專利名稱:檢測(cè)農(nóng)藥的方法、生物微傳感器及降低電流噪聲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥檢測(cè)方法、生物微傳感器及降低電流噪聲的方法。
背景技術(shù)：
為了增加產(chǎn)量及保持農(nóng)作物的美觀，通常施用大量的農(nóng)藥，其中有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorous compounds；OPCs)由于具有低生物累積性及高生物可分解性的優(yōu)點(diǎn)，目前已取代有機(jī)氯農(nóng)藥成為最普遍使用的農(nóng)藥種類。有機(jī)磷農(nóng)藥雖具有上述優(yōu)點(diǎn)，但在大量使用的情況下，可能導(dǎo)致在土壤、作物、表面水及工業(yè)廢水中殘留，對(duì)人體健康與自然環(huán)境造成相當(dāng)大的威脅。世界各國(guó)已對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的管制詳加注意，針對(duì)飲用水、食品及工業(yè)廢水中頒布制定相當(dāng)嚴(yán)格的管制標(biāo)準(zhǔn)。
一旦有機(jī)磷進(jìn)入生物體內(nèi)后，它會(huì)跟膽堿酯酶(cholineesterase；ChE)的活性位置形成不可逆的結(jié)合，進(jìn)而抑制該酶活性，延緩生物體內(nèi)乙酰膽堿(acetyl choline；ACh)的水解速率，干擾神經(jīng)傳輸。根據(jù)農(nóng)藥本身的毒性、劑量與接觸時(shí)間的差異，所導(dǎo)致的癥狀包括疲倦、惡心、嗜睡、視覺(jué)模糊，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)劳觥?br> 傳統(tǒng)上，農(nóng)藥的分析主要采用化學(xué)方法(包括高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC、氣相色譜-質(zhì)譜法GC-Mass、電感耦合等離子體-質(zhì)譜法ICP-Mass等)。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)儀器分析方法雖可對(duì)環(huán)境樣本提供精確的檢測(cè)，但前處理及分析步驟極為冗長(zhǎng)，加以儀器本身價(jià)格昂貴、體積龐大，且需要經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的人員才能操作，導(dǎo)致檢測(cè)成本過(guò)高，基本上并不符合污染現(xiàn)地即時(shí)監(jiān)測(cè)的要求。對(duì)即將上市的農(nóng)產(chǎn)品而言，這些傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法對(duì)于農(nóng)藥的即時(shí)檢測(cè)與篩選并無(wú)法提供任何的幫助。
有鑒于此，開發(fā)一個(gè)能夠快速篩檢污染物濃度，同時(shí)兼具可攜帶、操作簡(jiǎn)便與廉價(jià)特性的微傳感器(Micro-sensor)，成為當(dāng)前檢測(cè)監(jiān)測(cè)技術(shù)的研發(fā)重點(diǎn)。
生物傳感器(biosensor)由于具有下列諸多的優(yōu)點(diǎn)，可克服傳統(tǒng)分析方法的缺失，深具發(fā)展?jié)摿?1)經(jīng)由固定化技術(shù)的應(yīng)用，生物元件可重復(fù)使用，降低成本；(2)生物辨認(rèn)元件專一性高，可避免非目標(biāo)物干擾；(3)操作簡(jiǎn)易；(4)靈敏度高，所需樣品量低；(5)應(yīng)答快速，降低分析時(shí)間；(6)數(shù)字信號(hào)輸出，達(dá)到微小化，易攜帶，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
由于信號(hào)傳輸元件本身傳輸能力的差異，各生物傳感器的可檢測(cè)范圍有所不同。傳統(tǒng)的電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)極限只能達(dá)到ppm級(jí)，是所有信號(hào)傳輸元件中最差的。然而電化學(xué)生物傳感器由于操作簡(jiǎn)便、設(shè)備成本與檢測(cè)成本低廉，同時(shí)針對(duì)有顏色及高濁度的樣品仍可做準(zhǔn)確的檢測(cè)，因此仍是發(fā)展最早且最完善的，無(wú)論國(guó)內(nèi)外均有相當(dāng)多的研究結(jié)果提出。目前電化學(xué)生物微傳感器之所以無(wú)法達(dá)到普遍使用的程度，主要的困難點(diǎn)包括(1)操作時(shí)氧化電位過(guò)高，易同時(shí)氧化環(huán)境中的干擾物質(zhì)，導(dǎo)致噪聲產(chǎn)生；(2)檢測(cè)時(shí)間相較其他形式的生物傳感器為長(zhǎng)；(3)檢測(cè)極限太高，無(wú)法針對(duì)低濃度的污染物做檢測(cè)，應(yīng)用面過(guò)于狹窄。若能克服這些缺點(diǎn)，將可加速此類生物傳感器商業(yè)化的速度，同時(shí)擴(kuò)大其在環(huán)境污染檢測(cè)的應(yīng)用面。

發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)農(nóng)藥的方法，包括提供一樣本；使該樣本與至少一電極接觸；以及檢測(cè)產(chǎn)生的電流信號(hào)，其中該電極表面有酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑固定其上。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該酶為乙酰膽堿酯酶或膽堿氧化酶。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該無(wú)機(jī)催化劑為普魯士藍(lán)。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該電極表面是以電聚合方法固定。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑于聚吡咯層上。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該金納米顆粒的濃度為0.5-2.0ppm。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該電極為白金電極。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，其還包括使該樣品與一溫度感應(yīng)器接觸，檢測(cè)該樣品溫度。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該電流信號(hào)以樣品溫度進(jìn)行溫度補(bǔ)償處理。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該農(nóng)藥為有機(jī)磷或氨基甲酸鹽。
本發(fā)明的檢測(cè)農(nóng)藥的方法中，該電極與溫度感應(yīng)器設(shè)置在一平板上。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種生物微傳感器，包括至少一電極，用以檢測(cè)電流信號(hào)；一處理單元，用以接收處理該電流信號(hào)，且轉(zhuǎn)換該電流信號(hào)成為一濃度數(shù)據(jù)；以及一顯示單元，用以顯示該濃度數(shù)據(jù)；其中該電極表面以酶、金納米顆粒以及無(wú)機(jī)催化劑固定。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該酶為乙酰膽堿酯酶或膽堿氧化酶。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該無(wú)機(jī)催化劑為普魯士藍(lán)。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該電極表面是以電聚合方法固定。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑于聚吡咯層上。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該電極為白金電極。
本發(fā)明的生物微傳感器，還包含一溫度感應(yīng)器，用以檢測(cè)溫度并傳送至該處理單元。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該電流信號(hào)以該檢測(cè)溫度進(jìn)行溫度補(bǔ)償處理。
本發(fā)明的生物微傳感器用于檢測(cè)農(nóng)藥。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該農(nóng)藥為有機(jī)磷或氨基甲酸鹽。
本發(fā)明的生物微傳感器中，該電極與溫度感應(yīng)器同時(shí)在一平板上。
本發(fā)明的生物微傳感器，還可包括至少一電極，一溫度感應(yīng)器，以及一數(shù)據(jù)處理顯示儀，其中該電極表面有酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑固定其上，用以檢測(cè)農(nóng)藥。
本發(fā)明的另一目的進(jìn)一步提供一種降低電流噪聲的方法，包括將金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑固定在一酶固定的電極表面。
本發(fā)明的降低電流噪聲的方法中，該無(wú)機(jī)催化劑為普魯士藍(lán)。
本發(fā)明的降低電流噪聲的方法中，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
本發(fā)明的降低電流噪聲的方法中，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
本發(fā)明的降低電流噪聲的方法中，該電極表面是以電聚合方法固定金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑。
本發(fā)明的降低電流噪聲的方法中，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，使金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑固定于聚吡咯層上。
本發(fā)明的降低電流噪聲的方法中，該酶為乙酰膽堿酯酶或膽堿氧化酶。
本發(fā)明在生物微傳感器的開發(fā)上，除了需保有傳統(tǒng)生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)之外，還要能克服環(huán)境因子干擾，保持生物辨認(rèn)元件活性，縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)還要能降低檢測(cè)極限，才能擴(kuò)大應(yīng)用范圍。欲達(dá)到這些目標(biāo)，整個(gè)微傳感器開發(fā)需建立包括電極制備、生物辨認(rèn)元件固定、電流信號(hào)放大、噪聲消除與信號(hào)數(shù)字化、傳感器微小化等平臺(tái)技術(shù)。
在電極的制備方面，材質(zhì)的選擇包括玻璃、金、白金、鈀、石墨及碳黑，電極結(jié)構(gòu)無(wú)論是平板電極、針狀電極(實(shí)心或鏤空)均可使用。電極表面處理可以酸、堿、物理研磨或超音波處理，得到干凈的電極表面。在生物辨認(rèn)元件固定方面，可使用物理包埋或化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)達(dá)到固定的目的，但在固定的過(guò)程中，需考量生物辨認(rèn)元件流失與失活的問(wèn)題。
此外，要縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)改善檢測(cè)極限，需通過(guò)降低環(huán)境因子所產(chǎn)生的噪聲及放大輸出信號(hào)加以達(dá)成。除了電子媒介物的使用之外，在固定的過(guò)程中采用導(dǎo)電聚合物(例如聚吡咯及丙二胺)進(jìn)行生物辨認(rèn)元件固定亦可適當(dāng)降低檢測(cè)時(shí)所需的氧化電位值，避免環(huán)境樣本中的雜質(zhì)同時(shí)被氧化，減低環(huán)境因子的干擾的程度。
另外，納米材料的研究成果顯示物質(zhì)一旦進(jìn)入納米規(guī)格，不論在強(qiáng)度、導(dǎo)電度與導(dǎo)熱能力等材料性質(zhì)均會(huì)大幅提升。在生物辨認(rèn)元件的固定過(guò)程中使用納米材料，將有助于傳感器輸出信號(hào)的放大，進(jìn)而提升微傳感器的檢測(cè)速度、準(zhǔn)確性與靈敏度。
欲使使用者便于上手，同時(shí)可用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，除了儀器本身需輕薄短小之外，檢測(cè)的結(jié)果最好能直接顯示在傳感器的面板上，此部分則有賴信號(hào)數(shù)字化與傳感器微小化來(lái)達(dá)成。
本發(fā)明嘗試將酶生物傳感器與納米科技的概念結(jié)合，開發(fā)一種生物微傳感器檢測(cè)水中的農(nóng)藥，利用金納米粒子所具有的高比表面積與高導(dǎo)電度的特殊性質(zhì)并組合無(wú)機(jī)催化劑，用以降低氧化電位電子轉(zhuǎn)移，同時(shí)達(dá)到放大電流的輸出信號(hào)與避免噪聲產(chǎn)生，提升本發(fā)明的生物微傳感器的S/N值。因此，本發(fā)明的生物微傳感器可降低生物傳感器的檢測(cè)極限與環(huán)境中自然物質(zhì)的干擾，同時(shí)縮短檢測(cè)時(shí)間，達(dá)到現(xiàn)地即時(shí)檢測(cè)的目的。
圖1為本發(fā)明的生物微傳感器的一具體實(shí)施形態(tài)。
圖2說(shuō)明本發(fā)明的電極系統(tǒng)的背景電流(未添加H2O2)的變化。
圖3說(shuō)明系統(tǒng)中批次添加2μM的H2O2溶液的電流信號(hào)輸出變化。
圖4說(shuō)明H2O2添加前后輸出電流值變化與H2O2濃度的變化。
圖5A～圖5E說(shuō)明直接添加酶(未固定酶)前，有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)酶活性的抑制情形。圖5A為未固定酶以及無(wú)農(nóng)藥添加的空白試驗(yàn)；圖5B為未固定酶前，添加對(duì)氧磷濃度0.47ppm的電流變化；圖5C為未固定酶前，添加對(duì)氧磷濃度4.7ppm的電流變化；圖5D為未固定酶前，添加對(duì)氧磷濃度47ppm的電流變化；以及圖5E為未固定酶前，添加對(duì)氧磷濃度470ppm的電流變化。
圖6說(shuō)明當(dāng)乙酰膽堿酯酶(AChE)、膽堿酯酶(ChE)與膽堿氧化酶(ChO)添加量(酶未固定)為1mM、0.004Unit(酶活力單位)及0.2Unit時(shí)，對(duì)于不同對(duì)氧磷濃度(47ppm、4.7ppm、0.47ppm)及作用時(shí)間靈敏度的變化。
圖7顯示在固定對(duì)氧磷濃度(4.7ppm)下，懸浮酶(未固定酶)在不同抑制時(shí)間與電流抑制率的關(guān)系。
圖8顯示以溶膠-凝膠(sol gel)法將酶固定于白金電極表面前后的電極靈敏度。欄(a)使用以溶膠-凝膠法固定酶的白金電極表面；欄(b)為使用酶未固定、懸浮于樣本中的標(biāo)準(zhǔn)白金電極；欄(c)為使用酶未固定、懸浮于樣本中的1公分白金電極；及欄(d)為使用以溶膠-凝膠包埋酶后，直接置于水中，不將其固定于電極表面的電極。
圖9顯示酶經(jīng)電聚合固定前后的電流輸出信號(hào)的關(guān)系。欄(a)使用未固定酶的電極；欄(b)使用固定吡咯(pyrrole)單體/酶乙酰膽堿酯酶(AChE)與過(guò)氧化酶(HRP)為20μl/1000U的電極；欄(c)使用固定吡咯單體/酶AChE與二茂鐵(ferrocene)為20μl/1000U的電極；欄(d)使用固定吡咯單體/酶AChE為0.013mg/1000U的電極；及欄(e)使用固定吡咯單體/酶AChE為20μl/1000U的電極。
圖10顯示在無(wú)機(jī)催化劑(普魯士藍(lán)Fe(CN)63-)有無(wú)存在下的氧化電位下降效應(yīng)；實(shí)線表示無(wú)Fe(CN)63-；虛線表示Fe(CN)63-存在。
圖11顯示不同外加電壓下抗壞血酸的氧化電流值。
圖12為本發(fā)明使用的金納米顆粒的電子掃描顯微照片。
圖13A顯示固定或未固定酶與納米金顆粒的電極與電極靈敏度的關(guān)系；正方形標(biāo)記代表使用未固定酶與納米金顆粒的電極；三角形標(biāo)記代表使用固定酶與金納米顆粒的電極。圖13B顯示使用固定酶與納米金顆粒的電極時(shí)，納米金顆粒添加濃度與電極靈敏度的關(guān)系。
圖14顯示納米金顆粒的體積與電極敏感度的關(guān)系。
圖15說(shuō)明本發(fā)明生物微傳感器使用的酶活性回復(fù)性。
圖16說(shuō)明本發(fā)明生物微傳感器在不同檢測(cè)溫度下電極靈敏度的變化。
圖17顯示本發(fā)明生物微傳感器在不同pH值下檢測(cè)，電流輸出信號(hào)的變化情形。
圖18A顯示甲醇與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系；圖18B顯示乙醇與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系；圖18C顯示丙酮與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系。
圖19A顯示鎘離子與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系；圖19B顯示鐵離子與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系；圖19C顯示銅離子與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系；圖19D顯示鉛離子與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系。
圖20顯示硫酸根SO42-與本發(fā)明生物微傳感器的酶活性的關(guān)系。
圖21說(shuō)明檢測(cè)時(shí)間10分鐘25℃下對(duì)氧磷濃度與本發(fā)明生物微傳感器的電流抑制率的關(guān)系。
圖22說(shuō)明本發(fā)明的生物微傳感器電流抑制率與對(duì)氧磷的線性范圍。
圖23顯示本發(fā)明的生物微傳感器檢測(cè)番茄汁原液及添加對(duì)氧磷農(nóng)藥的番茄汁的數(shù)據(jù)及比較。欄(a)使用番茄汁原液；欄(b)使用添加30ppb對(duì)氧磷農(nóng)藥的番茄汁液；欄(c)使用稀釋10倍的番茄汁原液；及欄(d)使用稀釋10倍的添加30ppb對(duì)氧磷農(nóng)藥的番茄汁原液。
具體實(shí)施方式為讓本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合所附圖式，作詳細(xì)說(shuō)明如下生物微傳感器的構(gòu)成如圖1所示，本發(fā)明的一具體實(shí)施形態(tài)包括三個(gè)電極101、103及105，分別為對(duì)電極、工作電極以及參考電極，各工作電極固定有酶、金納米顆粒以及普魯士藍(lán)(Fe(CN)63-)，用以測(cè)量樣本中產(chǎn)生的電流信號(hào)S1，將所檢測(cè)的電流信號(hào)輸出至一處理單元120。
如圖1所示，本發(fā)明的生物微傳感器還包括一溫度感應(yīng)器110，用以檢測(cè)樣本溫度，并將檢測(cè)的溫度信號(hào)S2輸入一處理單元120。該處理單元120內(nèi)依下列式(4)將檢測(cè)的電流信號(hào)經(jīng)過(guò)下述的溫度補(bǔ)償處理后轉(zhuǎn)成為一濃度數(shù)值，并輸入一顯示單元122，在該顯示單元122上顯示樣本中所含的農(nóng)藥濃度，即檢測(cè)出樣本中農(nóng)藥含量。
電流輸出信號(hào)檢測(cè)機(jī)制本發(fā)明的生物微傳感器的整個(gè)電化學(xué)檢測(cè)機(jī)制可分為三個(gè)步驟，首先利用乙酰膽堿酯酶(AChE)(1000Unit/mg固體；Sigma)對(duì)乙酰膽堿(ACh)(99％，Sigma)行水解作用，所產(chǎn)生的膽堿再通過(guò)膽堿氧化酶(ChO)(100Unit/mg固體，Sigma)作用，產(chǎn)生過(guò)氧化氫，最后再以外加電壓對(duì)過(guò)氧化氫進(jìn)行氧化作用，使反應(yīng)放出電子，如此通過(guò)電位計(jì)可測(cè)量到酶反應(yīng)過(guò)程電流輸出信號(hào)的變化。整個(gè)酶反應(yīng)與電流信號(hào)檢測(cè)機(jī)制可以下列的方程式來(lái)加以表示
由于有機(jī)磷與氨基甲酸鹽農(nóng)藥均會(huì)與乙酰膽堿酯酶上的活性位置相結(jié)合，造成酶的活性抑制，進(jìn)而降低上列式(1)、(2)及(3)的連續(xù)反應(yīng)的反應(yīng)速率，而使電流輸出信號(hào)變小。
將電流輸出信號(hào)與抑制劑(待測(cè)農(nóng)藥)的濃度相對(duì)關(guān)系，定義如下式的電流抑制率(RI)，則可通過(guò)電流輸出信號(hào)，依式(4)確認(rèn)分析水樣中有機(jī)磷的濃度。
RI(%)=dIt/dt-dI1/dtdI1/dt×100%---(4)]]>其中dI1/dt為酶未受抑制前的輸出電流變化速率(或靈敏度)；dIt/dt為酶經(jīng)過(guò)一定時(shí)間t抑制后的電流變化速率(或靈敏度)。
金納米顆粒的生產(chǎn)方法取247.5ml的去離子水煮沸后，加入1％的檸檬酸鈉溶液15ml，煮沸5分鐘，加入HAuCl4溶液2.5ml，溶液逐漸由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑⑸詈稚?，持續(xù)90℃加熱攪拌15分鐘，將溶液置于室溫中冷卻，溶液相會(huì)還原出暗紅色的金納米粒子，儲(chǔ)存于4℃冰箱。以檸檬酸鈉作為還原劑，其羧基(COO-)會(huì)將三價(jià)金離子還原至一價(jià)金離子，同時(shí)生成丙酮二羧酸(acetonedicarboxylate)，再由一價(jià)金離子還原成金原子。整個(gè)反應(yīng)式如下所示
若欲制備不同粒徑大小的金納米粒子，可通過(guò)改變四氯金酸與檸檬酸鈉的比例來(lái)達(dá)成。調(diào)整檸檬酸鈉與四氯金酸的比例為7、1.75、3.75或14，分別制備出平均粒徑為25nm、36.3nm、16.5nm或19.4nm的金納米顆粒。
酶固定方法在酶固定之前，電極表面分別以超音波震蕩及濃硝酸清潔白金電極表面。以下分別以溶膠-凝膠固定方法(sol-gel)及電聚合方法將酶固定于白金電極表面。
(a)溶膠-凝膠固定方法(sol-gelimmobilization)取10μL TEOS(原硅酸四乙酯，tetraethyl orthosilicate；Aldrich Chemicals)、200μL去離子水、30μL乙醇以及1μL 0.1M的HCl于塑膠小試管中，以超音波震蕩一小時(shí)，在室溫放置2-3小時(shí)，溶膠-凝膠(sol gel)溶液的p H值維持在6。取0.1mg的AChE與ChO及金納米粒子溶液1μL(對(duì)照組則不添加)溶解于100μL pH值7的PBS溶液(磷酸緩沖液，phosphate buffersolution)中。取25μL溶膠-凝膠(sol gel)溶液加入前述的酶溶液中，充分混合。取出50μL，與白金電極一起置入另一小塑膠試管中，在4℃風(fēng)干24小時(shí)，以PBS溶液充分洗凈再儲(chǔ)存于4℃干燥的環(huán)境。
(b)電聚合固定方法(electropolymerization)-使用聚吡咯(polypyrrole)利用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry；CV)在0-1V間，以10mV/sec的速度掃描，將酶電聚合于白金電極表面。先于白金電極表面聚合上一層聚吡咯(如下式(7))作為預(yù)備層，以避免酶直接附著于電極表面。再以表1的條件進(jìn)行酶電聚合。在電極的保存方面，需先以去離子水沖洗后，在將其保存于4℃的0.1M PBS中。
表1聚吡咯電聚合所采用的物質(zhì)與條件
電位計(jì)電流輸出信號(hào)初步測(cè)試在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之初先以白金電極作為工作電極，經(jīng)由外加電壓+700mV(亦即H2O2的氧化電位)，測(cè)試電位計(jì)電流輸出信號(hào)對(duì)H2O2濃度變化的反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。圖2為系統(tǒng)的背景電流值變化，由圖可看出當(dāng)測(cè)試樣本中未添加H2O2時(shí)系統(tǒng)的背景電流值約在300秒的后達(dá)到穩(wěn)定值0。
圖3為批次添加2μM的H2O2溶液于測(cè)試瓶中，系統(tǒng)的電流信號(hào)輸出變化圖。由圖3可明顯看出隨著H2O2溶液的添加，電流值呈批次下降，顯示電位計(jì)可對(duì)樣本中H2O2的濃度作準(zhǔn)確的檢測(cè)。
將每一區(qū)間H2O2添加前后輸出電流值變化與H2O2的濃度作圖結(jié)果如圖4所示。由圖4可看出本系統(tǒng)的電流輸出信號(hào)與所添加的H2O2的濃度成一正比關(guān)系，尤其在H2O2濃度在0.002-0.006mM之間時(shí)，因此可用于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所產(chǎn)生的H2O2的檢測(cè)，進(jìn)而經(jīng)由酶活性抑制，確認(rèn)樣本中有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度。
有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)懸浮態(tài)酶活性的抑制情況先添加0.1ml 500mM的乙酰膽堿(acetylcholine；ACh)于含0.1M PBS與0.1M KCl的測(cè)試瓶中，而后在測(cè)試電流變化期間添加乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase；AChE)3.75Unit與膽堿氧化酶(choline oxidase；CHO)2Unit，同時(shí)外加電壓+700mV，再添加不同濃度(0、0.47、4.7、47及470ppm)的對(duì)氧磷(paraoxon，屬于有機(jī)磷農(nóng)藥的一種)，觀察電流輸出信號(hào)的變化，結(jié)果如圖5A-圖5E所示。由圖5A-圖5E可明顯看出一直到對(duì)氧磷濃度提升至470ppm時(shí)，電流輸出信號(hào)才有較明顯的變化，推測(cè)其可能原因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中乙酰膽堿酯酶(AChE)添加量太多，以致于加入抑制劑對(duì)氧磷后，殘余的酶活性仍然可使乙酰膽堿(ACh)反應(yīng)，故電位變化并沒(méi)有減弱的現(xiàn)象。
修改酶作用底物與酶的添加量，AChE、ChE與ChO添加量各為1mM、0.004Unit及0.2Unit，可將檢測(cè)極限下降至4.7ppm(如圖6所示)。依此結(jié)果進(jìn)行在固定對(duì)氧磷濃度4.7ppm下，不同對(duì)氧磷抑制時(shí)間對(duì)電流輸出信號(hào)(抑制率)影響的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。由圖7可明顯看出，隨著抑制時(shí)間延長(zhǎng)，酶受對(duì)氧磷抑制的程度越高，因此電流輸出信號(hào)的抑制率越大，亦即電流輸出信號(hào)除了受抑制劑(對(duì)氧磷)濃度的影響之外，亦與抑制時(shí)間密切相關(guān)。
酶固定后的活性表現(xiàn)根據(jù)上述酶固定方法，分別以溶膠-凝膠固定法及電聚合法將酶固定于電極表面上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以溶膠-凝膠法固定酶具有膠化縮合過(guò)程不易掌控，脫水干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，膠體易脆酶易流失，屏蔽效應(yīng)阻礙分子擴(kuò)散與電子傳遞等缺點(diǎn)，導(dǎo)致酶固定后，電流輸出信號(hào)較未固定前小甚多，感測(cè)靈敏度亦隨的下降。如圖8所示，以溶膠-凝膠法將酶固定于白金電極表面(圖8(a))，相較于直接將酶懸浮于樣本(圖8(b)、(c))中，電極靈敏度下降約4-10倍。同時(shí)若將酶以溶膠-凝膠包埋后，直接置于水樣中，而不將其固定于電極表面(圖8(d))，則由于質(zhì)傳阻力的存在，導(dǎo)致靈敏度較酶直接固定于電極表面者更差，幾乎沒(méi)有電流信號(hào)發(fā)生。
而以電聚合法-聚吡咯(polypyrrole)將酶固定于白金電極表面，不僅可通過(guò)導(dǎo)電單體與酶比例調(diào)控，達(dá)到膜狀固定(filmimmobilization)，避免因酶固定層太厚，造成質(zhì)量傳輸阻力，同時(shí)由于電聚合單體本身為可導(dǎo)電的物質(zhì)，以電聚合固定后電極的靈敏度反而較懸浮態(tài)酶為高，而酶活性在固定的過(guò)程中雖有些許失活，但活性殘余率仍高達(dá)90％。圖9是不同吡咯單體/酶量值電聚合完成后電流輸出信號(hào)的變化。由圖9可看出當(dāng)吡咯單體/AChE酶量為0.013mg/1000U時(shí)(圖9(d))，酶固定完成后的電極電流輸出信號(hào)約為懸浮態(tài)酶(圖9(a))的兩倍。這種情況發(fā)生主要是因?yàn)檫量┍旧砑礊閷?dǎo)電性物質(zhì)。以PTC(丙酰硫代膽堿，propionylthiocholine)套組(CACTA service srl.)測(cè)定酶固定后的活性，發(fā)現(xiàn)酶活性殘余率仍高達(dá)未固定前(懸浮態(tài))的89％。
噪聲排除與電流輸出信號(hào)放大生物微傳感器的靈敏度若要提升，則信號(hào)與噪聲的比值(S/N)必須增大。要達(dá)到這個(gè)目的，可從兩個(gè)方向著手，(1)避免環(huán)境樣本中其他物質(zhì)在檢測(cè)過(guò)程中被氧化，降低噪聲；(2)放大電流信號(hào)。在開發(fā)的過(guò)程中，將無(wú)機(jī)催化劑普魯士藍(lán)Fe(CN)63-連同AChE及CHO酶一起固定于白金電極表面，通過(guò)普魯士藍(lán)(PB)與普魯士白(PW)的自催化反應(yīng)，可將原本氧化H2O2所需的外加電壓由700mV降低至0左右(如圖10所示)。能夠降低應(yīng)用電位是由于普魯士藍(lán)(PB)提供一個(gè)很好的催化角色，使H2O2原本需較高電位(700mV)的氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)換成低電位的還原反應(yīng)，此還原反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)者為普魯士藍(lán)(PB)的還原態(tài)普魯士白(PW)所扮演。
首先普魯士白(PW)電催化(electrocatalytic)H2O2的還原，之后再通過(guò)電極提供的還原應(yīng)用電位(0mV)，促使普魯士藍(lán)(PB)再度還原成普魯士白(PW)，因此得到一還原電流信號(hào)。如此可使電極檢測(cè)到的信號(hào)為表面修飾的普魯士藍(lán)(PB)自我氧化還原改變而非溶液中發(fā)生的H2O2氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而增進(jìn)電極對(duì)H2O2靈敏度。
因此在此幾乎不外加電壓的情況下，原本在現(xiàn)地檢測(cè)過(guò)程中可能會(huì)同時(shí)被氧化的物質(zhì)(如腐植酸、抗壞血酸、NH4+-N等)不再被氧化，可大幅降低電流噪聲的產(chǎn)生。圖11表示抗壞血酸在不同外加電壓下被氧化的情況。由圖11可知，隨著外加電壓上升，因抗壞血酸氧化所產(chǎn)生的電流值越大，而當(dāng)外加電壓趨近于0時(shí)，氧化電流便消失，換句話說(shuō)，此電流噪聲將不會(huì)產(chǎn)生。
另一方面，利用化學(xué)合成的金納米粒子優(yōu)良的導(dǎo)電及巨大的比表面積特性(如圖12的電子掃描顯微照相所示)，將其連同酶與無(wú)機(jī)催化劑以電聚合的方法一起固定于白金電極表面上，發(fā)現(xiàn)由于電子傳輸阻力大幅下降及催化能力大幅上升，電流輸出信號(hào)相對(duì)提升甚多，亦即傳感器的靈敏度提升，使得傳感器整體檢測(cè)極限可下降至ppb級(jí)。若考量檢測(cè)時(shí)間與檢測(cè)極限的關(guān)系，則可在兩者之間作一折衷，使其不僅檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到要求，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間亦可縮短。有一個(gè)特別值得注意的地方，如圖13A，當(dāng)酶與金納米粒子均為懸浮狀態(tài)時(shí)，金納米粒子添加越多，電極的靈敏度亦越高。然而在固定的狀態(tài)下，如圖13B，傳感器的靈敏度會(huì)先隨著金納米粒子的添加而升高，而后若金納米粒子過(guò)量添加，電極的靈敏度會(huì)隨之下降，較佳為電聚合溶液中含0.5-2.0ppm金納米顆粒，最佳添加量為0.7ppm。這種現(xiàn)象主要在于懸浮狀態(tài)下，金納米顆粒添加量相較于測(cè)試樣本的體積可視為少量，添加越多，導(dǎo)電性理應(yīng)越好；而當(dāng)酶與金納米粒子呈膜固定的狀態(tài)下，酶、無(wú)機(jī)催化劑、電聚合單體與金納米粒子的量存在一最佳的配比，當(dāng)金納米粒子添加過(guò)量，不僅粒子容易凝集分散不易，且因?yàn)榕艛D效應(yīng)，導(dǎo)致固定層當(dāng)中酶與無(wú)機(jī)催化劑的含量過(guò)低，使得電流輸出信號(hào)下降。圖13A中另外可看出，若適當(dāng)添加金納米粒子量，則固定態(tài)的傳感器靈敏度將遠(yuǎn)高(約5倍)于懸浮狀態(tài)下的靈敏度(固定狀態(tài)曲線的波峰)。
本發(fā)明中另以不同的四氯金酸/檸檬酸鈉配比合成不同體積的金納米顆粒，將其固定于電極表面上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)所添加的金納米粒子直徑小于20nm(約16.5-20nm)時(shí)，電流信號(hào)放大效應(yīng)才會(huì)出現(xiàn)(如圖14所示)。
酶再活化AChE受到有機(jī)磷農(nóng)藥抑制后，可以2-PAM(吡啶-2-醛肟氯甲烷，pyridine-2-aldoxime methochloride)將其活性加以恢復(fù)。其作用機(jī)制是與乙酰膽堿酯酶表面磷酸化的磷酸結(jié)合，使乙酰膽堿酯酶恢復(fù)活性。氮上的正電荷與谷氨酸(glutamateacid)間有庫(kù)倫吸引力，使得具很強(qiáng)親核力的氧原子可攻擊與絲氨酸(serine)結(jié)合的磷原子，酶活性因而恢復(fù)。本發(fā)明中以不同濃度的2-PAM作用于受有機(jī)磷農(nóng)藥抑制后的電極，測(cè)量酶活性的恢復(fù)率及電流輸出信號(hào)變化，結(jié)果如圖15所示。圖15中，A0表示標(biāo)準(zhǔn)值；A1表示0.126ppm對(duì)氧磷處理10分鐘，A2表示以2-PAM再活化10分鐘，A3表示2-PAM再活化后的30分鐘后(測(cè)試1)；B1表示對(duì)氧磷處理10分鐘，B2表示以2-PAM再活化15分鐘，B3表示從7月8日制備后，于7月12日使用(測(cè)試2)；C1表示對(duì)氧磷處理10分鐘，C2表示以2-PAM再活化10分鐘，C3表示2-PAM再活化后的30分鐘后，C 4表示從7月12日制備后，于7月16日使用(測(cè)試3)；D1表示對(duì)氧磷處理10分鐘，D2表示不使用2-PAM，D3表示以2-PAM再活化10分鐘，D4表示2-PAM再活化后的30分鐘后(測(cè)試4)。由圖15可看出經(jīng)過(guò)0.126ppm對(duì)氧磷溶液抑制過(guò)后的電極，可在30分鐘之內(nèi)通過(guò)2-PAM的作用將其恢復(fù)約70％的活性，經(jīng)過(guò)抑制-恢復(fù)連續(xù)四次的測(cè)試發(fā)現(xiàn)酶活性并沒(méi)有明顯下降，顯示以2-PAM作為酶活性劑是適當(dāng)?shù)?，而電極有極大重復(fù)使用的潛力。
環(huán)境干擾因子探討針對(duì)環(huán)境中可能存在的干擾因子可能造成酶失活，或存在易被氧化的物質(zhì)造成電流噪聲產(chǎn)生。本發(fā)明針對(duì)溫度、pH、重金屬及有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響加以探討。圖16表示在不同溫度下酶活性的變化，橫座標(biāo)代表測(cè)量溫度與25℃之差(T-25)，縱座標(biāo)以電流變化表示抑制率。由圖16可看出當(dāng)測(cè)量溫度在10-40℃之間(橫座標(biāo)數(shù)值-15～15)時(shí)，酶活性隨著溫度上升而提高，顯示當(dāng)傳感器在現(xiàn)地使用時(shí)，溫度補(bǔ)償是必須的。本研究針對(duì)不同溫度下的酶活性表現(xiàn)作探討，選定25℃為基準(zhǔn)點(diǎn)，測(cè)量不同溫度下抑制率的變化情形，在10-40℃的范圍之間，發(fā)現(xiàn)不同溫度下酶活性表現(xiàn)呈一線性關(guān)系(如圖16所示)。
圖17顯示不同pH值下電流輸出信號(hào)的變化情形。由圖17可看出在pH8-9間電流輸出信號(hào)有明顯上升的情況發(fā)生。之所以有這種情況乃是因?yàn)楫?dāng)pH過(guò)高時(shí)，R-膽堿(R-Choline)會(huì)自動(dòng)被化學(xué)水解，導(dǎo)致電流輸出信號(hào)急速變大，造成誤判。由此可知本電極的適用范圍只在pH趨近于中性的情況下。
圖18及圖19分別表示有機(jī)溶劑及重金屬對(duì)酶活性的影響。由圖18A-圖18C可看出不論哪種有機(jī)溶劑對(duì)酶活性均或多或少有抑制性。針對(duì)在目前的放流水標(biāo)準(zhǔn)下(黑色長(zhǎng)條所示的濃度)，各有機(jī)溶劑對(duì)酶的活性抑制率均高。較幸運(yùn)的是丙酮(圖18C)最常的使用濃度僅約0.2％，而在此情況下丙酮幾乎對(duì)酶無(wú)任何活性抑制，顯示丙酮是農(nóng)藥萃取量測(cè)較適合的有機(jī)溶劑。在圖19A-圖19C中則可看出各種重金屬對(duì)酶活性均有影響，其中以銅離子(圖19C)對(duì)酶活性的抑制最為嚴(yán)重，當(dāng)水樣本中銅離子濃度達(dá)1ppm時(shí)，酶活性僅剩約一半。至于鉛(圖19D)、鐵(圖19B)、及鎘(圖19A)離子對(duì)酶活性的影響則明顯較小，影響程度的順序?yàn)殂~＞鎘＞鐵＞鉛。當(dāng)電極在實(shí)場(chǎng)運(yùn)用時(shí)，水中所含重金屬的情況是必須加以注意的。
至于SO42-對(duì)酶活性的影響可由圖20來(lái)表示。由圖20可看出在現(xiàn)行放流水標(biāo)準(zhǔn)之下，硫酸根的存在對(duì)酶幾乎沒(méi)有任何影響。
固定測(cè)量時(shí)間下電流抑制率與有機(jī)磷濃度的關(guān)系式與可應(yīng)用范圍傳統(tǒng)上，電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)極限往往落于ppm等級(jí)。如此高的檢測(cè)極限導(dǎo)致此類生物傳感器僅能用于高濃度的量測(cè)，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)污染物的監(jiān)控?zé)o法提供任何的幫助。通過(guò)上述諸多平臺(tái)技術(shù)的建立，本研究所開發(fā)的生物傳感器檢測(cè)極限可在極短的檢測(cè)時(shí)間上延伸至ppb等級(jí)。如此低的檢測(cè)極限遠(yuǎn)小于現(xiàn)行法規(guī)管制標(biāo)準(zhǔn)，因而可用于現(xiàn)地污染物監(jiān)控之用。圖21為檢測(cè)時(shí)間10分鐘25℃下有機(jī)磷濃度與電流抑制率的關(guān)系圖。由圖21可發(fā)現(xiàn)電流抑制率起初隨著有機(jī)磷濃度增加而呈線性上升，但當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥濃度超過(guò)130ppb，電流抑制率增至70％附近便不再改變。此現(xiàn)象暗示(1)有機(jī)磷農(nóng)藥可抑制的酶(或有機(jī)磷農(nóng)藥可接觸到的酶活性位置)僅占全部固定酶的70％；其余的30％的固定酶可能由于太深或立體方位的影響導(dǎo)致有機(jī)磷農(nóng)藥無(wú)法靠近；(2)130ppb的有機(jī)磷農(nóng)藥便足以抑制所有可接觸的酶活性位置，因而導(dǎo)致電流抑制率在高有機(jī)磷濃度下也不再升高。
將圖21中的線性范圍(畫圈處)重新繪圖示于圖22中。由圖22可看出本發(fā)明的生物微傳感器的有機(jī)磷農(nóng)藥可測(cè)定的范圍為10-130ppb。此可應(yīng)用范圍可通過(guò)增加酶固定量來(lái)加以擴(kuò)大。然而此時(shí)無(wú)機(jī)催化劑、金納米顆粒、吡咯單體與酶的最佳配比需針對(duì)不同電極大小(表面積)再次加以確認(rèn)。
電極表現(xiàn)的溫度補(bǔ)償針對(duì)電極于不同溫度下的表現(xiàn)進(jìn)行溫度補(bǔ)償測(cè)試。以25℃為基準(zhǔn)點(diǎn)，配合圖22中所得的電流抑制率與有機(jī)磷農(nóng)藥關(guān)系，選定已知有機(jī)磷濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)量，以測(cè)量結(jié)果進(jìn)行兩階段的溫度補(bǔ)償。第一階段為單一濃度的溫度補(bǔ)償；第二階段則為全濃度范圍(0-100ppb)的溫度補(bǔ)償。測(cè)量的有機(jī)磷濃度包括20、40、60、80及100ppb；溫度范圍則涵蓋10、18、25、32及40℃，結(jié)果如表2所示。表2中P1為通過(guò)圖22關(guān)系式換算所得的原始(未經(jīng)溫度補(bǔ)償)測(cè)量結(jié)果；P2為經(jīng)過(guò)單一濃度溫度補(bǔ)償后所得的結(jié)果；P3則為經(jīng)過(guò)全濃度范圍溫度補(bǔ)償所得的結(jié)果。以實(shí)際測(cè)量結(jié)果為基準(zhǔn)，將針對(duì)各有機(jī)磷濃度及全范圍有機(jī)磷農(nóng)藥所得的溫度補(bǔ)償方程式歸納于表3。進(jìn)行全濃度范圍的溫度修正時(shí)，當(dāng)?shù)陀?00ppb時(shí)，由式1c得出P3′，再由式1b得出Coeff.，最后由式1a得出P3；當(dāng)100ppb以上時(shí)，由式2c得出P3′，再由式2b得出Coeff.，最后由式2a得出P3。由表2可看出(比較標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與P2)，除了高濃度有機(jī)磷(100ppb)之外，通過(guò)單一濃度溫度補(bǔ)償方程式修正后的結(jié)果，無(wú)論環(huán)境溫度如何，其SD(標(biāo)準(zhǔn)差)均可小于2％；若通過(guò)全濃度范圍方程式來(lái)進(jìn)行溫度補(bǔ)償(比較標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與P3)，可看出當(dāng)環(huán)境溫度越偏離25℃，補(bǔ)償效果越差。當(dāng)環(huán)境溫度介于18-32℃時(shí)，全有機(jī)磷濃度補(bǔ)償后的結(jié)果，其SD＜7％；當(dāng)環(huán)境溫度低至10℃或高至40℃時(shí)，其SD有時(shí)會(huì)高達(dá)15％。當(dāng)進(jìn)行真實(shí)樣品真測(cè)試，可通過(guò)電流抑制率與濃度關(guān)系式及全范圍溫度補(bǔ)償方程式，得到樣品中有機(jī)磷的含量。若樣品溫度過(guò)高或過(guò)低，超出溫度補(bǔ)償范圍，建議應(yīng)回溫后再行測(cè)量。
表2各有機(jī)磷(對(duì)氧磷)濃度不同溫度條件下電極測(cè)量的原始數(shù)據(jù)與溫度補(bǔ)償后的結(jié)果
表3單一濃度與全濃度范圍的溫度補(bǔ)償方程式
電流輸出信號(hào)數(shù)字化通過(guò)一連串的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立固定測(cè)量時(shí)間下電流抑制率與有機(jī)磷濃度的關(guān)系式。將此相關(guān)式燒入芯片，建立信號(hào)擷取系統(tǒng)的連接，完成信號(hào)數(shù)字化，作為生物微傳感器的數(shù)字信號(hào)傳輸系統(tǒng)?；旧洗藬?shù)字信號(hào)傳輸系統(tǒng)的開發(fā)，主要分為軟、硬件兩部分進(jìn)行。硬件部分包括有掌上型電位計(jì)、信號(hào)傳輸線(RS232排線)、信號(hào)分析與記錄器(微處理器)等。而軟件主要是使用LabVIEW(Laboratory Virtual Instrument EngineeringWorkbench)套裝程序語(yǔ)言來(lái)控制硬件間的信號(hào)擷取、傳輸、分析與記錄等工作。LabVIEW是由National Instrument公司于1986年發(fā)展出的一種圖像式的程序語(yǔ)言，其主要用途是可以完全整合控制的通訊接口，例如GPIB、VXI、PXI、RS232，以及支持?jǐn)?shù)據(jù)呈現(xiàn)(data presentation)、數(shù)據(jù)儲(chǔ)存(data storage)、數(shù)據(jù)分析(data analysis)、數(shù)據(jù)擷取(data acquisition)、環(huán)境控制(serial instrument control)等功能。因?yàn)長(zhǎng)abVIEW中模塊化儀器Express VIs可使原型制作及測(cè)試混合信號(hào)設(shè)計(jì)及自動(dòng)產(chǎn)生測(cè)試程序碼；可確保Real-Time Desktop PC功能將在任何基于PC(PC-based)測(cè)試系統(tǒng)能最佳化系統(tǒng)穩(wěn)定度及績(jī)效；快速PDA數(shù)據(jù)擷取效能及DMM支持，建立客制化的可攜式數(shù)據(jù)擷取系統(tǒng)；藍(lán)牙支持-運(yùn)用無(wú)線藍(lán)牙科技與其他設(shè)備做溝通；50種全新數(shù)學(xué)函數(shù)功能-運(yùn)用增大LAPACK/BLAS基礎(chǔ)函數(shù)庫(kù)，增加精準(zhǔn)度及速度最高可達(dá)200％；超線程(Hyper-Threading)科技來(lái)增加最高至100％系統(tǒng)執(zhí)行力。在檢測(cè)的過(guò)程中，除了可得到污染物的濃度之外，亦可針對(duì)檢測(cè)條件，包括抑制時(shí)間、氧化電位、電流紀(jì)錄頻率作改變，可謂相當(dāng)便利。
真實(shí)樣品檢測(cè)為了確認(rèn)本研究所開發(fā)的生物微傳感器的實(shí)用性，針對(duì)市售蕃茄汁進(jìn)行初步測(cè)試，結(jié)果如圖23所示。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中先行對(duì)蕃茄汁原液進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的測(cè)量，而后在原液中摻入(spike)30ppb的對(duì)氧磷農(nóng)藥，觀察傳感器是否能對(duì)此做出準(zhǔn)確的測(cè)量。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，則先將蕃茄汁原液稀釋十倍，進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥測(cè)量，而后同樣地于此稀釋液中摻入30ppb的對(duì)氧磷農(nóng)藥，觀察傳感器的測(cè)量情況。實(shí)驗(yàn)中整體農(nóng)藥抑制時(shí)間為10分鐘。由圖23可清楚看出，蕃茄汁原液的有機(jī)磷農(nóng)藥濃度為25.6ppb，當(dāng)摻入30ppb對(duì)氧磷農(nóng)藥后，測(cè)量值變?yōu)?4.9ppb，而在另一實(shí)驗(yàn)中，稀釋十倍后，稀釋液中農(nóng)藥濃度已低于可測(cè)量范圍，而后再摻入30ppb后，稀釋液中的有機(jī)磷農(nóng)藥，又變成可測(cè)量其值為39.6ppb。由此結(jié)果可知本研究所開發(fā)的生物微傳感器可準(zhǔn)確地測(cè)量果汁中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留量，同時(shí)果汁中的干擾物質(zhì)，例如糖分、色素、懸浮固體與抗氧化劑等，并不會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果有任何的影響。顯示此系統(tǒng)可用于真實(shí)樣品的量測(cè)。
產(chǎn)業(yè)可利用性本發(fā)明結(jié)合生物技術(shù)與納米科技，開發(fā)以酶反應(yīng)為基礎(chǔ)的電化學(xué)生物微傳感器，可針對(duì)現(xiàn)地水環(huán)境中的污染物作快速且靈敏的檢測(cè)，相對(duì)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的化學(xué)分析方法，不僅可達(dá)到省時(shí)省錢的目的，同時(shí)在使用的方便性上更大幅提升。
以電聚合固定方法將酶，連同無(wú)機(jī)催化劑與金納米粒子一起固定于電極表面上，由于無(wú)機(jī)催化劑的存在，可降低檢測(cè)進(jìn)行時(shí)所需施加的電壓值，因而大幅縮小環(huán)境樣本中其他物質(zhì)被氧化所產(chǎn)生的噪聲。另外，通過(guò)金納米粒子的高比表面積與高導(dǎo)電性的特質(zhì)，可放大酶反應(yīng)所產(chǎn)生的電流信號(hào)，因此可大幅提升生物微傳感器的靈敏度，同時(shí)改善檢測(cè)極限，縮短檢測(cè)時(shí)間。依實(shí)驗(yàn)的結(jié)果建立電流輸出信號(hào)及分析物濃度二者之間的關(guān)系，配合電流信號(hào)輸出數(shù)字化系統(tǒng)的建立，所開發(fā)出流的生物微傳感器將兼具靈敏、快速、準(zhǔn)確、成本低廉與易上手的特點(diǎn)。
本發(fā)明生產(chǎn)的生物微傳感器重量小于1公斤，可在10分鐘的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，準(zhǔn)確檢測(cè)水樣本中的農(nóng)藥至10ppb以下，與傳統(tǒng)的生物傳感器相比，本發(fā)明的生物傳感器不但體積及重量較小，檢測(cè)極限下降兩個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)時(shí)間縮短，且檢測(cè)成本僅需約10元，在污染檢測(cè)的應(yīng)用面上將大幅提升。
以上所述僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例，然其并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟悉本項(xiàng)技術(shù)的人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可在此基礎(chǔ)上做進(jìn)一步的改進(jìn)和變化，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以本申請(qǐng)的權(quán)利要求
書所界定的范圍為準(zhǔn)。
附圖中符號(hào)的簡(jiǎn)單說(shuō)明如下101電極103電極105電極110溫度感應(yīng)器120處理單元122顯示單元S1電流信號(hào)S2溫度信號(hào)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，包括提供一液體樣品；使該樣品與至少一電極接觸，其中該電極表面有酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑固定其上；以及檢測(cè)由該電極輸出的電流信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該酶為乙酰膽堿酯酶或膽堿氧化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該無(wú)機(jī)催化劑為普魯士藍(lán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1、2或3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該電極表面是以電聚合方法固定。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑于聚吡咯層上。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該金納米顆粒的濃度為0.5-2.0ppm。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該電極為白金電極。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，其還包括使該樣品與一溫度感應(yīng)器接觸，檢測(cè)該樣品溫度。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該電流信號(hào)以樣品溫度進(jìn)行溫度補(bǔ)償處理。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該農(nóng)藥為有機(jī)磷或氨基甲酸鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的檢測(cè)農(nóng)藥的方法，其特征在于，該電極與溫度感應(yīng)器設(shè)置在一平板上。
13.一種生物微傳感器，其特征在于，包括至少一電極，用以檢測(cè)電流信號(hào)；一處理單元，用以接收處理該電流信號(hào)，且轉(zhuǎn)換該電流信號(hào)成為一濃度數(shù)據(jù)；以及一顯示單元，用以顯示該濃度數(shù)據(jù)；其中該電極表面以酶、金納米顆粒以及無(wú)機(jī)催化劑固定。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的生物微傳感器，其特征在于，該酶為乙酰膽堿酯酶或膽堿氧化酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的生物微傳感器，其特征在于，該無(wú)機(jī)催化劑為普魯士藍(lán)。
16.根據(jù)權(quán)利要求
13、14或15中任一項(xiàng)所述的生物微傳感器，其特征在于，該電極表面是以電聚合方法固定。
17.根據(jù)權(quán)利要求
16所述的生物微傳感器，其特征在于，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑于聚吡咯層上。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的生物微傳感器，其特征在于，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
19.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的生物微傳感器，其特征在于，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
20.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的生物微傳感器，其特征在于，該電極為白金電極。
21.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的生物微傳感器，其特征在于，其還包含一溫度感應(yīng)器，用以檢測(cè)溫度并傳送至該處理單元。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21所述的生物微傳感器，其特征在于，該電流信號(hào)以該檢測(cè)溫度進(jìn)行溫度補(bǔ)償處理。
23.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的生物微傳感器，其特征在于，該生物微傳感器用于檢測(cè)農(nóng)藥。
24.根據(jù)權(quán)利要求
23所述的生物微傳感器，其特征在于，該農(nóng)藥為有機(jī)磷或氨基甲酸鹽。
25.根據(jù)權(quán)利要求
21所述的生物微傳感器，其特征在于，該電極與溫度感應(yīng)器同時(shí)在一平板上。
26.一種降低電流噪聲的方法，其特征在于，該方法包括將金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑固定在一電極表面，其中該電極表面有酶固定。
27.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特征在于，該無(wú)機(jī)催化劑為普魯士藍(lán)。
28.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特征在于，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
29.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特征在于，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
30.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特征在于，該電極表面是以電聚合方法固定金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求
30所述的降低電流噪聲的方法，其特征在于，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，使金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑固定于聚吡咯層上。
32.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特征在于，該酶為乙酰膽堿酯酶或膽堿氧化酶。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥檢測(cè)方法、生物微傳感器及降低電流噪聲的方法。本發(fā)明提供一種檢測(cè)農(nóng)藥的方法及生物微傳感器，是利用表面固定酶、金納米顆粒及無(wú)機(jī)催化劑的電極檢測(cè)樣本的電流變化，并利用溫度補(bǔ)償調(diào)整所檢測(cè)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明的生物微傳感器可降低生物傳感器的檢測(cè)極限與環(huán)境中自然物質(zhì)的干擾，同時(shí)縮短檢測(cè)時(shí)間，達(dá)到現(xiàn)地即時(shí)檢測(cè)的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1991353SQ200510135222
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月27日
發(fā)明者巫鴻章, 李宜忠, 施錫璋, 張富龍, 林畢修平 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人生物技術(shù)開發(fā)中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan