專利名稱：一種親和層析材料及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域。
茨菇抑制劑為新鮮茨茹中提取的兩種多功能結(jié)晶蛋白酶抑制劑A和B的混合物，這兩種蛋白酶抑制活性上略有不同，例如抑制劑A對(duì)糜蛋白酶和激肽釋放酶親和性較強(qiáng)而抑制B對(duì)胰白酶親和性較強(qiáng)?？梢?jiàn)，怎樣利用茨茹抑制劑更好地去除蛋白質(zhì)中蛋白酶和激肽釋放酶，是目前該領(lǐng)域仍需解決的課題。
本發(fā)明的目的在于提供一種茨茹抑制劑一載體制備的親和層析材料該層析材料的制備方法，以及采用該層折材料去除蛋白質(zhì)中蛋白酶、激肽釋放酶的方法。
本發(fā)明滿足下列結(jié)構(gòu)要求R＿茨菇抑制劑這里R代表一種不溶于水的基質(zhì)材料，包括各種類型的瓊糖。
本發(fā)明中親和材料的制備如下1、茨茹抑制劑的制備取新鮮茨菇塊莖，去除外皮洗凈、切碎、加少許去離子水勻漿，用200目濾布過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭咳ルx子水?dāng)嚢?，浸泡過(guò)濾。和并濾液，調(diào)節(jié)PH至3.8～4.0。棄去沉淀，取上清加硫酸銨至飽和度為50％，沉淀蛋白、質(zhì)棄上清，沉淀加水溶解用去離子水透析除鹽，完畢后置65～75℃水浴中熱變性5分鐘，離心去除沉淀，上清調(diào)PH至7.0，用0.015M磷酸緩沖溶液透析。
取二乙基氨基乙基纖維素(DEAE-cellulose)凝膠裝栓，先用0.015mol/L(PH7.8)磷酸緩沖溶液平衡，將上述溶液從柱上端加入，用0.05mol/L(PH7.8)磷酸緩沖溶液沖洗柱床，然后用0.012mol/L(PH7.8)磷酸緩沖溶液洗脫，收集蛋白質(zhì)抑制劑洗脫峰，將洗脫峰用飽和硫酸銨透銨透析至沉淀不再增加，離心收集沉淀。加水溶解，用去離子水透析除鹽，冷凍干燥后即得。
2、茨菇抑制劑與載體交聯(lián)任何適合的不溶于水的基質(zhì)材料均可作為載體材料，例如瓊脂糖凝膠(包括瓊脂糖2B、瓊脂糖4B、瓊脂糖6B和二乙基氨基瓊脂糖)，將載體事先用溴化氰或其他激活劑活化，加入適量的茨菇抑制劑，在1～30℃條件下反應(yīng)，在適合的緩沖溶液中放置12小時(shí)以上。茨菇抑制劑時(shí)即可充分與載體材料交聯(lián)。
本發(fā)明的親和層析材料的應(yīng)用茨菇抑制劑為兩種多功能結(jié)晶蛋白酶抑制劑A和B的混合物，這兩種蛋白酶抑制劑在抑制活性上略有不同，采用這種親和層析材料在適合的PH條件下可用于除去蛋白質(zhì)中所含的蛋白酶和激肽釋放酶。
取約1000ml沉降體積的瓊脂糖2B(Sephrose 2B，Pharmacia公司產(chǎn)品)用沙芯漏斗抽濾成半干物，用0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌至中性。按每10ml沉降體積的瓊脂糖2B與2g溴化氰的比例，稱取溴化氰的研缽中碾磨，溶于0.1mol/L碳酸氫的溶液中。
將瓊脂糖珠與溴化氰溶液的冰浴中混和攪拌，并滴加2mol/L氫氧化鈉溶液，使pH保持在11.0～11.5之間，10分鐘后移至室溫放置10分鐘。將混和液倒入布氏漏斗，并立即用0.1mol/L碳酸氫鈉(pH9.5)緩沖溶液抽洗，在2～3分鐘內(nèi)洗下相當(dāng)于瓊脂糖珠10～15倍體積的緩沖溶液，終止活化。
按每1ml活化的凝膠可交聯(lián)2.25mg的茨菇抑制劑計(jì)算，加入已調(diào)pH至9.5的茨菇抑制劑水溶液在4℃條件下緩慢攪拌2小時(shí)至少放置12小時(shí)。用約20倍體積的0.1mol/L碳酸氫鈉(pH9.5)緩沖溶液洗滌已交聯(lián)的瓊脂糖珠，洗去未結(jié)合的蛋白。用0.1mol/L鹽酸—甘氨酸緩沖溶液(pH2.4)洗去非特異性吸附蛋白。再用0.2mol/L甘氨酸緩沖溶液(pH8.5)封閉瓊脂糖珠上與蛋白結(jié)合的活性基團(tuán)，置4℃緩慢攪拌20小時(shí)再用0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷—鹽酸液(pH7.5)抽洗，即制得茨菇抑制劑-瓊脂糖交聯(lián)復(fù)合物。加20％乙醇置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施實(shí)例II重復(fù)實(shí)施例I，用瓊脂糖4B(Sephrose 4B，Pharmacia公司產(chǎn)品代替瓊脂糖2B同樣操作，制得茨菇抑制劑—瓊脂糖4B交聯(lián)復(fù)合物。
實(shí)施實(shí)例III重復(fù)實(shí)施例I，用瓊脂糖6B(Sephrose 6B，Pharmacia公司產(chǎn)品)代替瓊脂糖2B同樣操作，制得茨菇抑制劑—瓊脂糖6B交聯(lián)復(fù)合物。
實(shí)施實(shí)例IV重復(fù)實(shí)施例I，用二乙基氨基乙基瓊脂糖(DEAE-Sephrose，Pharmacia公司產(chǎn)品)代替瓊脂糖2B同樣操作，制得茨菇抑制劑—二乙基氨基乙基瓊脂糖交聯(lián)復(fù)合物。
實(shí)施實(shí)例V1.柱層析取采用以上實(shí)施實(shí)例方法制備的親和層析材料各1000ml，裝柱。事先用0.1mol/L(pH8.0)的磷酸緩沖溶液(含0.2mol/L的氯化鈉)作為平衡液沖洗柱床至流出液電導(dǎo)與平衡液電導(dǎo)一致。另取尿激酶(比活力50000IU/mg)制成濃度為100000IU/ml的溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0。每次上樣1000ml，上樣完畢后，用1000ml的平衡液沖洗柱床，蛋白酶和激肽釋放酶被親和層析柱吸附，尿激酶則隨溶液流出。層析柱可用0.1mol/L(pH4.0)醋酸鈉緩沖溶液再生重復(fù)使用。
2.蛋白酶和激肽釋放酶的測(cè)定(1)激肽釋放酶的測(cè)定方法采用發(fā)色底物S-2266測(cè)定法[入江章子等，臨床藥理(日本)29，419，(1981)]。
取0.2mol/L(pH8.0)三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液500ul，37℃保溫5～10分鐘，再加入檢品溶液400ul，混合37℃保溫2～5分鐘后加底物溶液100ul[25mgS-2266(日本第一化學(xué)制藥株式會(huì)社產(chǎn)品)加28.8ml的蒸餾水溶解)混合37℃保溫30分鐘在加50％醋酸溶液終止反應(yīng)。另取500ul的含抑肽酶10000～50000IU/L的0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(pH8.0)代替0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(pH8.0)同樣操作，作為空白對(duì)照在濾長(zhǎng)405nm處測(cè)定吸收度(A)，按下式計(jì)算激肽釋放酶的含量
激肽釋放酶的含量(mU/ml)＝A×9.55(2)蛋白酶的測(cè)定方法酪蛋白分解活力測(cè)定法。
取1.0ml檢品溶液加1.0ml的1％酪蛋白溶液混勻37℃保溫1小時(shí)后，加入50％的三氯醋酸混勻沉淀未水解的蛋白質(zhì)，3000rpm離心5分鐘，棄去沉淀。另取1.0ml經(jīng)100℃煮沸2～3分鐘的檢品溶液代替上述檢品溶液同樣操作，作為空白在280nm處測(cè)定吸收度(B)作為蛋白酶的活力(O.D.280/ml)。
(3)按上述方法測(cè)定尿激酶經(jīng)親和層析前后溶液中激肽釋放酶和蛋白酶的含量(處理前激肽釋放酶2.1mU/ml，蛋白酶0.243O.D.280/ml)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表一表一親和層析柱 樣品處理后殘存率(％)激肽釋放酶 蛋白酶激肽釋放酶 蛋白酶(mU/ml) (O.D.280/ml)M-Spherose 2B 0.0292 0.040 1.4 16.5M-Spherose 4B 0.0181 0.044 0.86 18.1M-Spherose 6B 0.0240 0.035 1.1 14.4M-DEAE-Spherose 0.0070 0.009 0.33 3.7M代表茨菇抑制劑實(shí)施實(shí)例VI重復(fù)實(shí)施實(shí)例V，用尿胰蛋白酶抑制劑(比活力2500U/mg，含激肽釋放酶10.5mU/ml，蛋白酶0.2300.D.280/ml)代替尿激酶制成濃度為50000U/ml的溶液，同樣操作，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表二表二親和層析柱 樣品處理后殘存率(％)激肽釋放酶 蛋白酶激肽釋放酶 蛋白酶(mU/ml) (O.D.280/ml)M-Spherose 2B0.0227 0.0450.22 19.8M-Spherose 4B0.0137 0.0260.13 11.3M-Spherose 6B0.0121 0.0320.12 13.9M-DEAE-Spherose 0.0068 0.0140.06 6.1M代表茨菇抑制劑
權(quán)利要求
1.一種親和層析材料，其特征在于其滿足下列結(jié)構(gòu)要求R＿茨菇抑制劑R代表一種不溶于水的基質(zhì)材料，包括各種類型的瓊糖。
2.一種親和層析材料的制備方法，其特征在于首先將不溶于水的基質(zhì)材料R用溴化氰或其他激活劑活化，加入適量茨菇抑制劑，在1～30℃條件下反應(yīng)，在適合的緩沖溶液中放置12小時(shí)以上，茨菇抑制劑即可充分與載體R交聯(lián)。
3.一種親和層析材料的應(yīng)用，特征在于該材料在適合的PH條件下去除蛋白質(zhì)中所含的蛋白酶和激肽釋放酶。
全文摘要
一種親和層析材料，滿足下列結(jié)構(gòu)要求R-茨菇抑制劑，特定載體R采用不溶于水的基質(zhì)材料，如各類瓊脂糖，在一定條件下與茨菇抑制劑交聯(lián)，制備一種親和層析材料，從而利用該層析材料去除蛋白質(zhì)中蛋白酶、激肽釋放酶。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1141212SQ9511425
公開(kāi)日1997年1月29日 申請(qǐng)日期1995年12月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月4日
發(fā)明者傅和亮, 謝永立, 何欄, 巫錦娣, 鄭少亮 申請(qǐng)人:廣州市博普生物技術(shù)有限公司, 廣東天普生物化學(xué)制藥有限公司