專(zhuān)利名稱(chēng):確定包括uva和uvb輻射的積分防曬指數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及確定包括UVA和UVB輻射的積分防曬指數(shù)(∫SPF或iSPF)的方法，該積分防曬指數(shù)可用于對(duì)美容型防曬劑和治皮膚病型防曬劑分類(lèi)。
背景技術(shù)：
眾所周知UV輻射大大增加了皮膚中自由基的產(chǎn)生。產(chǎn)生了活性氧簇，如羥自由基*OH-、超氧陰離子自由基O2-和單線態(tài)分子氧1O2，它們反過(guò)來(lái)會(huì)使得形成脂自由基L*。因此，美容型防曬制劑和治皮膚病型防曬制劑含有UV過(guò)濾物質(zhì)，另外還含有少量抗氧化劑。
另外，從第22屆世界化妝品化學(xué)家學(xué)會(huì)聯(lián)盟學(xué)術(shù)研討會(huì)(Edinburgh 2002，Oral Papers，Vol.2，Zastrow et al.)會(huì)議出版物以及其它出版物可知通過(guò)電子自旋共振(ESR)成像已確定UVA和UVB射線可穿透到皮膚的不同深度。波長(zhǎng)介于290nm到320nm之間的UVB射線僅能穿透最高達(dá)約50μm的深度，而UVA輻射可到達(dá)下面的真皮層，即約3mm。
自由基的壽命介于0.3ns(*OH自由基)和幾秒(L*自由基)之間，它在下層皮膚主要因?yàn)樵谔?yáng)光譜UVA范圍內(nèi)的輻射而產(chǎn)生，其出現(xiàn)可通過(guò)諸如DMPO(5’5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物，5，5′-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)或PBN(苯基叔丁硝酮，phenyl-tert-butylnitrone)的旋轉(zhuǎn)陷阱和ESR法測(cè)量。
通?？傻玫降姆罆駝┩ǔＦ錁?biāo)簽上的防曬指數(shù)(SPF)或防光照指數(shù)(“l(fā)ichtschutzfaktoren”-LSF)介于2到100之間，優(yōu)選4到50之間。包含在此的信息是基于使用者認(rèn)識(shí)到他們可在較長(zhǎng)一段時(shí)間(即出現(xiàn)紅斑(曬傷)所需要的時(shí)間乘上各自的指數(shù)，以分鐘計(jì))內(nèi)將其皮膚暴露于太陽(yáng)輻射。根據(jù)發(fā)明人自己的發(fā)現(xiàn)，皮膚變紅與自由基的出現(xiàn)不存在線性相關(guān)，并且皮膚變紅通常被認(rèn)為是由于一定劑量的UV輻射所產(chǎn)生的炎癥(紅斑)。另外，防曬劑含有不同量的UVA和/或UVB過(guò)濾劑，因此在大多數(shù)情況下不能針對(duì)自由基提供可適度變化的并且不可量化的保護(hù)。時(shí)下的SPF/LSF僅與UVB的效果相關(guān)，似乎不再適合正確表示防曬劑的防護(hù)效果。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供確定積分防曬指數(shù)的方法，該積分防曬指數(shù)包括UVA和UVB輻射對(duì)皮膚表面和深層皮膚的全部影響，并能作為使用者的正確指導(dǎo)值。
根據(jù)本發(fā)明，確定包括UVA和UVB輻射的美容型防曬劑和治皮膚病型防曬劑的積分防曬指數(shù)(∫SPF)的方法包括如下步驟(a)將一定量的防曬劑直接施用于一定面積的皮膚基質(zhì)，該皮膚基質(zhì)事先已充滿(mǎn)了起旋轉(zhuǎn)陷阱作用的已知物質(zhì)；(b)通過(guò)輻射源如太陽(yáng)刺激器將皮膚基質(zhì)暴露于一定量的輻射，該輻射包括自然太陽(yáng)暴露條件下的UVA和UVB射線；(c)暴露后1-120分鐘內(nèi)將暴露于輻射的皮膚基質(zhì)進(jìn)行電子自旋共振(ESR)測(cè)量；(d)與自由基數(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)樣本相比較后將自由基形成值RG標(biāo)準(zhǔn)化，并以實(shí)際數(shù)目X×1012/1mg樣本的形式記錄所捕獲到的自由基數(shù)，RG＝X×1012自由基/mg皮膚樣本；(e)并根據(jù)公式(1)確定積分防曬指數(shù)∫SPF∫SPE=E0E---(1)]]>其中E0為提供給使用了防曬產(chǎn)品的皮膚樣本的UV劑量的平均值(mJ/cm2)，用公式(7)進(jìn)行計(jì)算E0＝I·t (7)I＝太陽(yáng)刺激器輻照度(mW/cm2)t＝暴露時(shí)間(秒)。
并且E為有效UV劑量的平均值(mJ/cm2)，因此與步驟(b)中形成的自由基的檢測(cè)量相關(guān)并且其中根據(jù)步驟(d)中的自由基形成值的實(shí)際數(shù)目X與公式(2)計(jì)算E
log10(E)＝a·log10(X·1000)+b (2)其中a和b為在校正步驟中所確定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，以獲得UV劑量以10為底的對(duì)數(shù)函數(shù)與通過(guò)平方誤差估算法獲得的自由基形成的實(shí)際數(shù)目的以10為底的對(duì)數(shù)函數(shù)之間正確的線性關(guān)系。
并且根據(jù)公式(8)計(jì)算EE＝10log10(E)(8)。
上述步驟(a)中的一定量的防曬劑為例如1-4mg/cm2皮膚表面的量，優(yōu)選2mg/cm2。所使用的皮膚樣本從例如活檢皮膚、皮膚基質(zhì)(人造皮膚)或豬皮中獲得，豬皮優(yōu)選來(lái)自體外處理的豬耳的皮膚塊。上述皮膚樣本在下文中被稱(chēng)為“皮膚基質(zhì)”或“基質(zhì)”。防曬劑直接施用于基質(zhì)表面。
首先，例如通過(guò)孵育樣本將旋轉(zhuǎn)陷阱特別是PBN施用于基質(zhì)上以形成穩(wěn)定的、可長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)的加合物。
使用旋轉(zhuǎn)陷阱技術(shù)研究活檢皮膚暴露到光線時(shí)形成的自由基/ROS(ROS＝活性氧簇)。該技術(shù)一般涉及將具有活性、壽命較短的自由基加成至反磁“旋轉(zhuǎn)陷阱”的雙鍵以形成穩(wěn)定得多的自由基“自由基加合物”。通過(guò)形成可通過(guò)ESR技術(shù)測(cè)量的旋轉(zhuǎn)陷阱加合物(其壽命為幾分鐘-幾小時(shí))，旋轉(zhuǎn)陷阱的使用延長(zhǎng)了甚至活性最強(qiáng)的自由基/ROS的壽命(10-9s-10-3s)，如羥自由基(OH-)、超氧陰離子自由基(O2-)和脂自由基(L*)。優(yōu)選的旋轉(zhuǎn)陷阱是PBN(苯基叔丁硝酮)，它可在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)(約60分鐘)內(nèi)提供極為穩(wěn)定的ESR信號(hào)，因此特別適合對(duì)暴露于不同UV劑量后皮膚中所形成的自由基進(jìn)行定量。該試劑購(gòu)自Sigma Munich Germany。與PBN的反應(yīng)如下進(jìn)行 在UV輻照前用旋轉(zhuǎn)陷阱溶液灌注基質(zhì)如30分鐘。旋轉(zhuǎn)陷阱PBN溶于如水/乙醇(50/50)溶液，得到的濃度為400mM。
然后，基質(zhì)表面用如水/乙醇沖洗并干燥，并在較短一段休息期后將預(yù)定量如2mg/cm2的防曬劑直接涂抹在基質(zhì)上。
將基質(zhì)靜置5-60分鐘，優(yōu)選10-15分鐘，并且優(yōu)選地，根據(jù)步驟(b)將從基質(zhì)上取出的一塊皮膚暴露于來(lái)自太陽(yáng)刺激器的輻射，UVA范圍為17.53mW/cm2，UVB范圍為0.37mW/cm2。上述參數(shù)基本符合自然的太陽(yáng)暴露條件。1-120分鐘后通過(guò)ESR光譜法進(jìn)行測(cè)量。
與光學(xué)法如熒光法或化學(xué)發(fā)光法相比較，ESR光譜法的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)在于所使用的電磁波在生物組織中的穿透深度。ESR波長(zhǎng)約為其它技術(shù)的105倍，這使得它在人組織中的穿透深度約為10mm。對(duì)直到真皮下層的全部皮膚研究可不受到干擾。該測(cè)量范圍在檢測(cè)甚至在全部皮膚最深層的UV輻射的效果非常有意義。這個(gè)性質(zhì)決定了ESR光譜法可用于防曬指數(shù)的評(píng)估。但是，若沒(méi)有旋轉(zhuǎn)陷阱，從ESR信號(hào)強(qiáng)度直接計(jì)算可使得防曬指數(shù)被低估。
暴露于輻射與測(cè)量之間的時(shí)間取決于旋轉(zhuǎn)陷阱和自由基所形成的加合物的有限壽命。優(yōu)選地，它為1-90分鐘。
旋轉(zhuǎn)陷阱PBN的優(yōu)點(diǎn)在于加合物的高度穩(wěn)定性，這使得可進(jìn)行定量分析；以及較高的信號(hào)反應(yīng)，這是由于其在不同類(lèi)型的被捕獲自由基如以羥基或碳原子為中心的自由基之間沒(méi)有選擇性。所有被捕獲的自由基的信號(hào)形狀相同，并獲得了較高的峰強(qiáng)度。
通過(guò)PBN加合物的峰峰信號(hào)振幅(低場(chǎng)峰)對(duì)所形成的自由基進(jìn)行定量。以自由基數(shù)已知的校正樣本(標(biāo)準(zhǔn)品)的振幅對(duì)信號(hào)振幅進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該標(biāo)準(zhǔn)化是計(jì)算RG值(自由基形成值＝RGV)的基礎(chǔ)。RGV描述了被捕獲的自由基數(shù)，以實(shí)際數(shù)目X×1012(標(biāo)準(zhǔn)化為1mg被測(cè)樣本(皮膚))的形式表示，意味著體積單元為1mm·1mm·1mm，并假設(shè)人的皮膚密度為1、厚度約為1mm。
通過(guò)在發(fā)射一定量輻射的輻射源和皮膚基質(zhì)之間放置減少輻射的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾器，可模仿用于評(píng)估和校正本發(fā)明的方法的防曬劑的不同濃度。
所使用的優(yōu)選的減少輻射的過(guò)濾器為衰減因子為1、2、5、10和20的中性密度濾光片(Lot Oriel，F(xiàn)rance)。中性密度濾光片由熔融二氧化硅基質(zhì)構(gòu)成，在其中可實(shí)現(xiàn)薄層金屬的真空沉積。包被厚度決定了光密度。吸光度幾乎與UV波段的波長(zhǎng)(290-400nm)無(wú)關(guān)，并且與美容標(biāo)準(zhǔn)品的正確使用模式無(wú)關(guān)。
所有已知防曬劑(UV過(guò)濾劑)均可用本方法測(cè)量，例如4-氨基苯甲酸衍生物、肉桂酸酯(ester of cinnamatic acid)、亞芐基樟腦衍生物、二苯酮衍生物、甲氧苯甲酰甲烷衍生物等。這些防曬劑含有如二苯酮-3、二苯酮-4、甲氧基肉桂酸辛酯、胡莫柳酯(homosalate)、苯基苯并咪唑磺酸、甲氧基肉桂酸乙基己酯、對(duì)甲氧基肉桂酸異戊酯、乙基己基三嗪酮、二乙基己基丁胺三嗪酮(Diethylhexyl ButamidoTriazone)、4-甲基亞芐基樟腦、PABA、乙基己基二甲基PABA等。同樣，物理過(guò)濾劑如TiO2、ZnO、ZrO2等也可得以檢測(cè)。例如，下列UV過(guò)濾劑(有縮寫(xiě)形式)可根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。
ES＝水楊酸乙基己酯；OC＝氰雙苯丙烯酸辛酯；IMC＝對(duì)甲氧基肉桂酸異戊酯；BMDBM＝丁基甲氧基二苯甲酰甲烷；MBBT＝亞甲基-雙-苯并三唑基四甲基丁基苯酚(以50％水分散系形式提供)。后者的商品名為“Tinosorb M”。BEMT＝雙乙基己氧基苯酚甲氧基苯三嗪。后者的商品名為“Tinosorb S”。
不同防曬劑的UV吸收光譜可使用LabsphereUV 1000 S透射分析儀，通過(guò)光譜法(Cosmetics and Toiletries，Vol.118，n°10，October2003)實(shí)現(xiàn)。將防曬劑樣本以1.2mg cm-2涂抹在透明的粗糙化的PMMA盤(pán)上。根據(jù)COLIPA防曬指數(shù)測(cè)試方法(SPF測(cè)試方法。Colipa參考號(hào)94/289(1994))測(cè)定體內(nèi)SPF。使用持續(xù)性色素沉淀指數(shù)(PPD)作為終點(diǎn)(end point)測(cè)定體內(nèi)UVA防曬指數(shù)(Photodermatol.Photoimmcrnol.Photomed.16，245-249(2000)。
本發(fā)明的方法最先考慮到與全部UV作用相關(guān)的任何皮膚損害的原因在于所產(chǎn)生的自由基的總數(shù)。該數(shù)取決于全部UV劑量而非UV射線強(qiáng)度。所產(chǎn)生的自由基的總數(shù)可使用ESR準(zhǔn)確測(cè)量，并確定積分SPF，這提供使用者免受UV輻射的實(shí)際程度方面的正確信息。
該SPF在兩種意義上被積分它包括全部UV光譜以及達(dá)到皮膚能被UV輻射損害的整個(gè)深度。
另一優(yōu)點(diǎn)在于使用2到4塊皮瓣(每塊測(cè)得為1cm2)可測(cè)量iSPF(ISPF或∫SPF)，并且可靠性相同甚至有所提高，該iSPF可從人的皮膚外科手術(shù)或皮膚基質(zhì)(人造皮膚)或者直接在豬皮上獲得，無(wú)需在將待測(cè)人暴露到倫理上受到質(zhì)疑的輻射后測(cè)量其皮膚的紅斑的出現(xiàn)情況。這樣，不再存在由于輻射引起的對(duì)待測(cè)的人的皮膚的損害，因?yàn)樾碌臏y(cè)量方法根本不需要待測(cè)的人。根據(jù)COLIPA標(biāo)準(zhǔn)方法，需要10-20位志愿者。另外，避免了獲得結(jié)果前較長(zhǎng)的等待時(shí)間的后果，并且無(wú)須定義在已知方法中作為用于評(píng)估的參照物的某些標(biāo)準(zhǔn)品。
從設(shè)備以及方法上來(lái)看，新方法大大降低了費(fèi)用，這是由于現(xiàn)在的RGV測(cè)量方法僅需要確定SPF的常規(guī)方法所需要的費(fèi)用的一半或三分之一。
另外，iSPF(ISPF或∫SPF)可被測(cè)量和計(jì)算，準(zhǔn)確度約為±10％，而常規(guī)SPF測(cè)量方法如COLIPA(UVB防護(hù))的準(zhǔn)確度只有±20-25％，在不同的檢測(cè)機(jī)構(gòu)所測(cè)得的較高SPF的準(zhǔn)確度甚至為30-50％。
現(xiàn)有的PPD方法相當(dāng)復(fù)雜，并且在用于黑色皮膚類(lèi)型時(shí)相當(dāng)不準(zhǔn)確，即這方面的改進(jìn)將拓寬現(xiàn)有方法的范圍，并且會(huì)得到更為可靠的結(jié)果。本發(fā)明的方法不依賴(lài)于皮膚類(lèi)型，并且不依賴(lài)于種族皮膚的顏色。
本發(fā)明的方法的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于僅需要不太復(fù)雜的設(shè)備。用于將較大的皮膚表面暴露于UV輻射的大表面照明系統(tǒng)可用較小的、更有效的點(diǎn)狀輻射單元代替。
使用校準(zhǔn)的電子自旋共振(ESR)X波段分光光度計(jì)，采用ESR對(duì)在UV輻射活檢皮膚時(shí)所形成的自由基進(jìn)行檢測(cè)。分光光度計(jì)為ERS 300+(ZWG Germany，并由Galenus Germany改進(jìn))，使用如下分光光度計(jì)設(shè)置微波頻率f0＝9.52GHz，微波功率Pμ＝20mW，調(diào)制頻率fm＝100kHz，調(diào)制幅度Bm＝0.2mT，磁場(chǎng)掃描ΔBs＝20mT，掃描時(shí)間ts＝60s。
可能有用的還有如下分光光度計(jì)設(shè)置微波功率Pμ＝10-100mW，調(diào)制幅度Bm＝0.05-0.5mT，磁場(chǎng)掃描ΔBs＝5-20mT，掃描時(shí)間ts＝10-120s。
待測(cè)美容制品或藥物制品也可摻入本領(lǐng)域已知的所有抗氧化劑分子或自由基清除分子。這些物質(zhì)包括維生素，如維生素C及其衍生物，如抗壞血酸乙酸酯、抗壞血酸磷酸酯和抗壞血酸棕櫚酸酯；維生素A及其衍生物；葉酸及其衍生物；維生素E及其衍生物，如醋酸維生素E；超氧化物歧化酶；黃酮或類(lèi)黃酮；氨基酸，如組氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸，及其衍生物；類(lèi)胡蘿卜素和胡蘿卜素，如α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素；尿酸及其衍生物；α-羥基酸，如檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸；均二苯代乙烯及其衍生物等。
待測(cè)制劑的更優(yōu)選的抗氧化劑是一種具有高自由基防曬指數(shù)的活性物質(zhì)，該活性物質(zhì)含有對(duì)破斧盾籽木(Quebracho Blanco)的樹(shù)皮進(jìn)行提取并進(jìn)行一系列酶解所獲得的產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有以重量計(jì)至少90％的原花色素寡聚物和以重量計(jì)最高10％的沒(méi)食子酸，并且與微囊連接；該活性物質(zhì)還含有通過(guò)提取獲得的蠶的提取物，該提取物含有殺菌肽、氨基酸和維生素混合物；還含有非離子、陽(yáng)離子或陰離子水凝膠或水凝膠的混合物；還含有一種或幾種磷脂以及水。復(fù)合物(complex)制劑中還含有酵母的超聲裂解產(chǎn)物，該裂解產(chǎn)物含有至少150單位超氧化物歧化酶/ml，以及一種或多種環(huán)糊精。復(fù)合物制劑可為WO99/66881實(shí)施例1或2、或WO 01/26617實(shí)施例1中的產(chǎn)物。優(yōu)選還有醇溶液中的植物提取物的活性復(fù)合物作為抗氧化劑。該復(fù)合物含有以重量計(jì)0.1-2％的綠色咖啡豆提取物、以重量計(jì)0.1-2％的茶(Camellia sinensis)的葉提取物、以重量計(jì)0.1-2％的水黃皮(Pongamia pinnata)提取物以及以重量計(jì)0.1-2％的歐白芷(Angelicaarchangelica)的根部提取物，并用一種C2-C5單價(jià)醇補(bǔ)足100％。
本發(fā)明將在下列實(shí)施例中詳細(xì)描述。附圖為圖1防曬指數(shù)測(cè)定的示意圖圖2 RG數(shù)據(jù)(X×1012，來(lái)自表1)對(duì)UV劑量圖3 log(UV劑量)和log(自由基形成)的線性關(guān)系，根據(jù)圖2的數(shù)據(jù)圖4防曬劑E、N、G和H的UV光譜具體實(shí)施方式
UV劑量和自由基形成(RG)之間的關(guān)系通過(guò)使用未過(guò)濾的UV源(衰減因子1)和衰減因子為2、5、10和20的中性密度濾光片過(guò)濾的UV源實(shí)現(xiàn)了對(duì)活檢皮膚提供不同輻照強(qiáng)度。它們被放置在UV源和活檢皮膚之間，恰好在樣本支持器的開(kāi)口處。中性密度濾光片以相同因子衰減了所有波長(zhǎng)的射線。使用了五個(gè)不同輻照時(shí)間30、60、150、300和600秒。就非衰減UV源而言，這對(duì)應(yīng)于自然太陽(yáng)暴露的約1.7、3.5、8.7、17.4和34.8分鐘。這同樣對(duì)應(yīng)于0.11、0.21、0.54、1.07和2.14 MED。
首先檢查是否遵守反比定律。這意在表明所形成的自由基水平僅依賴(lài)于劑量，而非使用時(shí)間。這是另一計(jì)算真實(shí)的防曬指數(shù)的先決條件。
選擇輻照時(shí)間以獲得與中性密度濾光片衰減度相關(guān)的劑量級(jí)數(shù)(Progression)。例如，采用較衰減度1分析(t＝30秒)長(zhǎng)2倍的暴露時(shí)間(t＝60秒)可實(shí)現(xiàn)衰減度2分析。因此，可使用不同輻照時(shí)間提供相同的UV劑量。
這在表1中示出，其中報(bào)道了根據(jù)不同的暴露時(shí)間以及不同的光衰減度，由UV引起的自由基的測(cè)得量(RG＝X×1012自由基/mg)。通過(guò)公式(6)計(jì)算UV劑量(mJ/cm2)(未在表1示出) I＝太陽(yáng)刺激器輻照度(mW/cm2)；t＝暴露時(shí)間(s)；Att＝中性密度濾光片衰減度根據(jù)五次輻照時(shí)間30、60、150、300和600秒，以及五種衰減因子1、2、5、10和20，沿著表1的對(duì)角線(從左上角到右下角)可獲得恒定UV劑量(537mJ/cm2)。若反比定律是有效的，應(yīng)該可測(cè)得等量的自由基。
這在沿著該全部時(shí)間范圍基本恒定的自由基形成中可觀察到RG平均值＝1.36·1012自由基/mg活檢皮膚，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差較低，對(duì)于這五個(gè)值僅為7.03％。
在表1的幾個(gè)小斜線中還可發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)不同重復(fù)UV劑量的其它恒定RG值。它們通過(guò)專(zhuān)門(mén)的陰影/點(diǎn)被標(biāo)注出來(lái)。
因此，表1證明在較大范圍的UV劑量?jī)?nèi)反比定律相當(dāng)適用。
表1根據(jù)不同過(guò)濾劑衰減度和不同輻照時(shí)間在活檢皮膚上測(cè)得的RG值(X·1012rad/mg)。
其次，還研究了UV劑量和自由基形成(RG)之間的關(guān)系。
通過(guò)4種中性密度濾光片以及未過(guò)濾的光源乘上五種不同輻照時(shí)間，可提供25種不同UV暴露，對(duì)應(yīng)13種不同的UV劑量(參見(jiàn)表1)。
根據(jù)UV劑量，皮膚中的自由基形成被繪成圖2。盡管暴露時(shí)間不同，我們注意到所有單次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖非常好的聚集在一起并分布在一條曲線周?chē)?。無(wú)論考慮哪一種暴露時(shí)間，根據(jù)非線性關(guān)系可將圖聯(lián)系起來(lái)。這明顯是反比定律適用性的結(jié)果。自由基形成對(duì)UV劑量的圖表明對(duì)較高UV劑量存在飽和。
但是，采用雙對(duì)數(shù)刻度，簡(jiǎn)單線性函數(shù)可與實(shí)驗(yàn)作圖相重疊，這使得非常容易校正本方法。該陳述在圖3的圖中示出，其中用log UV劑量對(duì)log RG作圖。本研究中，為避免由于對(duì)數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)化所得到的負(fù)的數(shù)據(jù)，RG數(shù)據(jù)的實(shí)際數(shù)目X乘上了因子1000。
根據(jù)通過(guò)最小二乘法對(duì)參數(shù)a和b簡(jiǎn)單的數(shù)字調(diào)整，采用這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)下面的線性函數(shù)獲得了良好的相關(guān)性。
log(UV劑量)＝a·log(1000·X)+b (2b)該關(guān)系(與圖3的第一關(guān)系相反)可計(jì)算與在涂抹防曬產(chǎn)品的活檢皮膚中檢測(cè)到的自由基(RG)的量相關(guān)的UV劑量。
防曬指數(shù)的測(cè)定上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可開(kāi)發(fā)一種確定防曬指數(shù)的方法。它們被計(jì)算為通常所使用的UV劑量的比率。圖1示例性描述了該方法，其中-E0為用于全身防護(hù)層/活檢皮膚的UV劑量。
-E為通過(guò)校正過(guò)的公式2、從通過(guò)ESR光譜法測(cè)量得到的自由基數(shù)X獲得的UV劑量。該“有效”UV劑量可提供給未受保護(hù)的活檢組織以產(chǎn)生與在受到保護(hù)的活檢組織中測(cè)得的量相同的自由基，在該受保護(hù)的活檢組織上涂抹了2mg/cm2防曬層。
表2含有以該方法為基礎(chǔ)的防曬指數(shù)，該方法采用了表1獲得的數(shù)據(jù)以及圖3報(bào)道的公式2的參數(shù)值。它們與作為參照物的中性密度濾光片的衰減值相比較。每一個(gè)計(jì)算得到的防曬指數(shù)為對(duì)應(yīng)不同輻照時(shí)間的五個(gè)值的平均值。中性密度濾光片的衰減度和計(jì)算得到的防曬指數(shù)非常接近。
表2中性密度濾光片的防曬指數(shù)的計(jì)算，來(lái)自表1所報(bào)道的RG數(shù)據(jù)
積分SPF上述UV劑量和RG值之間的關(guān)系使得可以用與體內(nèi)SPF相似的方式計(jì)算防曬指數(shù)。通過(guò)使用中性密度濾光片作為標(biāo)準(zhǔn)防護(hù)層可驗(yàn)證這些新的防曬指數(shù)的有效性。
因此，使用與測(cè)定體內(nèi)SPF相同的方法，其中定義就紅斑終點(diǎn)而言，SPF=MEDpMEDu;]]>在此，MEDp＝用于受到保護(hù)的皮膚的最小紅斑UV劑量
MEDu＝用于未受到保護(hù)的皮膚的最小紅斑UV劑量。
根據(jù)模式描述(圖1)，在紅斑終點(diǎn)被通過(guò)ESR光譜法法檢測(cè)得到的自由基RG的量所替換時(shí)，MEDp和MEDu現(xiàn)在對(duì)應(yīng)E0和E。
通過(guò)ESR X波段光譜法對(duì)自由基進(jìn)行定量測(cè)量可確定新的防曬指數(shù)。然而，ESR光譜法的穿透深度更深，使得可對(duì)皮膚進(jìn)行全面研究，包括UVB和UVA的全部范圍以及從表面直到皮下組織的皮膚。之后我們將該新的防曬指數(shù)命名為積分防曬指數(shù)(iSPF、ISPF或∫SPF)。
∫SPF的測(cè)定圖1示出了基本方式。進(jìn)行如下步驟(1)建立了UV劑量和自由基形成(RG)之間的數(shù)量關(guān)系(估算公式2的a和b參數(shù))。通過(guò)測(cè)量受到不同UV劑量的未防護(hù)的活檢組織中的自由基形成，時(shí)常調(diào)整(校正)公式參數(shù)。
(2)對(duì)受到保護(hù)的活檢組織(2mg/cm2防曬產(chǎn)品涂抹在表皮表面)進(jìn)行輻照。通過(guò)ESR光譜法對(duì)每種暴露時(shí)間(t)對(duì)自由基形成進(jìn)行估算。因此，受到保護(hù)的活檢組織的RG值＝Xt(測(cè)量得到)。
(3)用下列公式在每種暴露時(shí)間對(duì)用于受到保護(hù)的活檢組織的相應(yīng)UV劑量(E0)t進(jìn)行計(jì)算(E0)t＝輻照度·時(shí)間 (3)(4)根據(jù)公式2的a和b參數(shù)，計(jì)算形成相同量的自由基(Xt)所需要的有效UV劑量(E)tlog(E)t＝a·log(1000·Xt)+b (2a)(5)防曬產(chǎn)品的積分SPF計(jì)算為相同暴露時(shí)間的UV劑量的比率∫SPF=(E0)t(E)t---(1a)]]>實(shí)施例1和2測(cè)試了兩種不同防曬劑樣本，均在UVB獲得了較高的保護(hù)，并且獲得了不同的UVA保護(hù)水平防曬劑A為物理防曬劑TiO2，SPF為26，UVA PF(PPD)＝5；防曬劑B為UV過(guò)濾有機(jī)防曬劑，SPF為39，UVA PF(PPD)＝12。
兩種產(chǎn)品均以2mg/cm2用于皮膚表面，并根據(jù)三次輻照時(shí)間進(jìn)行測(cè)試。同時(shí)還測(cè)試了沒(méi)有覆蓋的活檢皮膚，一組直接暴露于太陽(yáng)刺激器，第二組通過(guò)衰減度為30的中性密度濾光片暴露。表3所報(bào)道的每一種自由基形成數(shù)據(jù)為四個(gè)活檢組織的平均值。
表3不同輻照時(shí)間的自由基形成(RG＝X·1012rad/mg)
在第一步中，再次建立自由基形成(Xt·1000)和UV劑量之間的關(guān)系，以檢測(cè)其可重復(fù)性。在有和沒(méi)有中性密度濾光片的情況下，使用了未覆蓋的活檢皮膚。根據(jù)公式(6)計(jì)算這些活檢皮膚所獲得的UV劑量。
若校正數(shù)據(jù)被繪成雙對(duì)數(shù)XY軸，可獲得準(zhǔn)確的如下列公式(5)的公式(2)參數(shù)Log(UV劑量)＝2.0947·log(1000·X)-3.7463 (5)可注意到公式(5)與圖3所示出的線性關(guān)系非常接近。
通過(guò)對(duì)數(shù)函數(shù)(以10為底)轉(zhuǎn)化表3的所有數(shù)據(jù)，以獲得線性關(guān)系表3a
然后通過(guò)公式2校正log(自由基)對(duì)log(UV劑量)表3ba和b參數(shù)調(diào)整
然后確定a和b值以最小化總方差DeIta2。因此用a＝2.0947和b＝3.7463調(diào)整公式2以適合實(shí)驗(yàn)值。調(diào)整之后，公式2被用于獲得不同X值的Log E。
可從表3的自由基形成數(shù)據(jù)計(jì)算UV劑量，它們?cè)诒?中被報(bào)道。首先通過(guò)將計(jì)算得到的UV劑量和空白組和中性密度濾光片30所使用的UV劑量相比較檢驗(yàn)計(jì)算方法。僅觀察到微小差異，最大偏差為13％。然后，計(jì)算了防曬產(chǎn)品A和B的有效UV劑量。這些UV劑量可提供給未受保護(hù)的活檢組織以產(chǎn)生與在受到保護(hù)的活檢組織中測(cè)量得到的量相同的自由基，在該受保護(hù)的活檢組織上以2mg/cm2涂抹了防曬層。
表4根據(jù)表3的自由基形成數(shù)據(jù)由公式(5)計(jì)算得到的UV劑量(mJ/cm2)
根據(jù)表4的UV劑量，防曬指數(shù)(∫SPF)被計(jì)算為在相同暴露時(shí)間里所使用的UV劑量與計(jì)算得到的(有效的)UV劑量之間的比率。結(jié)果在表5中報(bào)道。用空白組和中性密度濾光片30分析檢驗(yàn)指數(shù)的準(zhǔn)確度。同一表的第4和5列報(bào)道了新的防曬防曬指數(shù)。
還計(jì)算了所有測(cè)量的不確定度(±95％置信區(qū)間)(每次暴露時(shí)間4個(gè)活檢組織)。
表5計(jì)算得到的防曬指數(shù)∫SPF，以表4報(bào)道的UV劑量的比率為基礎(chǔ)。
∫SPF
作為第一個(gè)觀察到的現(xiàn)象，可注意到積分SPF的UV過(guò)濾寬度有所增加。在體內(nèi)UVA(PPD)為最佳品的防曬劑B中發(fā)現(xiàn)最高值。在兩個(gè)待測(cè)樣本中，積分SPF明顯低于體內(nèi)紅斑SPF。
實(shí)施例3-8為確定積分SPF對(duì)不同UV過(guò)濾寬度的選擇性，用不同UVB和/或?qū)挷◣VA/B過(guò)濾劑得到了專(zhuān)門(mén)的防曬制劑。
實(shí)施例3＝防曬劑C＝O-W基底，沒(méi)有UV過(guò)濾劑實(shí)施例4＝防曬劑D＝基底+UV過(guò)濾劑1(5％IMC)實(shí)施例5＝防曬劑E＝基底+UV過(guò)濾劑2(10％IMC)實(shí)施例6＝防曬劑F＝基底+寬波帶UVA/UVB過(guò)濾劑1(1，5％BMDBM+3％BEMT)實(shí)施例7＝防曬劑G＝基底+寬波帶UVA/UVB過(guò)濾劑2(3％BMDBM+8％MBBT+2％BEMT)實(shí)施例8＝防曬劑H＝基底+UV過(guò)濾劑1(5％IMC)+寬波帶UVA/UVB過(guò)濾劑2(3％BMDBM+8％MBBT+2％BEMT)在三種不同輻照時(shí)間30、60和150s如上述的那樣測(cè)試這六個(gè)防曬劑樣本。
表6報(bào)道的每一種自由基形成數(shù)據(jù)為4個(gè)活檢組織測(cè)量值的平均值。
∫SPF(積分SPF)被計(jì)算為在相同暴露時(shí)間里所使用的UV劑量與有效UV劑量之間的比率(公式1)。每一個(gè)所報(bào)道的∫SPF為對(duì)應(yīng)不同輻照時(shí)間的3個(gè)計(jì)算值的平均值。還計(jì)算了不確定度(±95％置信區(qū)間)并在表6中報(bào)道。
表6不同輻照時(shí)間的RG數(shù)據(jù)(RG＝X×1012rad/mg)。三次不同暴露時(shí)間里計(jì)算得到的平均∫SPF。
上述實(shí)施例證實(shí)∫SPF隨著寬度和UV過(guò)濾強(qiáng)度明顯增加。沒(méi)有良好平衡的UVB/UVA防曬劑不能獲得更好的保護(hù)效果。這在UVA過(guò)濾較弱的防曬劑，如D和E中清楚地觀察到，在這類(lèi)防曬劑中僅摻入了UVB過(guò)濾劑。對(duì)這些產(chǎn)品而言，針對(duì)UV輻射的真實(shí)的生物相關(guān)防護(hù)(用∫SPF表示)相對(duì)于表示為紅斑SPF的假定值而言顯著降低。
實(shí)施例9與體內(nèi)PPD和體內(nèi)SPF相比較，∫SPF考慮了全部太陽(yáng)UV光譜UVB+UVA。
另一方面，ESR的這些測(cè)量效果(在皮膚的深處)可引起對(duì)由UVB所形成的自由基進(jìn)行定量的值的誤解。如可能示出的那樣，該值約為0.24×1012自由基/mg。但是，所有這些ROS被包含在1mm×1mm×0.05mm的體積單元(假設(shè)平均表皮為50微米)中。因此，在UVA的影響下，在表皮中形成的自由基的數(shù)目為皮膚的深層中的3倍，約為1.58×1012自由基/mg。
由UVB單獨(dú)在表皮體積單元中形成的約4.8×1012自由基/mg這些數(shù)量可能與生物效應(yīng)如紅斑或相關(guān)的DNA損害的形成密切相關(guān)。首次指示表明UVB引起的DNA損害可用非常高劑量的抗氧化劑預(yù)防。Lin&al報(bào)道了在豬皮上測(cè)得的通過(guò)維生素C和E的組合針對(duì)胸腺嘧啶二聚體形成的保護(hù)作用。
為完成這些實(shí)驗(yàn)，將僅對(duì)UVA有良好防護(hù)的防曬劑加入樣本池。將5,0％BMDBM摻入美容型基底，獲得在UVA吸收較強(qiáng)，在UVB吸收較差的樣本(防曬劑N，圖4)。正如期待的那樣，測(cè)得了較低的體內(nèi)紅斑SPF＝4.7(±1.3)。對(duì)積分SPF產(chǎn)生的疑問(wèn)是由于我們的皮膚模型對(duì)UVB輻射可能缺少敏感性，該積分SPF是否會(huì)過(guò)分轉(zhuǎn)化成非真實(shí)的較高值？將該新方法用于產(chǎn)品N，我們得到與體內(nèi)SPF相當(dāng)?shù)姆e分SPF∫SPF＝5.1(±1.2)。因此，即使是在相同產(chǎn)品上實(shí)現(xiàn)較低UVB防護(hù)和較高UVA防護(hù)時(shí)，也未出現(xiàn)對(duì)UV防護(hù)的過(guò)高估計(jì)，如圖4所示。
相反，用體內(nèi)SPF可能出現(xiàn)任何相關(guān)性。
依賴(lài)于UV過(guò)濾制劑，體內(nèi)SPF數(shù)據(jù)大大大于該積分SPF(若防曬劑UVB防護(hù)較強(qiáng))或與之相等。當(dāng)然，紅斑SPF并不考慮UV過(guò)濾寬度的重要性，因此會(huì)帶給消費(fèi)者主要對(duì)于較高SPF值的錯(cuò)誤的安全感。從這點(diǎn)來(lái)看，新的∫SPF提供了有價(jià)值的信息。圖4的圖總結(jié)了4種典型的實(shí)例，示出紅斑SPF和積分SPF之間的主要區(qū)別防曬劑E，防護(hù)UVB，不防護(hù)UVA；防曬劑N，防護(hù)UVA，少量防護(hù)UVB；防曬劑G，對(duì)UVB和UVA的防護(hù)基本相同；以及防曬劑H，對(duì)UVB的防護(hù)高于對(duì)UVA的防護(hù)。
光譜和防曬指數(shù)表明紅斑SPF對(duì)UVB過(guò)濾非常敏感，而對(duì)UVA過(guò)濾非常不敏感。相反，本發(fā)明的∫SPF對(duì)UVB和UVA過(guò)濾均很敏感。
根據(jù)本發(fā)明的方法，清楚的是僅有較寬UVB/UVA過(guò)濾的產(chǎn)品能獲得較高的積分SPF。這與下述事實(shí)相一致UVA和UVB輻射參與到在全部活檢皮膚(表皮+真皮)中形成自由基。另外，由ESR光譜法得到的該新的防曬指數(shù)很好地包括了來(lái)自UVB的紅斑的出現(xiàn)，并且正如所示出的那樣，與體內(nèi)UVA PPD密切相關(guān)。
積分SPF可如常規(guī)體內(nèi)UV指數(shù)那樣被解釋∫SPF＝10防護(hù)意味著一個(gè)人可在太陽(yáng)下停留十倍于皮膚未受防護(hù)時(shí)所停留的時(shí)間，而不會(huì)被曬傷，也不會(huì)顯著少于出現(xiàn)PPD反應(yīng)所需要的時(shí)間。因此，使用∫SPF＝10的產(chǎn)品后，在太陽(yáng)下持續(xù)暴露1小時(shí)可使得皮膚受到自由基的損害較少，這相當(dāng)于未經(jīng)保護(hù)直接暴露于太陽(yáng)下的6分鐘。
權(quán)利要求
1.一種確定美容型防曬劑和治皮膚病型防曬劑的包括UVA和UVB輻射的積分防曬指數(shù)(∫SPF)的方法，所述方法包括如下步驟(a)將一定量的防曬劑直接施用于一定面積的皮膚基質(zhì)，該皮膚基質(zhì)事先已充滿(mǎn)了起旋轉(zhuǎn)陷阱作用的已知物質(zhì)；(b)通過(guò)輻射源如太陽(yáng)刺激器將皮膚基質(zhì)暴露于一定量的輻射，該輻射包括自然太陽(yáng)暴露條件下的UVA和UVB射線；(c)暴露后1-120分鐘內(nèi)對(duì)暴露于輻射的皮膚基質(zhì)進(jìn)行電子自旋共振(ESR)測(cè)量；(d)與自由基數(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)樣本相比較后將自由基形成值RG標(biāo)準(zhǔn)化，并以實(shí)際數(shù)目X×1012每1mg樣本的形式記錄所捕獲到的自由基數(shù)，RG＝X×1012自由基/mg皮膚樣本，(e)并根據(jù)公式(1)確定積分防曬指數(shù)∫SPF∫SPF=E0E---(1)]]>其中E0為提供給使用了防曬產(chǎn)品的皮膚樣本的UV劑量的平均值(mJ/cm2)，用公式(7)進(jìn)行計(jì)算E0＝I·t (7)I＝太陽(yáng)刺激器輻照度(mW/cm2)t＝暴露時(shí)間(秒)。并且E為有效UV劑量的平均值(mJ/cm2)，因此與步驟(b)中形成的自由基的檢測(cè)量相關(guān)并且其中根據(jù)步驟(d)中的自由基形成值的實(shí)際數(shù)目X與公式(2)計(jì)算Elog10(E)＝a·log10(X·1000)+b (2)在上式中，自由基的數(shù)量與UV劑量不成比例，而其中a和b為在校正步驟中所確定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，以獲得UV劑量以10為底的對(duì)數(shù)函數(shù)與通過(guò)平方誤差估算法獲得的自由基形成的實(shí)際數(shù)目的以10為底的對(duì)數(shù)函數(shù)之間正確的線性關(guān)系。并且根據(jù)公式(8)計(jì)算EE＝10log10(E)(8)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述直接施用于基質(zhì)表面的一定量的防曬劑的范圍介于1和4mg/cm2皮膚表面，并且以給定的防曬劑濃度施用。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中所述防曬劑的其它濃度為模擬值，并且通過(guò)將降低輻射的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾器放置于發(fā)射一定量輻射的輻射源和皮膚基質(zhì)之間的方式來(lái)校準(zhǔn)所述方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，其中所述所使用的降低輻射的過(guò)濾器為衰減因子為1、2、5、10和20的中性密度濾光片。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中如需估算防曬劑光穩(wěn)定性，暴露給輻射持續(xù)30、60、150、300和600秒或更長(zhǎng)時(shí)間。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中在暴露給輻射后1-120分鐘、優(yōu)選15-60分鐘，進(jìn)行ESR測(cè)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所使用的用于ESR測(cè)量的分光光度計(jì)具有如下參數(shù)
微波頻率f0＝9.52GHz，微波功率Pμ＝20mW，調(diào)制頻率fm＝100kHz，調(diào)制幅度Bm＝0.2mT，磁場(chǎng)掃描ΔBs＝20mT，掃描時(shí)間ts＝60s。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所使用的旋轉(zhuǎn)陷阱為選自苯基叔丁硝酮或二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物的物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述防曬劑為美容制劑或藥物制劑的一部分，并且該制劑含有一種或多種選自下列的已知物理過(guò)濾劑和有機(jī)過(guò)濾劑二苯酮-3、二苯酮-4、甲氧肉桂酸辛酯、胡莫柳酯、苯基苯并咪唑磺酸、甲氧基肉桂酸乙基己酯、對(duì)甲氧基肉桂酸異戊酯、乙基己基三嗪酮、二乙基己基丁胺三嗪酮、4-甲基亞芐基樟腦、PABA、乙基己基二甲基PABA、水楊酸乙基己酯、氰雙苯丙烯酸辛酯、對(duì)甲氧基肉桂酸異戊酯、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、亞甲基-雙-苯并三唑基四甲基丁基苯酚、雙乙基己氧基苯酚甲氧基苯三嗪及其混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述待測(cè)美容制劑或藥物制劑摻入已知抗氧化劑分子或自由基清除分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述皮膚基質(zhì)選自活檢皮膚、人造皮膚或豬皮，優(yōu)選來(lái)自豬耳的皮膚。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及確定包括UVA和UVB輻射的積分防曬指數(shù)(òSPF或iSPF)的方法，該積分防曬指數(shù)可用于將美容型防曬劑和治皮膚病型防曬劑分類(lèi)。該方法包括如下步驟將一定量的防曬劑應(yīng)用到充滿(mǎn)旋轉(zhuǎn)陷阱的一定面積的皮膚基質(zhì)，然后將該皮膚基質(zhì)暴露于一定量的由太陽(yáng)刺激器所產(chǎn)生的UVA－和UVB射線，對(duì)暴露于輻射的皮膚基質(zhì)進(jìn)行電子自旋共振(ESR)測(cè)量，并以實(shí)際數(shù)目×1012自由基/mg皮膚樣本記錄所捕獲到的自由基數(shù)，并根據(jù)公式(1)和(2)和(8)確定積分防曬指數(shù)òSPF。
文檔編號(hào)G01R33/60GK1997910SQ200580012528
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年4月14日
發(fā)明者L·費(fèi)雷羅, L·扎斯特羅, K·戈?duì)査?伯納, N·格羅斯, T·赫爾林 申請(qǐng)人:科蒂股份有限公司, 皮膚病產(chǎn)品研究伽林私人研究所有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan