本發(fā)明涉及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)，具體地說，涉及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測司美格魯肽的方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、司美格魯肽(semaglutide，cas編號900463-68-2)是長效glp-1類似物，用于治療ii型糖尿病，司美格魯肽除降低血糖之外還有減肥和保護(hù)心血管的功效。

2、現(xiàn)有方法靈敏度低，另外，現(xiàn)有方法采用利拉魯肽作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)而非司美格魯肽的同位素內(nèi)標(biāo)，對于使用利拉魯肽的患者，檢測司美格魯肽水平，造成干擾。此外，目前常用的前處理方法大多為手工前處理操作，費時長，精密度較差，不容易標(biāo)準(zhǔn)化?，F(xiàn)有方法多應(yīng)用于動物，較少應(yīng)用于人群。因此，亟待開發(fā)一種高效的用于檢測患者體內(nèi)司美格魯肽含量的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測司美格魯肽的方法及檢測試劑盒。

2、為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測司美格魯肽的方法，包括以下步驟：

3、a、配制不同濃度的司美格魯肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

4、b、向標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入同位素內(nèi)標(biāo)混勻，再加入甲醇（色譜純），渦旋后離心，取上清；然后用max磁珠提取，具體包括：向上清中加入氨水（調(diào)節(jié)ph值），與max磁珠混合，然后依次用弱洗液、強洗液清洗磁珠，最后用洗脫液進(jìn)行洗脫，收集樣本進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；

5、c、用待測樣品替代步驟b中的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用相同方法進(jìn)行檢測；

6、d、根據(jù)待測樣品的檢測結(jié)果，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測樣品中司美格魯肽的濃度。

7、所述同位素內(nèi)標(biāo)為司美格魯肽中的兩個亮氨酸進(jìn)行 d 10標(biāo)記的多肽。

8、所述弱洗液為1~10%（優(yōu)選5%）氨水。

9、所述強洗液由水、甲醇和乙腈按1：（1-5）：（1-5）體積比（優(yōu)選體積比1:2:2）混合而成。

10、所述洗脫液由0.01%~15%（優(yōu)選8%）甲酸水溶液、甲醇和乙腈按1：（1-5）：（1-5）體積比（優(yōu)選體積比1:2:2）混合而成。

11、進(jìn)一步地，步驟a中用于配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑是由含0.01%~15%（優(yōu)選2.5%）甲酸的甲醇溶液與乙腈按1：（1-5）體積比（優(yōu)選體積比1:1）混合而成。

12、進(jìn)一步地，步驟b具體為：向50~200?ul標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入5~50?ul?100~500ng/ml同位素內(nèi)標(biāo)溶液、100~500?ul甲醇（色譜純），渦旋10min，然后13000×g離心10min，取100~500?ul上清，加入100~500?ul?5%~10%氨水，并與50~500ul濃度為0.1~10mg/ml的max磁珠溶液混合，然后依次用50~200?ul弱洗液、50~200?ul強洗液、50~200?ul洗脫液進(jìn)行弱洗、強洗及洗脫，收集樣本準(zhǔn)備上機檢測。

13、優(yōu)選地，向100?ul標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入20?ul?200ng/ml同位素內(nèi)標(biāo)溶液、300?ul甲醇，渦旋10min，然后13000×g離心10min，取300?ul上清，加入300?ul?10%氨水，并與200ul濃度為1mg/ml的max磁珠溶液混合，然后依次用200?ul弱洗液、200?ul強洗液、100?ul洗脫液進(jìn)行弱洗、強洗及洗脫，收集樣本準(zhǔn)備上機檢測。

14、其中，用于配制同位素內(nèi)標(biāo)溶液的試劑為1%~100%（優(yōu)選40%）乙腈。

15、步驟b中所用液相色譜柱為：acquitytmpremier?hss?t3?1.8um?vanguardtmfit2.1mm×100mm?column。

16、液相色譜檢測條件為：流速0.3~0.5ml/min（優(yōu)選0.3ml/min），柱溫40℃；進(jìn)樣量5ul。

17、按以下程序進(jìn)行梯度洗脫：

18、

19、其中，流動相a：0.1%~0.5%甲酸水溶液，流動相b：含0%~0.5%甲酸的乙腈。優(yōu)選地，流動相a：0.1%甲酸水溶液，流動相b：乙腈。

20、進(jìn)一步地，步驟b中進(jìn)行質(zhì)譜檢測的條件為：質(zhì)譜采用waters?xevo?tq-s，采用電噴霧電離源，正模式采集，毛細(xì)管電壓0.8kv，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度600℃，脫溶劑氣：800l/hr，錐孔氣：150l/hr。采用masslynx軟件完成對數(shù)據(jù)的采集和定性定量分析。

21、質(zhì)譜中所產(chǎn)生的用于定性檢測司美格魯肽的離子對為：母離子1028.8和子離子529.8，母離子1028.8和子離子1109.3。

22、用于定量檢測司美格魯肽的離子對為：母離子1028.8和子離子689.8。

23、質(zhì)譜中所產(chǎn)生的用于定性檢測所述同位素內(nèi)標(biāo)的離子對為：母離子1034.3和子離子1150.9。

24、用于定量檢測所述同位素內(nèi)標(biāo)的離子對為：母離子1034.3和子離子530.3。

25、采用本發(fā)明方法，待測樣品中司美格魯肽的線性檢測范圍為0.1~500ng/ml。

26、待測樣品可以是患者的血液樣本等。

27、第二方面，本發(fā)明提供一種用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測司美格魯肽的試劑盒，所述試劑盒包括司美格魯肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液、同位素內(nèi)標(biāo)、max磁珠、弱洗液、強洗液、洗脫液等中的至少一種。

28、借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果：

29、（一）本發(fā)明首次提供針對樣本中司美格魯肽檢測的成熟可快速應(yīng)用到臨床的方法，采用自動化磁珠前處理方法，節(jié)約勞動力的同時，能提高檢測精密度。此外，也能進(jìn)一步提高該方法的自動化，提高工作效率，降低對專業(yè)技術(shù)人員的需求。

30、（二）通過對司美格魯肽中的亮氨酸進(jìn)行 d 10標(biāo)記，采用同位素標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行方法校準(zhǔn)，且定量及定性離子對的使用均為首次。

31、（三）該方法精密度較好，重復(fù)性和實驗室內(nèi)不精密度cv均<7%。

技術(shù)特征：

1.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測司美格魯肽的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中用于配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑是由含0.01%~15%甲酸的甲醇溶液與乙腈按1：（1-5）體積比混合而成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b具體為：向50~200?ul標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入5~50?ul?100~500ng/ml同位素內(nèi)標(biāo)溶液、100~500?ul甲醇，渦旋10min，然后13000×g離心10min，取100~500?ul上清，加入100~500?ul?5%~10%氨水，并與50~500?ul濃度為0.1~10mg/ml的max磁珠溶液混合，然后依次用50~200?ul弱洗液、50~200?ul強洗液、50~200?ul洗脫液進(jìn)行弱洗、強洗及洗脫，收集樣本準(zhǔn)備上機檢測；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中所用液相色譜柱為：acquitytmpremier?hss?t3?1.8um?vanguardfit?2.1mm×100mm?column；

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中進(jìn)行質(zhì)譜檢測的條件為：質(zhì)譜采用waters?xevo?tq-s，采用電噴霧電離源，正模式采集，毛細(xì)管電壓0.8kv，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度600℃，脫溶劑氣：800l/hr，錐孔氣：150l/hr。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，質(zhì)譜中所產(chǎn)生的用于定性檢測司美格魯肽的離子對為：母離子1028.8和子離子529.8，母離子1028.8和子離子1109.3；

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，質(zhì)譜中所產(chǎn)生的用于定性檢測所述同位素內(nèi)標(biāo)的離子對為：母離子1034.3和子離子1150.9；

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，司美格魯肽的線性檢測范圍為0.1~500ng/ml。

9.用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測司美格魯肽的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括司美格魯肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液、同位素內(nèi)標(biāo)、max磁珠、弱洗液、強洗液、洗脫液中的至少一種；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測司美格魯肽的方法及檢測試劑盒。本發(fā)明首次提供針對樣本中司美格魯肽檢測的成熟可快速應(yīng)用到臨床的方法，采用自動化磁珠前處理方法，節(jié)約勞動力的同時，能提高檢測精密度。此外，也能進(jìn)一步提高該方法的自動化，提高工作效率，降低對專業(yè)技術(shù)人員的需求。通過對司美格魯肽中的亮氨酸進(jìn)行d10標(biāo)記，采用同位素標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行方法校準(zhǔn)，檢測精密度好，可在臨床檢測中推廣應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：禹松林,邱玲,李洪雷,王丹晨,馬曉麗
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26