作為光源，因?yàn)槭褂眠@些光源有可能使具有所設(shè)計(jì)傳感器平臺的探測系統(tǒng)高度小型化。
適用的發(fā)光染料也可以是化學(xué)鍵合到聚合物，或鍵合到生物親和系統(tǒng)中的結(jié)合配偶體上，例如抗體，或抗體片段，抗原，蛋白質(zhì)，肽，受體或他們的配體，激素或激素受體，低核苷酸，DNA鏈和RNA鏈，DNA和RNA類似物，結(jié)合蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)A和G，抗生物素蛋白或生物素，酶，酶輔因子或抑制劑，外源凝集素或碳水化合物。共價(jià)熒光標(biāo)記最后提及者優(yōu)選用于可逆的或不可逆的(生物)化學(xué)親和性分析。還可使用發(fā)光標(biāo)記的類固醇，脂質(zhì)和螯合劑。嵌入發(fā)光染料對于用DNA鏈或低核苷酸的雜交分析尤為有意義，尤其如果-類似不同的釕的配合物-他們在嵌入時(shí)可增加發(fā)光。如果這些發(fā)光標(biāo)記的化合物與固定在傳感器平臺表面上的親合配偶體相接觸，則這種結(jié)合可以從測量發(fā)光強(qiáng)度來定量測定。也可以在試樣與發(fā)光體相互作用時(shí)測量發(fā)光的改變來對分析物作定量測定，例如用氧猝滅發(fā)光的形式，或通過蛋白質(zhì)的形態(tài)改性來使發(fā)光增加的方式來測定。
適宜制造波導(dǎo)層的材料典型的是無機(jī)材料，最好選用無機(jī)金屬氧化物，如TiO2、ZnO、Nb5O5、Ta2O5、HfO2或ZrO2。最好選用Ta2O5和TiO2。
在本發(fā)明方法中，試樣可以在不動狀態(tài)，以及在波導(dǎo)層上連續(xù)經(jīng)過的狀態(tài)與波導(dǎo)層相接觸，該循環(huán)可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。
本方法的具體實(shí)施例在于在波導(dǎo)層(b)的表面上固定具有發(fā)光特性的用于檢測分析物的物質(zhì)。具有發(fā)光性質(zhì)的物質(zhì)，例如可以是與蛋白質(zhì)鍵合的發(fā)光體，于是可以用這種方式在波導(dǎo)層的表面上使發(fā)光體受激發(fā)光。如果對蛋白質(zhì)具有親和性的配偶體(partner)被引導(dǎo)經(jīng)過這一不運(yùn)動的層時(shí)則發(fā)光可以改變，可用這種方式測量配偶體的量。尤其，也可用發(fā)光體標(biāo)記親和性配偶物的二個(gè)配偶體，則就能從二個(gè)配偶體之間的能量轉(zhuǎn)移，例如以發(fā)光猝滅的形式，實(shí)現(xiàn)濃度的測定。
本發(fā)明方法用于進(jìn)行化學(xué)或生化親和性檢測的其它優(yōu)選實(shí)施例在于在傳感器平臺的表面固定一種特殊的結(jié)合配偶體作為化學(xué)或生化探測物質(zhì)用于被分析物其自身或結(jié)合配偶體之一。在該分析過程中，測定可以是一步或多步進(jìn)行，在相繼的步驟中，引導(dǎo)一種或多種含有用于固定在傳感器平臺表面上的探測物質(zhì)的結(jié)合配偶體的溶液，使被分析物在某一分步驟中受到結(jié)合。通過在親和性測試中的結(jié)合發(fā)光標(biāo)記的參與物來進(jìn)行被分析物的探測。所用的發(fā)光標(biāo)記物可由一個(gè)或多個(gè)親和性測試的結(jié)合配偶體組成，或者也可以由配有發(fā)光體的被分析物的類似物組成。唯一的準(zhǔn)則是，分析物的存在選擇性地導(dǎo)致發(fā)光信號，或者有選擇地導(dǎo)致發(fā)光信號的改變。
探測器物質(zhì)的固定可以采用在波導(dǎo)層上疏水吸收，或直接共價(jià)結(jié)合，或例如硅烷化或加聚合物層對表面化學(xué)改性后來實(shí)現(xiàn)。另外，例如由SiO2構(gòu)成的薄的中間層可以作為促進(jìn)粘結(jié)層直接加到波導(dǎo)層上，以便于探測器物質(zhì)直接固定在波導(dǎo)上。中間層的厚度應(yīng)該不超過50nm，最好為20nm。
合適的探測器物質(zhì)典型的是多種抗原用的抗體，結(jié)合蛋白質(zhì)，例如用于免疫球蛋白的蛋白質(zhì)A和G，配體的受體，低核苷酸和用于RNA和DNA互補(bǔ)鏈的RNA和DNA的單鏈，生物素的抗生物素蛋白，用于酶基質(zhì)的酶，酶輔因子或抑制劑，用于碳水化合物的外源凝集素。將各個(gè)親和性配體中，那一個(gè)固定在傳感器平臺的表面上還得取決于檢測的體系結(jié)構(gòu)。
檢測本身可以是一個(gè)單步的復(fù)雜過程，例如競爭性的測定，也可以是多步過程，例如多層的測定。
在最簡單的競爭性測定情況下，含有未知濃度的被分析物和已知量的化合物(與被分析物類似，除發(fā)光標(biāo)記外)的試樣與傳感器平臺相接觸，在此，發(fā)光標(biāo)記的和未標(biāo)記的分子在他們的固定探測物上競爭結(jié)合位置。在試樣不包含被分析物時(shí)，在這種測定構(gòu)形中取得一個(gè)最大的發(fā)光信號。隨著欲測物質(zhì)的濃度增加，受到觀察的發(fā)光信號逐漸下降。
在競爭免疫測試中，不一定需要不動的抗體抗原也可以作為探測物被固定在傳感器平臺上。通常，在化學(xué)或生化親和性檢測中固定那一個(gè)配體是不重要的。這是基于發(fā)光的檢測比其它方法，例如表面細(xì)胞質(zhì)?；蚪M共振或干涉測量法所具有的基本優(yōu)點(diǎn)，后者的方法是基于在波導(dǎo)層的短暫場內(nèi)吸收的質(zhì)量的改變進(jìn)行的。
另外，在競爭檢測中，這種競爭并不需要限制在傳感器平臺的表面上的結(jié)合位置。例如，也可以將已知量的抗原固定到傳感器平臺的表面上， 然后使它與試樣接觸，這種試樣包含欲測的未知量的與被測物相同抗原的以及發(fā)光標(biāo)記的抗體。在這種情況下，固定在表面上的和在溶液中的抗原之間產(chǎn)生對結(jié)合抗體的競爭。
多步檢測的最簡單情況是一種夾心免疫檢測，其中初級抗體在傳感器平臺的表面上被固定不動。待探測抗原以及用于檢測的發(fā)光標(biāo)記的次級(secondary)抗體對抗原的第二表位的結(jié)合可通過將含抗原的溶液與含發(fā)光標(biāo)記的抗體的第二溶液連續(xù)接觸或通過將上述兩種溶液合并來進(jìn)行，最終由抗原和熒光標(biāo)記的抗體組成的部分復(fù)合物受到結(jié)合。
親和性的測試還包括其它附加的結(jié)合步驟。例如在夾心免疫檢測的情況下，蛋白質(zhì)A(其專門結(jié)合面可以在相繼夾心檢測中起初級抗體作用的免疫球蛋白，這種結(jié)合在他們的所謂Fc部分如上所述進(jìn)行)可以在第一步就被固定在傳感器平臺的表面上存在著許多類型的親和性測試，典型的是利用抗生物素蛋白-生物素親和性系統(tǒng)來測試。
展開的親和性測試的例子記載在J.H.Rittenburg的“免疫檢測的基礎(chǔ)”(Fundamentals of Immunoassay)中；以及在J.H.Rittenburg(Ed)，Elsevier，Essex 1990的“食物分析用的免疫測試的發(fā)展和應(yīng)用”(Development and Application of Immunoassay for Food Aanlysis)中，或者在R.H.Burdon，P.H.van Knippenberg(Eds)，Elsevier，Amsterdam 1985的“酶免疫分析的實(shí)踐和理論”(Practice and Theoryof Enzyme Immunoassays)中。
還可以使傳感器平臺的表面不僅使用一次，也可再生使用。在適合的條件下，例如低的pH值，升高溫度，使用有機(jī)溶劑或所謂離液序列高的試劑(鹽)，有可能不用明顯削弱固定探測物的結(jié)合能力就能有選擇地離解親和性復(fù)合物。這種精確的條件強(qiáng)烈取決于特殊親和性的系統(tǒng)。
本方法其它基本的實(shí)施一方面在于將信號的產(chǎn)生限于波導(dǎo)的短暫場中，在反向耦合的情況下，這也適用于信號檢測，另一方面在于在平衡過程中親和性復(fù)合物形成的可逆性。在連續(xù)流動系統(tǒng)中利用合適的流動速率，就可能實(shí)時(shí)監(jiān)測在短暫場中結(jié)合的發(fā)光標(biāo)記的親和性配偶體的結(jié)合、解吸附或離解。所以，本方法適用于對確定不同的結(jié)合或離解常數(shù)的動力學(xué)研究，也可用于替代檢測。
可以采用已知的方法進(jìn)行探測短暫的受激發(fā)光。光二極管，光電池，光電倍增管，CCD攝象機(jī)和探測器陣列，例如CCD光電元件均適用。可以用光學(xué)元件，例如平面鏡，棱鏡，透鏡，菲尼耳透鏡，折射率梯度透鏡使發(fā)光成象。為選擇發(fā)射波長，可以使用已知的元件，例如濾光片，棱鏡，單色濾光片，雙色鏡和衍射光柵。
本方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，除了探測發(fā)光外，也可測定受激發(fā)射光的吸收。與光纖或平面結(jié)構(gòu)的多模波導(dǎo)相比較，在這種情況下可以取得好得多的信噪比。發(fā)光和吸收的同時(shí)測量將使得高靈敏度測定發(fā)光猝滅效應(yīng)成為可能。
在本發(fā)明的一個(gè)簡單實(shí)施例中，該方法可以采用以連續(xù)波方式(CW)的激勵(lì)光輻射進(jìn)行，即，用恒定的光強(qiáng)進(jìn)行激勵(lì)。
然而，本方法也可用脈沖長度為如1皮秒-100秒的計(jì)時(shí)脈沖形式的光作為激勵(lì)光輻射，并通過時(shí)間分辨的發(fā)光的探測，即在短脈沖長度的情況下，或在幾秒至幾分鐘時(shí)間間隔的情況下來進(jìn)行。本方法在需要例如分析監(jiān)測結(jié)合形成的速率，或阻止由于用短的曝光時(shí)間所致的光化學(xué)消失(fading)所引起的發(fā)光信號的下降，均具有特殊的優(yōu)點(diǎn)。利用適宜的短脈沖長度和合適的探測時(shí)間分辨，還可以從標(biāo)記分子的發(fā)光(在這種情況下優(yōu)選長壽)中區(qū)分散射光，拉曼發(fā)射和試樣和傳感材料的任何所不希望的發(fā)光成分中的短壽命的發(fā)光，只需在短壽命的輻射衰減之后探測被測物的發(fā)射就可確定。另外，時(shí)間分辨的發(fā)光探測允許在脈沖激勵(lì)之后，如同調(diào)制激勵(lì)和探測一樣，進(jìn)行被分析物的結(jié)合對分子發(fā)光衰減的影響的研究。除了用固定的探測物質(zhì)對被測物進(jìn)行特殊的識別和將信號的產(chǎn)生空間上限于波導(dǎo)的短暫場，可以利用分子發(fā)光的衰減時(shí)間作為選擇性的進(jìn)一步判據(jù)。
本方法也可以用強(qiáng)度受到調(diào)制的一個(gè)或多個(gè)頻率的輸入耦合激勵(lì)光來實(shí)現(xiàn)，同時(shí)探測試樣發(fā)光的最后相位移和調(diào)制。
本發(fā)明還涉及用創(chuàng)造性的方法在化學(xué)或生化親和性檢測中對被測物的定量測定，其中使用已知親和性配偶體和分析結(jié)構(gòu)，和探測能產(chǎn)生發(fā)光的標(biāo)記結(jié)合配偶體的發(fā)射，或者探測與被分析物相互作用的固定的發(fā)光標(biāo)記的親合性配體的發(fā)光特性的改變來實(shí)現(xiàn)定量測定。
由于信號的產(chǎn)生和探測限于波導(dǎo)上的化學(xué)或生化探測表面，由介質(zhì)產(chǎn)生的干涉信號被區(qū)分，因此結(jié)合到固定探測元件上的物質(zhì)可以被實(shí)時(shí)監(jiān)測。所以，通過在連續(xù)流動系統(tǒng)中以合適的流動率來直接探測結(jié)合和離解率，有可能把本發(fā)明的方法用于親和性的篩選、或置換檢測，尤其用于藥物制品開發(fā)。
其它方面，本發(fā)明涉及將本發(fā)明的方法用于抗體或抗原的定量測定。
本發(fā)明方法的其它利用在于，定量測定受體或配體，低核苷酸，DNA和RNA鏈，DNA或RNA的類似物，酶，酶基質(zhì)，酶輔因子或抑制劑，外源凝集素和碳水化合物。
其它方面，本發(fā)明還涉及將本發(fā)明方法用于在光學(xué)混濁液中選擇性定量測定發(fā)光的成分。
典型的光學(xué)混濁液體可以是生物液體，如蛋黃，體液如血，血清，血漿，以及從環(huán)境分析中來源的樣品，包括表面水，溶解的土壤提取物，溶解的植物提取物。合適的流體也可以是在化學(xué)生產(chǎn)中獲取的反應(yīng)液，尤其是染料溶液或從熒光增白劑生產(chǎn)中出來的反應(yīng)液。還包括各種類型的用在紡織工業(yè)中典型的分散體和制劑，只要它們具有一種或多種發(fā)光成分。因此本發(fā)明方法還用于質(zhì)量的安全監(jiān)測。
本發(fā)明通過下述的舉例作更詳細(xì)的說明，其中濃度M為每升摩爾濃度。舉例光學(xué)系統(tǒng)光源采用一個(gè)輸出波長λ＝670nm(OZ光學(xué))的激光二極管。調(diào)節(jié)在傳感器平面上的光點(diǎn)直徑為0.4nm，垂直于耦合光柵刻線而平行于光柵刻線的光點(diǎn)直徑為2.5nm，這可利用成象光學(xué)系統(tǒng)來取得。
相對于光柵邊緣調(diào)節(jié)輸入耦合角并對光點(diǎn)定位，這種調(diào)節(jié)由機(jī)械調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)完成。
選擇在傳感器芯片上的激光功率在P＝0-3mw范圍內(nèi)；而對于下述光柵特性實(shí)驗(yàn)用的功率則選擇P＝1.2mw，用于熒光測量的P＝0.2mw。具有TE或TM取向的線偏振光可以利用旋轉(zhuǎn)偏振元件預(yù)以輸入耦合。
用O形密封圈使流動液池相對傳感器密封，該液池安裝在傳感器平臺的頂側(cè)。液池的試樣體積是約8μl。利用噴射泵和轉(zhuǎn)向閥可以將不同的溶液引入液池內(nèi)。
如圖1所示，在傳感器平臺的下側(cè)進(jìn)行激勵(lì)和探測。
三個(gè)測量通道用于探測、用于在輸出耦合光柵耦合出的激勵(lì)光和熒光(圖1中K′out和Kout方面)，以及經(jīng)由分束器的入射激勵(lì)光(圖1未示出)。
使用單光子計(jì)數(shù)方式的具有脈沖形成電子線路(Hamamatsu C3866)的放大器(Hamamatsu R 4632 SEL)作為熒光輻射的探測器。他的TTL輸出信號由常用的脈沖計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)(Hewlett-Packard 53131A)。利用聚焦透鏡系統(tǒng)可以將角扇區(qū)的熒光輻射聚焦到探測器上。壓縮散射光的干涉濾光片( band-pass at λ＝725nm with half-width25nm，Omega)放置在探測器的前面。
串聯(lián)的帶有測量放大器(UDU 101C)的硅二極管(UDT PIN10D)用作入射和耦合出的激勵(lì)輻射的參比探測器。
在利用常規(guī)的數(shù)據(jù)輸入系統(tǒng)進(jìn)行下述的檢測時(shí)，可以對所有的三通道同時(shí)估測。傳感器平臺以下述方式微結(jié)構(gòu)化的具有輸入和輸出耦合光柵的聚碳酸酯用作基底輸入耦合光柵，其周期∧1＝(299.5±0.7nm )，深度t1＝6.9nm-12.3nm；輸入耦合光柵，其周期A2＝(489.5±0.6nm)，深度t1＝8.2nm-12.8nm，二個(gè)光柵具有近似Sin4分布。
按照圖2所示使上述光柵布置在傳感器上，并具有下列幾何值光柵距離A＝4mm，光柵寬度(垂直于刻線)B1＝B2＝2mm，光柵高度(平行于刻線)4mm，傳感器平臺的尺寸是12×20mm2。
為了抑制聚碳酸酯的自熒光，該基底用折射率n＝1.46，厚度為tbuffer＝(100-±10nm)的SiO2中間層涂覆，之后形成TiO2波導(dǎo)層，其在λ＝670nm處具有高折射率nfilm＝2.35，層厚tfilm＝(170±5nm)。
利用激勵(lì)先，模式級數(shù)為m＝0可以在光柵-波導(dǎo)結(jié)合的波導(dǎo)內(nèi)受到激勵(lì)在角度θ＝(-10±1.6)°時(shí)，對TE0輸入耦合有效果，而在θ(-22.7±3.7)°時(shí)，對TM0有效果。
具有TE偏振的熒光輻射，在角范圍θ＝31°-40°，激勵(lì)光的角度為θ＞42°時(shí)被耦合出來。光譜范圍λ約685nm-715nm。對于TM偏振，對熒光的輸出耦合角范圍為θ=1 7°-25°，對激勵(lì)輻射θ＞27°。對于TE偏振，在輸出耦合充柵之后探測到入射激光強(qiáng)度P＝1.2mw的光效率P＝30-50μw。探測Cy5.5TM-標(biāo)記的免疫球蛋白用Cy5.5TM染料標(biāo)記免疫球蛋白利用雙官能的菁染料FluorolinkTMCy5.5TM按制造者(BiologicalDetection Systems，Pittsburgh PA 15238，USA)介紹的方法標(biāo)記Rabbit免疫球蛋白(rabbit IgG，Sigma Chemicals)。1.在1mi染料中含有2.5mg rabbit IgG的溶液，溫育45分鐘，每10分鐘搖動溶液。2.該溶液加入1ml染料中，靜置45分鐘，每10分鐘搖動溶液。3.在一個(gè)Sephadex R G25分離柱( Pharmacia LKB，BiotechnologyAB，Uppsala，Sweden)上分離結(jié)合蛋白質(zhì)的和未結(jié)合蛋白質(zhì)的染料，分離柱已事先用50ml PH＝7的磷酸鹽緩沖液平衡過-去掉1ml，-收集多個(gè)餾分4.從678nm(染料吸收帶)的光密度和280nm(蛋白質(zhì)吸收帶)的光密度，測量染料/蛋白質(zhì)比值。由此測定1染料分子與2蛋白質(zhì)分子的比值。所用的溶液1)緩沖液由(0.041M的Na2HPO4+0.028M的KH2PO4)、0.151M的NaCl，200mg/l的迭氮化鈉，50ml甲醇，用蒸餾水加到1升；2)免疫蛋白質(zhì)A的溶液(Sigma Chemicals)1mg/ml蒸餾水；3)中和溶液緩沖液1)+10mg/ml牛血清蛋白(BSA Sigma Chemicals)；4)清洗液用于測定本底信號，緩沖液1)+1mg/ml的BSA；5)試樣液Cy5.5TM-標(biāo)記的免疫球蛋白，在含有1mg/ml BSA的緩沖液1中有不同的濃度10-8M，10-9M；3·10-10M，1·10-10M6)再生液甘氨酸緩沖液，PH2.5應(yīng)用蛋白質(zhì)A的生化指示層光學(xué)傳感器平臺用溶液2)溫育10小時(shí)，以固定蛋白質(zhì)A。為中和任何仍未吸附的位置，將傳感器平臺用蒸餾水清洗，然后再用含10g/lBSA的中性溶液溫育1小時(shí)。測量步驟/檢測在整個(gè)測量步驟中，在活化的傳感器表面上保持0.25ml/分鐘的液流流動本方法由下列各個(gè)步驟組成。-用清洗液4)清洗4分鐘，記錄背景信號；-在4分鐘內(nèi)添加試樣溶液5)；-用清洗液4)清洗4分鐘；-在4分鐘內(nèi)添加再去溶液6)；-用清洗液4)清洗4分鐘。
在整個(gè)方法中予以測量由第二光柵耦合出來的熒光信號。在不同的濃度，記錄在添加試樣的結(jié)束時(shí)的以下信號改變，并與初始的背景信號作比較(信噪比每秒在50和100脈沖之間(CPS)〔Cy5.5-tgG〕熒光信號〔CPS〕10-8M 700010-9M 8503·10-10M 300由光柵耦合輸出探測熒光的探測限很明顯低于3·10-10M，相當(dāng)于Cy5.5標(biāo)記的IgG的被測物濃度為3·10-13mol。
權(quán)利要求
1.一種利用平面介電光學(xué)傳感器平臺測定發(fā)光的方法，該平臺由其上涂敷一薄層透明波導(dǎo)層(b)的透明基底(a)組成，傳感器平臺設(shè)有一個(gè)耦合光柵，用于激勵(lì)光的輸入耦合，所述基底(a)的折射率低于波導(dǎo)層(b)的折射率，使液體樣品作為上層與層(b)相接觸，用光電方法測量樣品中具有發(fā)光特性的物質(zhì)所產(chǎn)生的發(fā)光，或固定在層(b)上的具有發(fā)光特性的物質(zhì)所產(chǎn)生的發(fā)光，用耦合光柵將激勵(lì)光耦合到平面波導(dǎo)內(nèi)，使光渡越波導(dǎo)層，于是，使具有發(fā)光性質(zhì)的物質(zhì)受到激勵(lì)，在波導(dǎo)層的短暫場內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光，該方法包括利用厚度小于激勵(lì)輻射波長λ的波導(dǎo)層，該波導(dǎo)層由在激勵(lì)輻射波長時(shí)的其折射率≥1.8的材料組成，并用與第一耦合光柵空間上分開的第二耦合光柵從波導(dǎo)層耦合出，并探測反向耦合到波導(dǎo)層(b)內(nèi)的發(fā)光輻射。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是，該方法包括利用具有厚度小于λ/2的波導(dǎo)層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是，波導(dǎo)層的厚度是40-160nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是，光柵的調(diào)制深度是3-60nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征是，在不同于發(fā)光輻射的角度下耦合出激勵(lì)輻射。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征是，在反向把激勵(lì)輻射耦合到波導(dǎo)內(nèi)，在正向把由波導(dǎo)傳輸?shù)募?lì)光和在波導(dǎo)內(nèi)傳送的發(fā)光耦合出。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其特征是，在約1至-50°的角度范圍內(nèi)將激勵(lì)輻射耦合到波導(dǎo)內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其特征是，反向耦合到波導(dǎo)中的發(fā)光輻射在近似于1-50°的角度范圍內(nèi)被耦合出來。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征是，基底的發(fā)光受到抑制。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其特征是，使用基本上平行的光激勵(lì)發(fā)光。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其特征是，用于探測被分析物的能發(fā)光的物質(zhì)被直接固定在波導(dǎo)層的表面上。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其特征是，該方法包括，將作為用于被分析物自身或者結(jié)合配偶體中的一種的化學(xué)或生化探測物的特殊結(jié)合配偶體固定在多步檢測中的傳感器平臺的表面上，在這個(gè)過程中，在其中一個(gè)分步驟中被分析物受到結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其特征是，同時(shí)測定輻射激勵(lì)光的吸收。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其特征是，激勵(lì)光以連續(xù)波(CW)的方式被耦合到波導(dǎo)中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其特征是，包括以計(jì)時(shí)脈沖形式輸入耦合激勵(lì)光，并探測時(shí)間分辨的發(fā)光。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征是，脈沖長度調(diào)節(jié)到1皮秒-100秒之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其特征是，在一個(gè)或多個(gè)頻率輸入耦合具有調(diào)制的強(qiáng)度的激勵(lì)光，并探測試樣發(fā)光的最終相移和調(diào)制。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，其特征是，欲探測的試樣是，蛋黃，血液，血清，血漿或尿液。
19.根據(jù)權(quán)利要求l-18中任一項(xiàng)的方法，其特征是，欲探測的試樣是，表面水，土壤或植物提取物， 生物工藝發(fā)酵液或合成發(fā)酵液。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)方法的應(yīng)用，該方法用于在親和性測試中定量測定生化物質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)方法的應(yīng)用，其特征是，定量測定抗體或抗原。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-119的任一項(xiàng)方法的應(yīng)用，用于定量測定受體或配體，低核苷酸，DNA或RNA鏈，DNA或RNA類似物，酶，酶基質(zhì)，酶輔因子或抑制劑，外源凝集素和碳水化合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法的應(yīng)用，用于選擇性地定量測定光學(xué)混濁液中的發(fā)光成分。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法測定發(fā)光輻射用的光學(xué)傳感器平臺(1)，其特征是，該平臺基本上包括，一個(gè)平面光學(xué)透明的基底(5)，在基底上加上一層薄的波導(dǎo)層(4)，所述的傳感器平臺(1)設(shè)置用于輸入耦合激勵(lì)輻射的耦合光柵(2)，基底的折射率小于波導(dǎo)層(4)的折射率，其中所述波導(dǎo)層(4)的厚度小于激勵(lì)輻射的波長λ，所述的波導(dǎo)層(4)由在激勵(lì)光波長時(shí)折射率為＞1.8的材料組成，和傳感器平臺(1)，包括一個(gè)與第一耦合光柵(2)在空間上分開的第二耦合光柵(3)，用于把反向耦合到波導(dǎo)層內(nèi)的熒光耦合出。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的傳感器平臺，其特征是，波導(dǎo)層(4)的厚度上于λ/2。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的傳感器平臺，其特征是，波導(dǎo)層(4)的厚度為40-160nm。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的傳感器平臺，其特征是，光柵的調(diào)制深度為3-60nm。
28.根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)的傳感器平臺，其特征是，用于輸入耦合激勵(lì)輻射的第一耦合光柵(2)的光柵常數(shù)不同于用于耦合出發(fā)光輻射的第二耦合光柵(3)的光柵常數(shù)。
29.根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)的傳感器平臺，其特征是，光柵距離是B≤′X1/e，其中，X1/e是入射輻射的強(qiáng)度I0下降到Io/e時(shí)的長度。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的傳感器平臺，其特征是，光柵距離是B≥0.2·X1/e。
31.根據(jù)權(quán)利要求24-30中任一項(xiàng)的傳感器平臺，其特征是，用于抑制基底發(fā)光的低折射率的中間層設(shè)置在基底(5)和波導(dǎo)層(4)之間。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的傳感器平臺，其特征是，低折射率的中間層基本上由SiO2或SiOxCYHz組成。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的傳感器平臺，其特征是，中間層的厚度是≤1000nm。
34.根據(jù)權(quán)利要求24-33中任一項(xiàng)的傳感器平臺，其特征是，采用有機(jī)微結(jié)構(gòu)的基底。
35.根據(jù)權(quán)利要求24-34中任一項(xiàng)的傳感器平臺，其特征是，采用具有微結(jié)構(gòu)有機(jī)涂層的有機(jī)基底。
36.根據(jù)權(quán)利要求22-35中任一項(xiàng)的傳感器平臺，其特征是，平面透明波導(dǎo)層(4)是由Ta2O5或TiO2組成。
37.根據(jù)權(quán)利要求24-36中任一項(xiàng)的傳感器平臺，其特征是，在波導(dǎo)層(4)和試樣之間存在粘合促進(jìn)層。38.根據(jù)權(quán)利要求37的傳感器平臺，其特征是，粘合促進(jìn)層厚度為≤50nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用平面介電光學(xué)傳感器平臺測定發(fā)光的方法，該平臺由其上施加了一層透明波導(dǎo)層(b)的透明基底(a)組成，傳感器平臺設(shè)有一個(gè)耦合光柵，用于激勵(lì)光的輸入耦合，所述基底(a)的折射率低于波導(dǎo)層(b)的折射率，使液體樣品作為上層與層(b)相接觸，用光電方法測量樣品中具有發(fā)光特性的物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)光，或固定在層(b)上具有發(fā)光特性的物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)光。本發(fā)明還涉及本方法在定量親和性測試中的應(yīng)用，以及將其使用于定量測定光學(xué)混濁液中發(fā)光成分，以及實(shí)施所述方法用的傳感器平臺。
文檔編號G01N21/77GK1149336SQ95193305
公開日1997年5月7日 申請日期1995年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月27日
發(fā)明者B·達(dá)尼爾茲克, G·L·杜維耐克, M·赫明格, D·尼沙夫爾, J·塞格納 申請人:希巴-蓋吉股份公司