本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)裝置領(lǐng)域，是基于流體力學(xué)和微流控芯片技術(shù)的用于觀察、檢測(cè)動(dòng)態(tài)濃度生化因子刺激下細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)裝置，具體為通過(guò)控制流量波形實(shí)時(shí)精準(zhǔn)控制微通道觀測(cè)點(diǎn)處生化刺激因子濃度的微流控芯片。

背景技術(shù)：

細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞的相互作用在近年來(lái)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。觀察、檢測(cè)細(xì)胞在動(dòng)態(tài)濃度的生化因子刺激下所產(chǎn)生的一系列變化是研究細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞相互作用的常用手段之一。微流控芯片以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)成為模擬細(xì)胞動(dòng)態(tài)微環(huán)境的理想實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，在細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有的研究多數(shù)是通過(guò)調(diào)節(jié)微通道入口的動(dòng)態(tài)生化因子濃度，經(jīng)過(guò)微通道流場(chǎng)傳輸后達(dá)到控制、改變觀測(cè)點(diǎn)處動(dòng)態(tài)濃度的目標(biāo)；然而，生化因子濃度波形在微流通道傳輸過(guò)程中不僅會(huì)發(fā)生衰減、濾波以及非線性幅頻調(diào)制現(xiàn)象，而且會(huì)產(chǎn)生波形延遲，造成入口輸入波形在觀測(cè)點(diǎn)處動(dòng)態(tài)濃度波形的失真和滯后，無(wú)法實(shí)現(xiàn)觀測(cè)點(diǎn)動(dòng)態(tài)濃度波形的實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)控制。因此，需要一種能夠?qū)崟r(shí)、精準(zhǔn)控制觀測(cè)點(diǎn)處生化因子動(dòng)態(tài)濃度波形的微流控芯片。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)流量法實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)地控制微流通道觀測(cè)點(diǎn)處動(dòng)態(tài)濃度波形的微流控芯片。通過(guò)流量法，單純的控制不同入口的流量即可實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)地控制不同感興趣觀測(cè)點(diǎn)處的濃度，且濃度變化與y型微流控裝置下端入口與上端入口的流量比間具有線性關(guān)系。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種通過(guò)流量法實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地控制觀測(cè)點(diǎn)生化因子動(dòng)態(tài)濃度波形的微流控芯片，其在結(jié)構(gòu)上可以分成兩部分，一是對(duì)傳統(tǒng)“圣誕樹(shù)”狀空間濃度梯度生成器改進(jìn)的裝置a，二是y型微流控裝置b，如圖1所示。其中，改進(jìn)的“圣誕樹(shù)”狀空間濃度梯度生成裝置的出口1-3與y型通道的入口2-1連接，y型通道的入口2-2通入無(wú)溶質(zhì)的緩沖液(即濃度為零)，這樣便可在y型主通道2-3內(nèi)形成上下兩層、空間上濃度存在梯度分布，即，上層為具有空間近似線性濃度梯度的溶液，下層是緩沖液，濃度恒為零。

本發(fā)明中，改進(jìn)的“圣誕樹(shù)”狀濃度梯度生成裝置是在傳統(tǒng)“圣誕樹(shù)”結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良設(shè)計(jì)的，旨在空間上形成線性的濃度梯度。傳統(tǒng)“圣誕樹(shù)”狀單調(diào)濃度梯度生成裝置，以七級(jí)九分叉的結(jié)構(gòu)為例(圖2)，其在空間上形成單調(diào)濃度梯度的原理如下：設(shè)入口1-1注入含有溶質(zhì)(如生化刺激物、熒光素等)的溶液，假定初始濃度φ01為1；入口1-2注入不含溶質(zhì)的溶劑(如pbs緩沖液等)，則初始濃度φ02為0。根據(jù)物質(zhì)守恒和濃度擴(kuò)散原理，在“圣誕樹(shù)”的第一級(jí)各分支處的濃度值為：

這樣，第二級(jí)各分支處濃度大小為：

以此類推，第三級(jí)各分支處濃度分別為φ31＝1、φ35＝0；……，第七級(jí)各分支處的濃度分別為φ71＝1、φ79＝0，即為最終形成的空間上單調(diào)的濃度梯度。

進(jìn)一步地，為了在空間上形成線性分布的濃度梯度，在傳統(tǒng)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上對(duì)“圣誕樹(shù)”狀結(jié)構(gòu)加以改進(jìn)。改進(jìn)的濃度梯度生成裝置與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別在于最后一級(jí)各分支通道的寬度，通道寬度不再保持一致。具體改進(jìn)方法如下：以歸一化空間距離xn作為橫坐標(biāo)，歸一化濃度φ作為縱坐標(biāo)，傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)中最后一級(jí)各分支通道的寬度相等，則對(duì)應(yīng)坐標(biāo)點(diǎn)分別為(0,1)、(1,0)(如圖3所示方形數(shù)據(jù)點(diǎn))；理想線性分布情況下，φ＝1-xn，則上述濃度對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)點(diǎn)為(0,1)、(1,0)；為了實(shí)現(xiàn)這種空間線性濃度梯度，將上述單調(diào)濃度數(shù)據(jù)坐標(biāo)點(diǎn)的橫坐標(biāo)與理想線性濃度坐標(biāo)點(diǎn)的橫坐標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析，得出能產(chǎn)生類線性分布的離散階梯數(shù)據(jù)，每階階梯的寬度由當(dāng)前數(shù)據(jù)點(diǎn)與前后兩點(diǎn)間的橫向距離決定，下面以某一數(shù)據(jù)點(diǎn)m為例進(jìn)行說(shuō)明：假設(shè)m點(diǎn)的坐標(biāo)為(mx,my)，其前后兩點(diǎn)l、n坐標(biāo)分別為(lx,ly)、(nx,ny)，此三個(gè)濃度值對(duì)應(yīng)的線性分布的數(shù)據(jù)點(diǎn)l’、m’、n’坐標(biāo)分別為(l′x,ly)、(m′x,my)、(n′x,ny)，則在階梯狀實(shí)現(xiàn)過(guò)程中，濃度值φ＝my對(duì)應(yīng)的臺(tái)階寬度為

以此方法，就可以計(jì)算出每階臺(tái)階的寬度，即可確定最后一級(jí)各分支通道的寬度比例關(guān)系。經(jīng)過(guò)計(jì)算，對(duì)于圖2所示的七級(jí)九分叉的“圣誕樹(shù)”狀結(jié)構(gòu)，其最后一級(jí)各分支通道的比例關(guān)系為1：8：28：56：70：56：28：8：1，以此確定歸一化距離與歸一化濃度間的關(guān)系如圖3所示。這樣，由于分子擴(kuò)散現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)一段距離的傳輸后，便會(huì)在縱向上形成線性的濃度梯度，最終得到了圖1所示改進(jìn)的“圣誕樹(shù)”狀空間線性濃度梯度生成裝置a。

另外，對(duì)于高度遠(yuǎn)小于寬度和長(zhǎng)度幾何尺寸、且?guī)缀纬叽缭谖⒚缀秃撩琢考?jí)的y型微通道內(nèi)的流體表現(xiàn)為層流特性，流體在y軸方向的運(yùn)動(dòng)和變化可以忽略，定常流或脈動(dòng)流條件下溶液在y型主通道2-3內(nèi)的流速均可用泊肅葉定律近似表達(dá)為：

其中p為壓強(qiáng)，μ為溶液粘度系數(shù)。對(duì)上式沿z軸方向積分，可得到單位寬度的流量q滿足：

在假設(shè)注入入口2-1的溶液1和入口2-2的溶液2的粘度系數(shù)近似相等的情況下，溶液1和溶液2在單位寬度上的流量相等，即：

其中q1和q2分別表示溶液1和溶液2的流量，w1和w2則分別表示溶液1和溶液1在y型主通道2-3內(nèi)所占的寬度。

由以上推導(dǎo)可知，在y型主通道2-3溶液1和溶液2的流場(chǎng)分界線與兩者的流量比有關(guān)，控制該流量比即可改變流場(chǎng)分界線的位置。也就是說(shuō)，保持濃度梯度生成裝置a的入口1-1和入口1-2的流量不變，即y型通道入口2-1的總流量不變，通過(guò)改變?nèi)肟?-2的流量便能夠控制上層濃度空間線性分布的溶液與下層濃度為零的緩沖液的分界線上下移動(dòng)。假定選擇的觀測(cè)點(diǎn)為y型主通道2-3中軸線上的一點(diǎn)(其他點(diǎn)亦可)，保持濃度梯度生成裝置a入口1-1的流量q1-1和入口1-2的流量q1-2均保持不變(亦可變化)，則其出口1-3的總流量不變，即流入y型通道上端入口2-1的流量q1不變，q1＝q1-1+q1-2。在這種條件下，通過(guò)改變y型通道下端入口2-2的流量q2即可控制分界線的縱向位置，進(jìn)而改變觀測(cè)點(diǎn)處濃度。當(dāng)y型通道下端入口2-2的流量大于或等于上端入口2-1的流量時(shí)，即q2≥q1，y型主通道2-3內(nèi)具有空間線性濃度梯度的上層溶液與濃度為零的下層溶液間的分界線位于主通道2-3中軸線(圖4點(diǎn)劃線)的上方或剛好處于此中軸線上，此時(shí)觀測(cè)點(diǎn)處的濃度為零；反之，分界線則位于中軸線的下方，即圖4所示情況，則觀測(cè)點(diǎn)的濃度將隨著流量q2的變化而變化。

當(dāng)q2<q1時(shí)，為計(jì)算觀測(cè)點(diǎn)處濃度與y型通道下端入口2-2流量q2間的數(shù)值關(guān)系，建立如圖4所示的平面直角坐標(biāo)系，原點(diǎn)位于y型主通道2-3內(nèi)上層溶液與下層溶液的分界線上，主通道2-3位于y∈[-w2,w1]的區(qū)間內(nèi)，則中軸線位于即觀測(cè)點(diǎn)的縱坐標(biāo)為主通道2-3內(nèi)縱向空間上的濃度分布情況如下：

因此，觀測(cè)點(diǎn)處的濃度即可求得：

即，當(dāng)q2<q1時(shí)，觀測(cè)點(diǎn)處的濃度φd與y型通道下端入口2-2的流量q2呈線性反比關(guān)系。

綜上，可得觀測(cè)點(diǎn)處的濃度大小φd與y型通道上端入口2-1的流量q1和下端入口2-2的流量q2間的關(guān)系如下：

由此，根據(jù)公式(8)，通過(guò)控制y型通道下端入口2-2的流量即可控制不同觀測(cè)點(diǎn)處的動(dòng)態(tài)濃度波形。

本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同觀測(cè)點(diǎn)處動(dòng)態(tài)濃度波形實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的控制，有效消除常規(guī)方法存在的時(shí)間延遲、幅值衰減、非線性幅頻調(diào)制等不足之處，可用于觀察、檢測(cè)不同動(dòng)態(tài)濃度生化因子刺激下的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。

附圖說(shuō)明

圖1是微流控芯片結(jié)構(gòu)圖。

圖2是傳統(tǒng)“圣誕樹(shù)”狀空間單調(diào)濃度梯度生成裝置示意圖。

圖3是七級(jí)九分叉的傳統(tǒng)與改進(jìn)的“圣誕樹(shù)”狀濃度梯度生成裝置產(chǎn)生的濃度梯度與理想線性濃度梯度對(duì)比圖。

圖4是y型主通道2-3內(nèi)溶液分層情況。

圖5是實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)示意圖。

圖6是在觀測(cè)點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的“w”字形動(dòng)態(tài)生化因子濃度波形。

圖中的具體標(biāo)注如下：

圖中：

a改進(jìn)的“圣誕樹(shù)”狀空間線性濃度梯度生成裝置；by型微流控裝置；

1-1含有某溶質(zhì)(如生化刺激物、熒光素等)的溶液入口；

1-2濃度為零的溶劑入口；1-3空間上具有類線性濃度梯度溶液匯合出口；

2-1空間上具有類線性濃度梯度溶液入口；2-2濃度為零的溶劑入口；

2-3主通道；

(i)可編程注射泵流動(dòng)控制系統(tǒng)；(ii)微流控芯片；

(iii)激光共聚焦或熒光顯微鏡；(iv)計(jì)算機(jī)顯示系統(tǒng)；(v)廢液回收處理。

i-1含有某溶質(zhì)(如生化刺激物、熒光溶液等)的溶液；

i-2濃度為零的溶劑；i-3濃度為零的溶劑。

具體實(shí)施方式

圖1所示為一種通過(guò)流量法實(shí)時(shí)精準(zhǔn)地控制觀測(cè)點(diǎn)處動(dòng)態(tài)濃度波形的微流控芯片結(jié)構(gòu)圖，主要由兩個(gè)部分結(jié)構(gòu)組成：改進(jìn)的“圣誕樹(shù)”狀空間線性濃度梯度生成裝置a和y型微流控裝置b，包括含有某溶質(zhì)(如生化刺激物、熒光溶液等)的溶液入口1-1，濃度為零的溶劑入口1-2，空間上具有類線性濃度梯度溶液出口1-3，空間上具有類線性濃度梯度溶液入口2-1，濃度為零的溶劑入口2-2和主通道2-3；其中，出口1-3與入口2-1連接。芯片所有通道結(jié)構(gòu)采用標(biāo)準(zhǔn)化的微加工方法，用pdms制作完成，并與潔凈玻璃片鍵合密封，構(gòu)成常見(jiàn)的玻璃-pdms芯片。

本實(shí)施例中，微流控芯片內(nèi)部的所有通道高度均為30μm，改進(jìn)的“圣誕樹(shù)”狀空間線性濃度梯度生成裝置a內(nèi)除最后一級(jí)分叉通道外，其余微通道寬度均為0.2mm，最后一級(jí)分叉通道根據(jù)上述計(jì)算結(jié)果1：8：28：56：70：56：28：8：1的比例進(jìn)行設(shè)置，最終匯合出口1-3的寬度為1.8mm；y型微流控裝置b中，入口2-1的寬度與匯合出口1-3保持一致，入口2-2寬為1.5mm，主通道長(zhǎng)為20mm，寬為3.6mm。

本實(shí)施例中，該微流控芯片與可編程注射泵、激光共聚焦(或熒光)顯微鏡、計(jì)算機(jī)構(gòu)成了完整的空間線性濃度生成、控制與檢測(cè)系統(tǒng)(圖5)。裝有熒光溶液的注射器i-1、裝有細(xì)胞緩沖液(濃度為零)的注射器i-2與i-3分別與芯片的入口1-1、入口1-2與入口2-2連接，并將所有注射器與可編程注射泵相連。通過(guò)注射泵控制三個(gè)入口的流量q1-1、q1-2和q2，本實(shí)施例中控制流量q1-1、q1-2保持不變，恒等于10μl/min；改變流量q2，使其按照?qǐng)D6所示的“m”字波形變化。然后，利用攝像機(jī)拍攝通道內(nèi)熒光強(qiáng)度情況，選定一感興趣的觀測(cè)點(diǎn)，本實(shí)施例中選取主通道中軸線上任意一點(diǎn)作為觀測(cè)點(diǎn)，采用圖形分析方法對(duì)其進(jìn)行灰度提取，用灰度數(shù)據(jù)表征熒光強(qiáng)度，即可得到觀測(cè)點(diǎn)處濃度隨時(shí)間變化情況，如圖6所示的“w”字形動(dòng)態(tài)生化因子濃度波形。本發(fā)明可根據(jù)研究需要，選擇不同的生化刺激因子，并且依照需要使流量隨時(shí)間發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)地控制感興趣觀測(cè)點(diǎn)處的動(dòng)態(tài)濃度波形，可用來(lái)觀察、檢測(cè)不同動(dòng)態(tài)濃度生化因子刺激下細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。