本發(fā)明涉及蛋白熒光免疫檢測(cè)，尤其涉及一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、阿爾茲海默癥(al?zheimer’d?i?sease，ad)，俗稱老年癡呆，是一種發(fā)病于老年期，進(jìn)程緩慢、隨著時(shí)間不斷惡化的持續(xù)性神經(jīng)功能障礙，也是大腦衰老及神經(jīng)退化的主要疾病類(lèi)型。此疾病早期以智能損壞為主，臨床依次表現(xiàn)為：記憶、認(rèn)知障礙以及后期的人格和行為改變等，典型病理學(xué)特征主要以細(xì)胞外老年斑形成及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)tau蛋白是一種微管結(jié)合蛋白，主要功能是穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu),促進(jìn)微管成核、延長(zhǎng)與解聚。tau蛋白活性的發(fā)揮依賴于正常的磷酸化與去磷酸化平衡。當(dāng)tau蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化(磷酸化水平失衡)時(shí),其與微管蛋白的結(jié)合能力降低,微管穩(wěn)定性下降,細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏繞,從而發(fā)生神經(jīng)退行性病變。腦脊液中的磷酸化tau-181蛋白(以下簡(jiǎn)稱p-tau-181)已經(jīng)被認(rèn)為是nft的標(biāo)志物，能夠支持臨床ad的診斷和輕度認(rèn)知障礙的預(yù)測(cè)。

2、目前目前正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像(pos?itron?emi?ss?ion?tomography，pet)和檢測(cè)腦脊液中的標(biāo)志物，成為診斷ad常用的技術(shù)手段。血液中ad標(biāo)志物的含量要遠(yuǎn)低于腦脊液中的含量，所以在血液中檢測(cè)ad標(biāo)志物需要更靈敏的檢測(cè)方法。血液中標(biāo)志物的檢測(cè)也有使用simoa單分子檢測(cè)平臺(tái)和merck?smcxpro單分子免疫檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。然而腦脊液的檢查是一種有創(chuàng)檢查，其他平臺(tái)的檢測(cè)費(fèi)用高，操作復(fù)雜，限制了這些方法的大規(guī)模使用。

3、目前已上市的p-tau-181試劑盒不多，銷(xiāo)售較好的時(shí)是安群生物，有酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法，但靈敏度不高，空白限不大于5pg/ml。simoa單分子檢測(cè)平臺(tái)和merck?smcxpro單分子免疫檢測(cè)平臺(tái)，檢測(cè)靈敏度高，但檢測(cè)費(fèi)用高，設(shè)備操作復(fù)雜，限制了這些方法的大規(guī)模使用。

4、基于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種檢測(cè)成本低，取樣簡(jiǎn)單，靈敏度高，可以定量，操作簡(jiǎn)單和快速檢測(cè)血液中p-tau-181的熒光免疫試檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，而提出的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，包括以下步驟：

4、步驟1，磁珠包被p-tau-181單克隆抗體，得到試劑1；

5、步驟2，生物素標(biāo)記tau單克隆抗體，得到試劑2；

6、步驟3，制備sape-pe，得到試劑3；

7、步驟4，取96孔酶標(biāo)板，每孔加入lp-tau-181抗原和試劑1、試劑2，于孵育箱中孵育；磁吸，棄上清，使用pbst清洗液清洗三次，再加入試劑3；磁吸，棄上清，使用pbst清洗液清洗；每孔加入pbs重懸磁珠，在流式細(xì)胞儀上上樣檢測(cè)。

8、優(yōu)選地，所述磁珠包被p-tau-181單克隆抗體，得到試劑1的具體過(guò)程為：

9、磁珠用0.1m?mes(ph5.0)集磁并清洗兩次，加入edc，旋轉(zhuǎn)儀上活化30min，集磁并清洗兩次后，按照抗體與磁珠質(zhì)量比1：50加入抗體，旋轉(zhuǎn)儀上反應(yīng)2h，再加入封閉液，旋轉(zhuǎn)儀上封閉30min；組后清洗液清洗，得到反應(yīng)物，采用反應(yīng)物作為試劑1。

10、優(yōu)選地，所述反應(yīng)物作為試劑1的使用濃度為40μg/ml。

11、優(yōu)選地，所述生物素標(biāo)記tau單克隆抗體，得到試劑2的具體過(guò)程為：生物素與抗體按照20:1摩爾比混合，室溫反應(yīng)40min，反應(yīng)物經(jīng)脫鹽柱純化得到標(biāo)記物，采用標(biāo)記物作為試劑2。

12、優(yōu)選地，所述標(biāo)記物作為試劑2的使用濃度為1μg/ml。

13、優(yōu)選地，所述制備sape-pe，得到試劑3的具體過(guò)程為：

14、首先將生物素與抗體按照20:1摩爾比混合制備bio-pe，然后將sape和上面制備的bio-pe稀釋到0.1mg/ml，按照體積比4：1混合，37℃反應(yīng)1h，得到sape-pe，采用sape-pe作為試劑3。

15、優(yōu)選地，所述sape-pe作為試劑3的使用濃度為1μg/ml。

16、優(yōu)選地，所述步驟4的具體過(guò)程為：取96孔酶標(biāo)板，每孔加入50μlp-tau-181抗原+50μl試劑1+50μl試劑2，于37℃孵育箱中孵育30min；磁吸，棄上清，使用200μl的pbst清洗液清洗三次，再加入50μl試劑3；磁吸，棄上清，使用200μl的pbst清洗液清洗三次；每孔加入60μl的pbs重懸磁珠，在流式細(xì)胞儀上上樣檢測(cè)。

17、優(yōu)選地，所述流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)定為：速度選擇中速，停止條件10μl，閾值fsc>50000，分析fsc圈門(mén)臨界值200，圈中區(qū)為r1，pe圈門(mén)臨界值900，圈中區(qū)為r2，分析r2/r1的比值(即陽(yáng)性百分比)。

18、優(yōu)選地，所述磁珠為羧基磁珠，粒徑為3um，所述磁珠包被的p-tau-181抗體為識(shí)別p-tau-181蛋白的單抗。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

20、(1)本發(fā)明反應(yīng)體系使用目前最亮的熒光素--藻紅蛋白(簡(jiǎn)稱pe)作為檢測(cè)底物，并采用sape與bio-pe循環(huán)反應(yīng)，在使單個(gè)抗體攜帶更多的熒光分子供識(shí)別，從而提高檢測(cè)的靈敏度。

21、(2)本發(fā)明的反應(yīng)最終物質(zhì)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在流式細(xì)胞儀的激光光器照射下依次識(shí)別單個(gè)磁珠及激發(fā)磁珠表面的sape-pe，類(lèi)似單分子技術(shù)，從而提高檢測(cè)的靈敏度。

技術(shù)特征：

1.一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述磁珠包被p-tau-181單克隆抗體，得到試劑1的具體過(guò)程為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述反應(yīng)物作為試劑1的使用濃度為40～50μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述生物素標(biāo)記tau單克隆抗體，得到試劑2的具體過(guò)程為：生物素與抗體按照20:1摩爾比混合，室溫反應(yīng)40～50min，反應(yīng)物經(jīng)脫鹽柱純化得到標(biāo)記物，采用標(biāo)記物作為試劑2。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述標(biāo)記物作為試劑2的使用濃度為1～2μg/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述制備sape-pe，得到試劑3的具體過(guò)程為：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述sape-pe作為試劑3的使用濃度為1～2μg/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟4的具體過(guò)程為：取96孔酶標(biāo)板，每孔加入50μlp-tau-181抗原+50μl試劑1+50μl試劑2，于37℃孵育箱中孵育30min；磁吸，棄上清，使用200μl的pbst清洗液清洗三次，再加入50μl試劑3；磁吸，棄上清，使用200μl的pbst清洗液清洗三次；每孔加入60μl的pbs重懸磁珠，在流式細(xì)胞儀上上樣檢測(cè)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)定為：速度選擇中速，停止條件10μl，閾值fsc>50000，分析fsc圈門(mén)臨界值200，圈中區(qū)為r1，pe圈門(mén)臨界值900，圈中區(qū)為r2，分析r2/r1的比值(即陽(yáng)性百分比)。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于：所述磁珠為羧基磁珠，粒徑為3um，所述磁珠包被的p-tau-181抗體為識(shí)別p-tau-181蛋白的單抗。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及蛋白熒光免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種提升靈敏度的磷酸化181tau蛋白熒光免疫檢測(cè)方法，包括以下步驟：步驟1，磁珠包被p?tau?181單克隆抗體，得到試劑1；步驟2，生物素標(biāo)記tau單克隆抗體，得到試劑2；步驟3，制備SAPE?PE，得到試劑3；步驟4，取96孔酶標(biāo)板，每孔加入Lp?tau?181抗原和試劑1、試劑2，于孵育箱中孵育；磁吸，棄上清，使用PBST清洗液清洗三次，再加入試劑3；磁吸，棄上清，使用PBST清洗液清洗；每孔加入PBS重懸磁珠，在流式細(xì)胞儀上上樣檢測(cè)。本發(fā)明反應(yīng)體系使用目前最亮的熒光素??藻紅蛋白(簡(jiǎn)稱PE)作為檢測(cè)底物，并采用SAPE與BIO?PE循環(huán)反應(yīng)，在使單個(gè)抗體攜帶更多的熒光分子供識(shí)別，從而提高檢測(cè)的靈敏度。

技術(shù)研發(fā)人員：顏菁,毛玉梅,李鳳娟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海邦先醫(yī)療科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26