本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種檢測(cè)血小板活化標(biāo)志物pac-1的試劑組合、試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、正常血液循環(huán)中血小板90%以上是靜息狀態(tài)，當(dāng)受到各種理化和生物因子，如adp、凝血酶或膠原等的刺激時(shí)，血小板的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并引起黏附、聚集和釋放反應(yīng)，稱為血小板活化。血小板膜糖蛋白（platelet?membrane?glycoprotein,?gp）是介導(dǎo)血小板活化的主要組分，按照分布部位不同可分為質(zhì)膜糖蛋白和顆粒膜糖蛋白。質(zhì)膜糖蛋白包括gpib、gpi?ⅱa、gpⅱb/ⅲa等，顆粒膜糖蛋白包括cd62p和cd63等。其中，gpⅱb/ⅲa是血小板上含量最豐富的膜糖蛋白，是ca2+依賴性二聚體復(fù)合物。在血小板靜息狀態(tài)下，gpⅱb/ⅲa復(fù)合物以非活性形式存在，不具備與纖維蛋白原等配體結(jié)合的能力，血小板活化后，gpⅱb/ⅲa會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，成為活化的gpⅱb/ⅲa復(fù)合物。gpⅱb/ⅲa活化后暴露的纖維蛋白原受體為pac-1（血小板激活復(fù)合物-1），即活化的gpⅱb/ⅲa復(fù)合物。pac-1是血小板聚集的必要條件，也是所有血小板激動(dòng)劑引起血小板聚集的最終共同環(huán)節(jié)，是血小板活化的早期標(biāo)志物，因此檢測(cè)血小板表面pac-1能精確地反映血小板活化的早期狀態(tài)。

2、許多疾病，尤其是心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展都和血小板活化狀態(tài)變化有關(guān)。通過(guò)檢測(cè)pac-1監(jiān)測(cè)血小板活化狀態(tài)的變化，對(duì)于急性冠狀動(dòng)脈綜合征（acs）、深靜脈血栓等血栓性疾病的風(fēng)險(xiǎn)和狀態(tài)的診斷與監(jiān)測(cè)，冠心病等心血管疾病的臨床用藥指導(dǎo)，抗血小板藥物及血小板治療的效果評(píng)估等具有重要意義。同時(shí)，除了心腦血管疾病，pac-1的檢測(cè)也可用于評(píng)估其他疾病狀態(tài)下的血小板功能，如慢性阻塞性肺疾病（copd）等。此外，pac-1的檢測(cè)對(duì)于研究血小板活化的分子機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有重要意義，有助于開發(fā)新的抗血小板治療策略。

3、傳統(tǒng)的pac-1檢測(cè)主要有流式細(xì)胞術(shù)（flow?cytometry,?fcm）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked?immunosorbent?assay,?elisa）等方法，這些方法在血小板活化研究中具有重要應(yīng)用。然而，這些方法存在一定的缺點(diǎn)，如流式細(xì)胞術(shù)需要專業(yè)的設(shè)備和檢測(cè)試劑，測(cè)試成本較高；此外，血小板比較容易在體外被激活，而流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，在處理樣本時(shí)稍有處理操作不當(dāng)就可能引起血小板的人工活化，繼而影響檢測(cè)結(jié)果，因此該檢測(cè)方法不適應(yīng)需要快速診斷的情況，并對(duì)技術(shù)人員的專業(yè)能力要求較高，既要掌握專業(yè)的儀器操作同時(shí)還要具備專業(yè)的數(shù)據(jù)分析能力。對(duì)于另一種方法elisa，目前僅供科研使用檢測(cè)pac-1，不得用于臨床診斷，因而限制了其應(yīng)用范圍；此外，elisa試劑盒中的試劑不能與其他批號(hào)或來(lái)源的elisa試劑盒試劑混合使用，限制了實(shí)驗(yàn)的靈活性；另外同樣的，elisa操作步驟復(fù)雜，存在清洗分離步驟，容易導(dǎo)致體外激活血小板，因此要求必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。

4、基于上述研究，開發(fā)成本較低，同時(shí)能夠方便快速及準(zhǔn)確地檢測(cè)pac-1的試劑組合/試劑盒具有較好的應(yīng)用前景和研究意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問(wèn)題

2、現(xiàn)有檢測(cè)pac-1的試劑盒檢測(cè)pac-1時(shí)操作復(fù)雜，用時(shí)較長(zhǎng)，成本較高，且實(shí)驗(yàn)條件苛刻，不能滿足臨床檢測(cè)pac-1的實(shí)際需求。

3、技術(shù)方案

4、本發(fā)明第一方面提供了一種檢測(cè)血小板活化標(biāo)志物pac-1的試劑組合，所述試劑組合包括：第一檢測(cè)探針、第二檢測(cè)探針、第三檢測(cè)探針和第四檢測(cè)探針；所述第一檢測(cè)探針由dna1和pac-1抗體1偶聯(lián)而成；所述第二檢測(cè)探針由pac-1抗體2和dna2偶聯(lián)而成；所述第三檢測(cè)探針是標(biāo)記熒光分子的dna3；所述第四檢測(cè)探針是結(jié)合在載體分子上的抗氧化劑；其中，所述dna1含有第一配對(duì)序列和第二配對(duì)序列，所述dna2具有第三配對(duì)序列和第四配對(duì)序列，所述dna3含有第五配對(duì)序列和第六配對(duì)序列；所述第三配對(duì)序列與所述第二配對(duì)序列互補(bǔ)，所述第五配對(duì)序列與所述第四配對(duì)序列互補(bǔ)，所述第六配對(duì)序列與所述第一配對(duì)序列互補(bǔ)。

5、在一些實(shí)施例中，所述dna1的3'端修飾nh2c7；所述dna2的5'端修飾nh2c6；所述dna3的5'端修飾nh2c6。

6、在一些實(shí)施例中，所述pac-1抗體1能與pac-1的第一抗原表位特異性結(jié)合；所述pac-1抗體2能與pac-1的第二抗原表位特異性結(jié)合。

7、在一些實(shí)施例中，所述pac-1抗體1的克隆號(hào)為4o21；所述pac-1抗體2的克隆號(hào)為iva30。

8、在一些實(shí)施例中，所述dna3的5'端通過(guò)nh2c6與所述熒光分子偶聯(lián)；所述熒光分子是吖啶酯（ae）。

9、在一些實(shí)施例中，所述載體分子為氧化石墨烯。

10、在一些實(shí)施例中，所述dna1（堿基序列如seq?id?no.1所示）的序列如下：5'-acgctgagttatcaacgactttttttatcacatcaggctctagcgtatgctattg-nh2c7-3'；所述dna2（堿基序列如seq?id?no.2所示）的序列如下：5'-nh2c6-tacgtccagaactttaccaaaccacaccctttttttgtcgttggctgagattc-3'；所述標(biāo)記熒光分子的dna3（堿基序列如seq?id?no.3所示）的序列如下：5'-ae-nh2c6-cgatctcagcaactcagcagcg-3'；其中，所述第一配對(duì)序列為gctgagtt；所述第二配對(duì)序列為caacgac；所述第三配對(duì)序列為gtcgttg；所述第四配對(duì)序列為gctgagat；所述第五配對(duì)序列為atctcagc；所述第六配對(duì)序列為aactcagc。

11、在一些實(shí)施例中，所述dna1通過(guò)偶聯(lián)劑與pac-1抗體1偶聯(lián)，所述dna2通過(guò)偶聯(lián)劑與pac-1抗體2偶聯(lián)；所述偶聯(lián)劑是雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽（bs3）。

12、在一些實(shí)施例中，所述氧化石墨烯上通過(guò)縮合劑與所述抗氧化劑結(jié)合；所述縮合劑是氧化亞砜縮合劑和/或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。

13、在一些實(shí)施例中，所述氧化石墨烯上的羧基通過(guò)氧化亞砜縮合劑與所述抗氧化劑上的羥基結(jié)合，所述氧化石墨烯上的羧基通過(guò)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與所述抗氧化劑上的氨基結(jié)合。

14、在一些實(shí)施例中，所述抗氧化劑選自大麻二酚、維生素c、維生素e、茶多酚或谷胱甘肽中的一種或幾種，優(yōu)選維生素c。

15、本發(fā)明第二方面提供了一種檢測(cè)血小板活化標(biāo)志物pac-1的試劑盒，其包括：

16、第一容器，儲(chǔ)存dna1和pac-1抗體1的偶聯(lián)物；

17、第二容器，儲(chǔ)存dna2和pac-1抗體2的偶聯(lián)物；

18、第三容器，儲(chǔ)存標(biāo)記ae的dna3；

19、第四容器，儲(chǔ)存結(jié)合氧化石墨烯的抗氧化劑。

20、在一些實(shí)施例中，上述試劑盒中所述dna1（堿基序列如seq?id?no.1所示）的序列如下：5'-acgctgagttatcaacgactttttttatcacatcaggctctagcgtatgctattg-nh2c7-3'；所述dna2（堿基序列如seq?id?no.2所示）的序列如下：5'-nh2c6-tacgtccagaactttaccaaaccacaccctttttttgtcgttggctgagattc-3'；所述標(biāo)記熒光分子的dna3（堿基序列如seq?id?no.3所示）的序列如下：5'-ae-nh2c6-cgatctcagcaactcagcagcg-3'。

21、在一些實(shí)施例中，上述試劑盒中所述pac-1抗體1的克隆號(hào)為4o21；所述pac-1抗體2的克隆號(hào)為iva30。

22、在一些實(shí)施例中，上述試劑盒中所述抗氧化劑為大麻二酚、維生素c、維生素e、茶多酚或谷胱甘肽中的一種或幾種。

23、本發(fā)明第三方面提供了使用上述任意一項(xiàng)所述試劑組合檢測(cè)血小板活化標(biāo)志物pac-1的方法，具體步驟如下：

24、a.?將第一檢測(cè)探針、第二檢測(cè)探針、第三檢測(cè)探針以及第四檢測(cè)探針混合，得到檢測(cè)溶液，再將待測(cè)樣本與所述檢測(cè)溶液混合，置于36℃~37℃條件下溫育5～10?min；

25、b.?加入化學(xué)發(fā)光底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中pmt檢測(cè)模塊進(jìn)行光信號(hào)采集，得到待測(cè)樣品的化學(xué)發(fā)光值；

26、c.?儀器自動(dòng)調(diào)用校準(zhǔn)曲線，將所述待測(cè)樣品的化學(xué)發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線中即可報(bào)出樣品中物質(zhì)的濃度。

27、在一些實(shí)施例中，上述方法中的待測(cè)樣本為全血樣本。

28、在一些實(shí)施例中，上述方法中的所述化學(xué)發(fā)光底物為過(guò)氧化氫的堿性溶液。

29、在一些實(shí)施例中，所述過(guò)氧化氫的堿性溶液的ph為9.0，過(guò)氧化氫濃度為3%v/v。

30、在一些實(shí)施例中，所述堿性溶液為10?mm的pbs緩沖溶液。

31、在一些實(shí)施例中，上述方法中的所述檢測(cè)溶液中所述第一檢測(cè)探針的終濃度為1～20?nm，優(yōu)選5～20?nm，更優(yōu)選10?nm；所述第二檢測(cè)探針的終濃度為1～20?nm，優(yōu)選5～20nm，更優(yōu)選10?nm；所述第三檢測(cè)探針的終濃度為0.05～0.2?μm，優(yōu)選0.15?μm；所述第四檢測(cè)探針的終濃度為20～25?μg/ml，優(yōu)選20?μg/ml。

32、在一些實(shí)施例中，上述方法中的所述全血樣本與步驟a中所述檢測(cè)溶液的體積比為1：10~20，優(yōu)選1：20；所述化學(xué)發(fā)光底物與所述檢測(cè)溶液的體積比為0.8~1：1，優(yōu)選1：1。

33、在一些實(shí)施例中，上述方法中所述第一檢測(cè)探針、第二檢測(cè)探針及第三檢測(cè)探針間的濃度比為1：1：5~20。

34、技術(shù)效果

35、可使用全血檢測(cè)：本發(fā)明試劑組合/試劑盒使用均相化學(xué)發(fā)光法可以對(duì)全血樣本進(jìn)行直接檢測(cè)，因?yàn)槭蔷?，無(wú)需復(fù)雜的預(yù)處理步驟，如離心分離血漿或血清，這大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程并縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)避免了體外樣本可能經(jīng)歷的血小板活化，能夠反映體內(nèi)血小板活化的真實(shí)狀態(tài)，提供更準(zhǔn)確的血小板活化狀態(tài)評(píng)估。

36、反應(yīng)時(shí)間短：本發(fā)明試劑組合/試劑盒檢測(cè)pac-1的流程所需時(shí)間非常短，一般在5~10?min內(nèi)完成，這使得本發(fā)明試劑組合/試劑盒非常適合于需要快速診斷和迅速做出治療決策的臨床環(huán)境。

37、操作簡(jiǎn)單：本發(fā)明試劑組合/試劑盒檢測(cè)pac-1的操作流程較為簡(jiǎn)單，易于在不同的醫(yī)療環(huán)境中實(shí)施，包括那些資源有限的地區(qū)。

38、成本低：由于省去了復(fù)雜的分離和清洗步驟，以及可能需要的昂貴設(shè)備，使用本發(fā)明試劑組合/試劑盒檢測(cè)pac-1的成本相對(duì)較低，使得大規(guī)模的檢測(cè)更加經(jīng)濟(jì)，實(shí)用性更強(qiáng)。

39、對(duì)操作者要求一般：使用本發(fā)明試劑組合/試劑盒檢測(cè)pac-1，無(wú)需較高的專業(yè)技術(shù)操作能力和數(shù)據(jù)分析能力，測(cè)試所得結(jié)果易于解讀，不需要復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析。