本實用新型屬于醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體的試紙。

背景技術(shù)：

丙型肝炎是一種全球性傳染病。在我國屬于乙類傳染病的前五位，危害十分嚴(yán)重。丙型肝炎病毒(HCV)是1989年發(fā)現(xiàn)的非甲非乙肝炎病毒。主要通過輸血、靜脈注射等途徑傳播，危害大、病死率較高，目前市場尚無療效明確的藥物和疫苗進行治療和預(yù)防。因此研制HCV的快速且能廣泛應(yīng)用的檢測方法具有重要意義。

HCV抗體檢測是目前使用最廣泛的檢測方法，但其缺點是存在較長的“窗口期”，HCV感染后至HCV抗體產(chǎn)生之前還有一段約40-70天的較長時期(平均66天)，此時獻血員已被感染并具有傳染性，應(yīng)用目前的第三代和四代EIA檢測試劑都不能檢出，稱為感染后血清陽轉(zhuǎn)前的“窗口期”(preseroconversion window phase,PWP)。PWP的存在，是輸血安全的重要威脅之一，使受血者依然有輸入抗HCV篩選陰性的血液而感染HCV的危險。

HCV核心抗原是HCV感染的早期標(biāo)志，在HCV RNA出現(xiàn)后的1-2天內(nèi)即出現(xiàn)HCV核心抗原，且與HCV RNA的水平相平行，可以作為HCV復(fù)制的標(biāo)志。有研究表明，HCV核心抗原檢測與抗體檢測相比，HCV核心抗原的檢測可使檢測的“窗口期”平均提前49天，縮短“窗口期”感染的風(fēng)險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的窗口期長的問題，本實用新型提供了一種快速聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體的試紙，其具有操作簡單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等特點。

本實用新型所采用的技術(shù)方案為：

一種快速聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體的試紙，包括多個試紙條和試紙盒，每個所述試紙包括樣品墊，所述樣品墊的一端壓覆有膠體金墊，所述膠體金墊上吸附有膠體金標(biāo)記的HCV核心抗原單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的HCV重組融合抗原，所述膠體金墊的另一端壓覆有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的另一端壓覆于吸樣墊之下，所述硝酸纖維素膜上包被了三條線，分別為第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線；

進一步的，所述試紙盒包括殼體，所述殼體內(nèi)設(shè)有卷軸，所述殼體上開設(shè)有出紙口，多個所述試紙條順次連接且相連的兩個所述試紙條之間設(shè)置有易撕刻痕，多個所述試紙條卷繞在所述卷軸上，且所述試紙條可從出紙口伸出。

本實用新型利用膠體金標(biāo)記HCV重組融合抗原和HCV核心抗原單克隆抗體，在NC膜上包被相應(yīng)配對的HCV重組融合抗原和HCV核心抗原單克隆抗體，運用夾心法檢測待測樣品中的HCV抗體和HCV核心抗原，具有操作簡單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點，不僅可以縮短檢測的“窗口期”，又可以用于HCV早期篩查和HCV臨床輔助診斷，同時也可以提高工作效率、節(jié)約成本。

另一方面，將試紙卷繞在卷筒中，保護試紙，免受污染，并將試紙從出紙口中伸出，采用激光技術(shù)將刻痕刻制在試紙上，在使用時，將其通過易撕刻痕撕成小條，取用便捷，使用方便。

進一步的，所述樣品墊、所述膠體金墊、所述硝酸纖維素膜和所述吸樣墊均粘貼在PVC支撐板上。

進一步的，每個所述試紙條的尾端設(shè)有一個定位孔，所述殼體上凸設(shè)有一個定位柱，所述定位孔的直徑與所述定位柱的直徑相等。

將定位孔插在定位柱上，可使外露的試紙條固定在殼體上，將殼體作為試紙條的一個握持部件，方便進行檢測，檢測完之后，將試紙條撕下，防止污染其他試紙條。

進一步的，每個所述試紙條的表面上均可移除的粘附有覆膜，所述覆膜自所述定位孔覆蓋至所述所述試紙條的頂端。

試紙條上的覆膜能夠防止試紙與空氣直接接觸，減少試紙中的化學(xué)試劑氧化現(xiàn)象，增加試紙的保質(zhì)期，另外可以防止試紙表面不小心被污染弄臟，利于保證檢測效果。

進一步的，所述出紙口的寬度為所述試紙條寬度的1.5～2倍。

本實用新型的有益效果為：

1.利用膠體金標(biāo)記HCV重組融合抗原和HCV核心抗原單克隆抗體，在NC膜上包被相應(yīng)配對的HCV重組融合抗原和HCV核心抗原單克隆抗體，運用夾心法檢測待測樣品中的HCV抗體和HCV核心抗原，具有操作簡單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點，不僅可以縮短檢測的“窗口期”，又可以用于HCV早期篩查和HCV臨床輔助診斷，同時也可以提高工作效率、節(jié)約成本。

2.將試紙卷繞在卷筒中，保護試紙，免受污染，并將試紙從出紙口中伸出，采用激光技術(shù)將刻痕刻制在試紙上，在使用時，將其通過易撕刻痕撕成小條，取用便捷，使用方便。

附圖說明

為了更清楚地說明本實用新型實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本實用新型的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本實用新型的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是圖2的剖視圖。

圖中1-樣品墊；2-膠體金墊；3-硝酸纖維素膜；T1線-第一檢測線；T2線-第二檢測線；C線-質(zhì)控線；4-吸樣墊；5-支撐板；11-試紙條；12-殼體；13-定位柱；14-定位孔；15-卷軸。

具體實施方式

為使本實用新型的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本實用新型的技術(shù)方案進行詳細的描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本實用新型一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本實用新型中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本實用新型所保護的范圍。

如圖1～3所示，一種快速聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體的試紙，包括多個試紙條11和試紙盒，每個所述試紙包括樣品墊1，所述樣品墊的一端壓覆有膠體金墊2，所述膠體金墊2上吸附有膠體金標(biāo)記的HCV核心抗原單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的HCV重組融合抗原，所述膠體金墊2的另一端壓覆有硝酸纖維素膜(NC膜)3，所述硝酸纖維素膜3的另一端壓覆于吸樣墊4之下，所述硝酸纖維素膜4上包被了三條線，分別為第一檢測線T1、第二檢測線T2和質(zhì)控線C。所述樣品墊、所述膠體金墊、所述硝酸纖維素膜和所述吸樣墊均粘貼在PVC支撐板5上。

本實用新型制備方法包括以下步驟：

1、HCV融合抗原的制備

根據(jù)HCV檢測針對基因型分布的情況，采用不同基因型的基因片段或者幾種基因型基因片段的組合，但選用的氨基酸區(qū)段不同，我們對上述基因型區(qū)段進行篩選，確定了其中的核心表位區(qū)段。為了從含有HCV基因的質(zhì)粒上擴增出相應(yīng)的片段，設(shè)計引物分別擴增出HCVCore、NS3、NS4片段。再以pMD18T-Core質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得相應(yīng)酶切位點，最終經(jīng)雙酶切后插入到表達載體pET24a中。將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)受體菌中，經(jīng)37℃誘導(dǎo)后,所含目的基因的嵌合抗原獲得高效表達。

2、HCV單克隆抗體的制備

將HCV核心抗原50μg/只小鼠的量與福氏佐劑一起乳化，腹部表皮多點免疫BALB/C小鼠，每14天免疫加強一次。4次免疫后，取免疫小鼠的脾臟與瘤細胞按10：1融合，經(jīng)過多次克隆化篩選出與HCV重組核心抗原有強烈反應(yīng)并能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細胞。將其注射進小鼠腹腔，7天左右待小鼠腹部腫脹后處死小鼠并取出腹水，采用硫酸銨沉淀法來純化腹水，即可得到所需的單克隆抗體。

3、膠體金顆粒制備

采用氯金酸--枸椽酸三鈉還原法制備直徑為20～40nm的膠體金溶液：取990ml純化水到入圓底燒瓶中，加入10ml 1％的氯化金，220℃左右加熱煮沸，迅速加入20ml 1％枸椽酸三鈉水溶液，溶液出現(xiàn)酒紅色后，繼續(xù)煮沸10分鐘后停止加熱。這樣制備成直徑大小為20～40nm的膠體金溶液。

4、膠體金墊的制備

取一定體積顆粒大小為20～40nm的膠體金溶液，用0.1M K2CO3溶液將PH值調(diào)至8.0左右，然后用磁力攪拌器緩慢攪拌。

4.1HCV重組融合抗原標(biāo)記：按每100ml溶液慢慢加入1.5mgHCV重組融合抗原，繼續(xù)攪拌2小時，再滴加終濃度為0.1％的PEG2000和1％BSA進行封閉，20分鐘后11000r/min離心1小時，棄上清，沉淀用復(fù)溶液(含BSA、蔗糖、吐溫20的硼酸鹽緩沖液)復(fù)溶。

4.2HCV核心抗原單克隆抗體標(biāo)記：按每100ml溶液慢慢加入0.5mgHCV核心抗原單克隆抗體，攪拌30分鐘后，加入10％BSA繼續(xù)攪拌5分鐘，再加入10％的PEG2000，攪拌20分鐘，11000r/min離心1小時，棄上清，沉淀用復(fù)溶液(含BSA、蔗糖、吐溫20的硼酸鹽緩沖液)復(fù)溶。

4.3制備金墊：將上述用膠體金標(biāo)記好的HCV重組融合抗原與HCV核心抗原單克隆抗體按1：1混合混勻，按1ml溶液鋪22cm2的比例加在無防布上，在溫度20℃相對濕度小于30％的干燥間干燥2小時，制成膠體金墊。

5、包被

5.1抗HCV抗體包被：用1×PBS PH7.2～7.4將抗HCV抗體稀釋成2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜下部按1ul/cm進行劃線(C線)包被。

5.2HCV核心抗原單克隆抗體包被：用1×PBS PH7.2～7.4將HCV核心抗原單克隆抗體稀釋成2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜上部按1ul/cm進行劃線(T1線)包被。

5.3HCV重組融合抗原包被：用1×PBS PH7.2～7.4將鼠抗人IgG稀釋成1.5mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜中部按1ul/cm進行劃線(T2線)包被。

上述包被完畢，在溫度20℃相對濕度小于30％的干燥間干燥12小時，備用。

6、試劑盒組裝

將樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸樣墊按圖1所示，依次搭接粘貼在底板上，切成3mm寬的小條，制成試紙條，試紙條也可以裝在塑料卡中形成檢測卡。

7、檢測方法

將待測樣品平衡至室溫，把試紙條或試紙卡平放，在樣品墊上加入2～3滴待測樣品，若樣品中含有HCV核心抗原，則與樣品墊上的標(biāo)記HCV核心抗原單克隆抗體的膠體金結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴散到NC膜上進一步層析，遇到包被在NC膜上T1線處的HCV核心抗原單克隆抗體時，其復(fù)合物則又和包被的HCV核心抗原單克隆抗體結(jié)合，被捕獲在T1線處，當(dāng)捕獲的膠體金復(fù)合物達到一定量時，則形成一條肉眼可見的T1線；若待測樣品中不含有HCV核心抗原時，則不能形成相應(yīng)的復(fù)合物，也不能形成T1線。同樣當(dāng)待測樣品中含有HCV抗體時，則可在T2線處形成一條肉眼可見的T2線，反之，不能形成T2線。但若樣品中同時含有HCV核心抗原和HCV抗體時，則可形成兩條肉眼可見的T1線和T2線，而C線作為試劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，無論樣品中是否含有HCV核心抗原和HCV抗體，均會出現(xiàn)一條肉眼可見的C線。5～20分鐘用肉眼直接觀察結(jié)果，并判斷其檢測結(jié)果。

為了使本實用新型在使用中更為方便，所述試紙盒包括殼體12，所述殼體12內(nèi)設(shè)有卷軸15，所述殼體12上開設(shè)有出紙口，多個所述試紙條11順次連接且相連的兩個所述試紙條11之間設(shè)置有易撕刻痕，多個所述試紙條卷繞在所述卷軸15上，且所述試紙條可從出紙口伸出，所述出紙口的寬度為所述試紙條寬度的1.5～2倍。同時，每個所述試紙條的尾端設(shè)有一個定位孔14，所述殼體上凸設(shè)有一個定位柱13，所述定位孔14的直徑與所述定位柱13的直徑相等。

為了防止試紙條免受污染，每個所述試紙條的表面上均可移除的粘附有覆膜，所述覆膜自所述定位孔覆蓋至所述所述試紙條的頂端。

以上所述，僅為本實用新型的具體實施方式，但本實用新型的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本實用新型揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。因此，本實用新型的保護范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護范圍為準(zhǔn)。